江蘇大學(xué)附屬?gòu)埣腋郯难筢t(yī)院神經(jīng)外科，江蘇 張家港 215600

中樞神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性顱內(nèi)惡性腫瘤，近年來發(fā)病率逐年遞增，年增長(zhǎng)率為1%～2%[1-3]。目前尚不明確膠質(zhì)瘤的病因，一般認(rèn)為高劑量電離輻射和特征性基因突變是主要的危險(xiǎn)因素。膠質(zhì)瘤最顯著的生物學(xué)特性是腫瘤細(xì)胞呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，難以完全切除，對(duì)化療耐藥，易于復(fù)發(fā)，并且約80%的復(fù)發(fā)病灶位于原發(fā)灶周圍2 cm范圍之內(nèi)，遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)較少見（1%～5%），但復(fù)發(fā)時(shí)往往伴隨生物學(xué)惡性進(jìn)展，由低級(jí)別膠質(zhì)瘤向高級(jí)別膠質(zhì)瘤轉(zhuǎn)化[4]，而高級(jí)別膠質(zhì)瘤5年生存率僅為13%[5]。以手術(shù)為主的綜合治療是當(dāng)前膠質(zhì)瘤治療的主流方案，即先行手術(shù)切除，再輔以術(shù)后放療和化療等綜合治療。

隨著分子生物學(xué)高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，目前發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤存在明顯的基因異質(zhì)性，是導(dǎo)致術(shù)后放療和化療療效存在差異的重要原因。因此，探尋膠質(zhì)瘤的分子生物學(xué)行為，尋找能夠早期診斷膠質(zhì)瘤及判斷其預(yù)后的分子生物學(xué)標(biāo)志物，對(duì)于設(shè)計(jì)膠質(zhì)瘤的治療靶點(diǎn)及策略、延長(zhǎng)膠質(zhì)瘤患者的生存時(shí)間、提高患者的生活質(zhì)量，均具有重要意義。

環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是一種含量豐富、保守、廣泛存在的非編碼RNA（noncoding RNA，ncRNA）。circRNA首尾連接成環(huán)狀，無5’帽和3’多聚腺苷酸尾，不易被核糖核酸酶（ribonuclease，RNase）降解，在體內(nèi)可以穩(wěn)定存在[6]。已有研究證實(shí)，circRNA參與多種疾病包括腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[7-10]。circRNA具有多種生物學(xué)功能，如作為微小RNA [microRNA，miRNA（miR）]與RNA結(jié)合蛋白的海綿，通過與轉(zhuǎn)錄因子相互作用調(diào)控基因表達(dá)。此外，circRNA還參與內(nèi)含子轉(zhuǎn)移以及RNA表觀遺傳學(xué)修飾[11]。因此，深入研究circRNA可以為疾病診斷提供新的生物學(xué)標(biāo)志物，為藥物研發(fā)和疾病治療提供新思路和新方向。

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，從不同的腫瘤（包括肝癌、結(jié)腸癌、宮頸癌等）中篩選出差異表達(dá)的circRNA，為后續(xù)的深入研究奠定了基礎(chǔ)。然而，有關(guān)circRNA在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其功能的研究還較少。本課題組的前期研究利用HTSeq測(cè)序平臺(tái)對(duì)6例成膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織和6例正常腦組織進(jìn)行circRNA測(cè)序，構(gòu)建了成膠質(zhì)細(xì)胞瘤circRNA表達(dá)譜，并發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0133159（circRNA-PTPRZ1）在膠質(zhì)瘤中顯著高表達(dá)[P＜0.001，錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）＝0.005]。圖1所示為hsa_circ_0133159在基因組和基因PTPRZ1上的定位及成環(huán)信息。

本研究旨在38例不同級(jí)別膠質(zhì)瘤組織和10例正常腦組織中驗(yàn)證hsa_circ_0133159的表達(dá)水平，并分析其與膠質(zhì)瘤患者臨床病理特征的相關(guān)性，評(píng)估hsa_circ_0133159作為生物學(xué)標(biāo)志物在膠質(zhì)瘤診斷和預(yù)后判斷中的臨床價(jià)值。

