顧啟濱， 鄧立明,*， 鐘誠

骨肉瘤是常見的原發(fā)骨惡性腫瘤，在中國每年發(fā)病率約為3／100萬，預(yù)后較差，多發(fā)生在10～20歲青少年，死亡率較高，給社會和家庭帶來了嚴重的經(jīng)濟及生活負擔［1］。目前傳統(tǒng)的治療方法存在很多缺陷，如不良反應(yīng)嚴重及容易復(fù)發(fā)等。牛蒡子苷元是我國傳統(tǒng)中藥牛蒡子果實中提取分離而來的木脂素類化合物，在臨床研究中具有悠久的歷史，除了作為傳統(tǒng)中藥治療風熱感冒、癰腫瘡毒等［2］，牛蒡子苷元還具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤等多重功效［3－4］。已證實牛蒡子苷元可通過介導(dǎo)乳腺癌MDA－MB－231細胞的凋亡來抑制腫瘤細胞的生長，通過觸發(fā)線粒體凋亡途徑導(dǎo)致Bax相關(guān)蛋白的上調(diào)和Bcl－2相關(guān)蛋白表達水平的下調(diào)，促進細胞凋亡信號的產(chǎn)生，從而誘導(dǎo)細胞凋亡［5］。同時牛蒡子苷元能夠抑制結(jié)腸癌CT26細胞血管生成，能夠降低VEGFR－2的基因水平［6］。牛蒡子苷元對人骨肉瘤細胞系MG－63的增殖及凋亡作用尚未見報道，本研究探討不同濃度的牛蒡子苷元對骨肉瘤細胞MG－63增殖及凋亡作用的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人骨肉瘤細胞系MG－63購自美國模式培養(yǎng)物集存庫（ATCC），于本研究室液氮中保存；RPMI－1640培養(yǎng)基購買自Hyclone公司 （美國）；胰蛋白酶 （Trypsin），青霉素＆鏈霉素（Penicillin－Streptomycin， P.S.） 及胎牛血清 （FBS） 購買自 Gibco公司 （美國）；二甲基亞砜 （DMSO），DEPC水購買自索萊寶公司 （北京）；甲醛、丙二醇、無水乙醇、氯仿、異丙醇購自廣州化學試劑廠 （廣州）；Prime Script RT reagent Kit－RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，SYBR Premix Ex Taq熒光定量PCR試劑盒購自TAKARA公司 （日本）；牛蒡子苷元購于上海晶都生物技術(shù)有限公司；PEG400購于上海生物工程股份有限公司；Annexin V－FITC細胞凋亡檢測試劑盒、 Cell Counting Kit－8 （CCK－8試劑盒）均購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；RNA提取試劑盒購于北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 牛蒡子苷元配制 稱取適量的牛蒡子苷元溶于DMSO中，充分溶解后配置成1 mg／mL濃度的母液，將母液用50 mM醋酸鈉溶液分別稀釋成為 3 個工作濃度 （10 μg／mL、 50 μg／mL、100 μg／mL）， 溶液中包括 40%PEG400， 調(diào)節(jié) pH 值至 5.0， 過濾除菌后－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 人骨肉瘤細胞MG－63的培養(yǎng) 將人骨肉瘤細胞系MG－63用含 10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基 （含 100 μg／mL青霉素、100 μg／mL鏈霉素）于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)基中培養(yǎng)，細胞融合度達到70%～80%時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.4 細胞增殖分析 細胞增殖的分析按照CCK－8試劑盒說明進行操作試驗。取對數(shù)生長期的MG－63細胞，在96孔板中每孔加入100微升2 000個細胞，分別加入10 μL配置好的不同濃度的牛蒡子苷元溶液，藥物對照為含DMSO的緩沖液，再加入10 μL CCK－8溶液，空白對照為加入100 μL細胞培養(yǎng)液，實驗做三個重復(fù)。于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分別在0 h、12 h、24 h、48 h、72 h時加入CCK8試劑，孵育1 h后酶標儀測定450 nm吸光值，進行結(jié)果統(tǒng)計分析。

1.5 流式檢測MG－63細胞凋亡 取對數(shù)期生長的MG－63細胞，按照1×105／mL鋪于48孔板，過夜生長后加入不同濃度（10 μg／mL、 50 μg／mL、 100 μg／mL） 牛蒡子苷元， 對照為牛蒡子苷元配置緩沖液，實驗做三個重復(fù)。細胞用藥物刺激24 h后，把細胞培養(yǎng)液吸出至一合適離心管內(nèi)，PBS洗滌貼壁細胞一次，加入適量胰酶細胞消化液 （不含EDTA）消化細胞。加入 5 μL Annexin V－FITC， 輕輕混勻。 加入 10 μL碘化丙啶染色液，混勻后待測。室溫 （20℃～25℃）避光孵育10～20分鐘，隨后置于冰浴中，用流式細胞儀檢測分析細胞凋亡情況。

1.6 熒光定量PCR檢測相關(guān)基因表達 對基因Bax（引物Forward： CCCGAGAGGTCTTTTTCCGAG； Reverse： CCAGCCCAT GATGGTTCTGAT）、 Bcl－2 （引物 Forward： GGTGGGGTCATGTGTGTGG； Reverse： CGGTTCAGGTACTCAGTCATCC） 和 VEG FR－2 （引物 Forward： GGCCCAATAATCAGAGTGGCA； Reverse：CCAGTGTCATTTCCGATCACTTT）進行熒光定量PCR檢測。收集藥物處理24 h后的MG－63細胞，用RNA提取試劑盒提取細胞RNA。RNA反轉(zhuǎn)錄采用Prime Script反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行。在4℃環(huán)境或者冰上，向RNase－Free的 8連管 （Axygen，200 μL容量） 中加入 2 μL 5× Prime Script Buffer， 0.5 μL RT Enzyme Mix， 0.5 μL Oligo dT Primer （50 μM）， 0.5 μL Random 6 mers（100 μM）， RNA 500 ng， RNase－Free H2O 調(diào)整至 10 μL， 混勻后離心。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：37℃15分鐘 （反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)），85℃5秒 （反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng)）。實時熒光定量PCR反應(yīng)采用SYBR Premix Ex Taq試劑盒 （Takara公司）進行。在冰上或4℃操作環(huán)境下配制20 μL PCR反應(yīng)液：10 μL SYBR Premix Ex Taq （2× ）， 0.4 μL Forward Primer （10 μM） ， 0.4 