圖1 hsa_circ_0133159在基因組和基因PTPRZ1上的定位及成環(huán)信息

1 資料與方法

1.1 病例納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

病例納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）術(shù)后病理明確診斷為膠質(zhì)瘤；（2）術(shù)前未接受過放療、化療和細(xì)胞免疫治療。病例排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）轉(zhuǎn)移性腦膠質(zhì)瘤；（2）全身感染；（3）同時(shí)患有其他腫瘤。

1.2 研究對(duì)象

研究對(duì)象為2008年12月—2017年3月接受住院手術(shù)的38例膠質(zhì)瘤患者，收集術(shù)后膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本。另選擇10例同期住院接受腦出血或腦外傷開顱內(nèi)減壓手術(shù)的患者，收集術(shù)后正常腦組織標(biāo)本。

本研究獲得本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，并取得患者或其家屬的書面知情同意。

1.3 hsa_circ_0133159表達(dá)的檢測(cè)

1.3.1 主要試劑與儀器

TRIzol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，PrimeScriptTMRT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒和One Step SYBR?PrimeScript? RT-PCR Kit Ⅱ購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。NanoDrop ND-2000/2000C超微量核酸蛋白測(cè)定儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，StepOnePlus?實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀購(gòu)自美國(guó)Life Tech公司。

1.3.2 組織標(biāo)本處理與RNA提取

手術(shù)過程中，由同一名主刀醫(yī)師切取腦膠質(zhì)瘤或正常腦組織，組織標(biāo)本大小為0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗凈標(biāo)本表面血漬，并于15 min內(nèi)登記編號(hào)，置于－80 ℃深低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR（quantitative reverse transcription-PCR，qRT-PCR）檢測(cè)hsa_circ_0133159的相對(duì)表達(dá)量

應(yīng)用TRIzol法提取組織標(biāo)本中的總RNA，NanoDrop ND-2000/2000C超微量核酸蛋白測(cè)定儀定量測(cè)定RNA。使用StepOnePlus?實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)hsa_circ_0133159在膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織中的表達(dá)。hsa_circ_0133159特異性引物由上海華津生物科技有限公司合成，上游引物序列為ATGCTGATGGACTACTTACAAAAC，下游引物序列為AACTCCTCCGCTGACACG。以GAPDH的表達(dá)量作為內(nèi)參照，上游引物序列為AGGGCTGCTTTTAACTCTGGT，下游引物序列為CCCCACTTGATTTTGGAGGGA。擴(kuò)增條件：預(yù)變性95 ℃ 5 min；變性95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。應(yīng)用2－ΔΔCt法計(jì)算hsa_circ_0133159相對(duì)表達(dá)量。

1.4 資料收集

從本院醫(yī)療信息系統(tǒng)中收集所有患者的臨床病理資料和影像學(xué)資料。

1.5 隨訪和生存分析

對(duì)所有患者進(jìn)行隨訪，無失訪病例。術(shù)后6個(gè)月內(nèi)，每3個(gè)月隨訪1次；此后，每6個(gè)月隨訪1次。隨訪截止日期為2017年10月30日。隨訪時(shí)復(fù)查血常規(guī)和肝腎功能，進(jìn)行增強(qiáng)磁共振成像檢查。隨訪過程中若再次出現(xiàn)頭痛、失語和肢體活動(dòng)障礙等神經(jīng)功能損傷的臨床癥狀，且影像學(xué)證實(shí)為腫瘤進(jìn)展，則診斷為腫瘤復(fù)發(fā)。影像學(xué)上的腫瘤進(jìn)展根據(jù)Macdonald標(biāo)準(zhǔn)判定，即增強(qiáng)磁共振成像顯示腫瘤強(qiáng)化影的2大垂直直徑的乘積較之前增加超過25%，或者出現(xiàn)新的腫瘤病灶。以腫瘤復(fù)發(fā)或任何原因所致的死亡為觀察終點(diǎn)。無進(jìn)展生存（progression-free survival，PFS）時(shí)間的定義為自患者手術(shù)之日起至腫瘤復(fù)發(fā)或任何原因所致死亡的時(shí)間間隔?？偵妫╫verall survival，OS）時(shí)間的定義為自患者手術(shù)之日起至任何原因所致死亡的時(shí)間或隨訪截止日。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 23.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。hsa_circ_0133159的相對(duì)表達(dá)量以表示。hsa_circ_0133159相對(duì)表達(dá)量與臨床病理特征的關(guān)系采用單因素方差分析。應(yīng)用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評(píng)價(jià)hsa_circ_0133159診斷膠質(zhì)瘤的臨床價(jià)值。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，logrank法進(jìn)行預(yù)后的單因素分析，檢驗(yàn)的因素包括年齡、性別、術(shù)前Karnofsky能力狀態(tài)（Karnofsky Performance Status，KPS）評(píng)分、腫瘤病灶數(shù)、腫瘤病理分級(jí)、腫瘤復(fù)發(fā)、hsa_circ_0133159相對(duì)表達(dá)量，COX回歸分析進(jìn)行預(yù)后的多因素分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況

正常腦組織組10例，其中男性6例，女性4例；平均年齡為50.87±3.28歲。膠質(zhì)瘤組織組38例，其中男性20例，女性18例；平均年齡為52.18±2.92歲；根據(jù)世界衛(wèi)生組織膠質(zhì)瘤分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[12]，低級(jí)別（Ⅰ～Ⅱ級(jí)）膠質(zhì)瘤10例，高級(jí)別（Ⅲ～Ⅳ級(jí)）膠質(zhì)瘤28例。2組患者的年齡和性別差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 hsa_circ_0133159在膠質(zhì)瘤組織中高表達(dá)

與正常腦組織相比，hsa_circ_0133159在低級(jí)別膠質(zhì)瘤和高級(jí)別膠質(zhì)瘤組織中的相對(duì)表達(dá)量均顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（3.22±0.94vs8.58±1.92，P＝0.026；3.22±0.94vs23.46±4.18，P＝0.007），見圖2。

hsa_circ_0133159相對(duì)表達(dá)量與膠質(zhì)瘤患者的年齡、性別、術(shù)前KPS評(píng)分和腫瘤病灶數(shù)均無顯著相關(guān)性（P＞0.05，表1），而與腫瘤病理分級(jí)（P＝0.040）、腫瘤是否復(fù)發(fā)（P＝0.005）和患者是否死亡（P＝0.004）顯著相關(guān)。

圖2 hsa_circ_0133159在正常腦組織、低級(jí)別膠質(zhì)瘤組織和高級(jí)別膠質(zhì)瘤組織中的相對(duì)表達(dá)量

表1 hsa_circ_0133159相對(duì)表達(dá)量與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 hsa_circ_0133159診斷膠質(zhì)瘤的臨床價(jià)值

使用ROC曲線評(píng)價(jià)hsa_circ_0133159診斷膠質(zhì)瘤的臨床價(jià)值（圖3），曲線下面積（area under curve，AUC）為0.887（P＜0.010），靈敏度為86.8%，特異度為80.0%，截?cái)嘀担╟ut-off value）為4.32。根據(jù)截?cái)嘀担瑢?8例膠質(zhì)瘤患者分為hsa_circ_0133159低表達(dá)組（≤4.32，17例）和hsa_circ_0133159高表達(dá)組（＞4.32，21例）。

2.4 生存分析結(jié)果

平均隨訪時(shí)間為22.45±2.98個(gè)月（范圍：1～104個(gè)月）。與hsa_circ_0133159高表達(dá)組相比，hsa_circ_0133159低表達(dá)組PFS時(shí)間和OS時(shí)間均明顯延長(zhǎng)（中位PFS時(shí)間：3.49vs17.53個(gè)月；中位生存時(shí)間：5.89vs23.28個(gè)月），見圖4。

2.5 膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的單因素分析

單因素分析顯示，高KPS評(píng)分、單腫瘤病灶、低級(jí)別膠質(zhì)瘤、無腫瘤復(fù)發(fā)和hsa_circ_0133159低表達(dá)膠質(zhì)瘤患者的PFS和OS優(yōu)于低KPS評(píng)分、多腫瘤病灶、高級(jí)別膠質(zhì)瘤、腫瘤復(fù)發(fā)和hsa_circ_0133159高表達(dá)的膠質(zhì)瘤患者（P＜0.05，表2）；而年齡和性別與膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后無明顯相關(guān)性（P＞0.05，表2）。

2.6 膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的多因素分析

多因素分析發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0133159相對(duì)表達(dá)量是膠質(zhì)瘤患者的獨(dú)立預(yù)后因素[PFS：相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)度＝1.268（95%置信區(qū)間：1.007～3.459），P＝0.001；OS：相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)度＝1.252（95%置信區(qū)間：1.103～2.422），P＝0.001]（表3）。

圖3 hsa_circ_0133159診斷膠質(zhì)瘤的臨床價(jià)值

圖4 hsa_circ_0133159相對(duì)表達(dá)量與膠質(zhì)瘤患者總生存時(shí)間（A）和無進(jìn)展生存時(shí)間（B）的關(guān)系

表2 膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的單因素分析

表3 膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的多因素分析

3 討 論

早在1970年，HSU和COCA-PRADOS[13]就在真核生物細(xì)胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了circRNA。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)了越來越多在疾病中差異表達(dá)的circRNA，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的circRNA與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。由于circRNA首尾連接成環(huán)狀，不易被RNase所降解，并且在物種之間具有高度保守性，為其作為疾病診斷的生物學(xué)標(biāo)志物奠定了基礎(chǔ)。LI等[14]發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_002059在胃癌中顯著低表達(dá)，可以作為胃癌診斷的生物學(xué)標(biāo)志物（靈敏度為0.81，特異度為0.62）。WENG等[15]發(fā)現(xiàn)，ciRS-7在結(jié)直腸癌中的表達(dá)量顯著增加，并可通過抑制miR-7表達(dá)激活下游原癌基因表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）和RAF1，促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展，因此可以作為結(jié)直腸癌預(yù)后評(píng)估的生物學(xué)標(biāo)志物以及潛在的治療靶點(diǎn)。同時(shí)，在肝癌、乳腺癌和肺癌中均篩選得到特異性表達(dá)的circRNA，可作為診斷和預(yù)后評(píng)估的生物學(xué)標(biāo)志物[16-18]。

為了明確circRNA在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)譜以及circRNA在膠質(zhì)瘤分子生物學(xué)行為中的調(diào)控作用，本課題組利用HTSeq測(cè)序平臺(tái)對(duì)circRNA進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0133159在膠質(zhì)瘤組織中顯著高表達(dá)。ROC曲線分析結(jié)果顯示，hsa_circ_0133159相對(duì)表達(dá)量對(duì)膠質(zhì)瘤具有良好的診斷價(jià)值（AUC＝0.887，靈敏度為86.8%，特異度為80.0%）。進(jìn)一步分析hsa_circ_0133159相對(duì)表達(dá)量與年齡、性別、術(shù)前KPS評(píng)分、腫瘤病灶數(shù)、腫瘤病理分級(jí)、腫瘤復(fù)發(fā)和生存情況之間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高級(jí)別膠質(zhì)瘤、腫瘤復(fù)發(fā)和死亡患者的hsa_circ_0133159相對(duì)表達(dá)量明顯升高。hsa_circ_0133159低表達(dá)患者的PFS和OS均顯著優(yōu)于高表達(dá)者。ZHU等[19]研究發(fā)現(xiàn)，circRNA-circBRAF與膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后顯著相關(guān)。由此提示，hsa_circ_0133159可能作為膠質(zhì)瘤診斷和預(yù)后評(píng)估的生物學(xué)標(biāo)志物。

hsa_circ_0133159由PTPRZ1基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)，PTPRZ1在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中顯著高表達(dá)，并且與患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)，同時(shí)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞分泌物可以通過PTPRZ1信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)[20]。hsa_circ_0133159可能通過影響宿主基因的表達(dá)，進(jìn)一步影響患者的預(yù)后。同時(shí)，本課題組前期研究通過對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0133159表達(dá)與PAK1、TUBB4A、STX1A、GLS2和GNG13基因表達(dá)顯著相關(guān)，因此hsa_circ_0133159也可能通過影響上述基因的表達(dá)，調(diào)控腫瘤的生長(zhǎng)。今后，有必要進(jìn)一步開展體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)以研究hsa_circ_0133159影響腫瘤生長(zhǎng)的具體機(jī)制。鑒于本研究樣本量較小，因此還需要擴(kuò)大樣本量或開展大規(guī)模、多中心研究以進(jìn)一步驗(yàn)證本研究的發(fā)現(xiàn)。

綜上所述，hsa_circ_0133159可能作為一種新型的生物學(xué)標(biāo)志物用于膠質(zhì)瘤患者的鑒別診斷和預(yù)后評(píng)估。

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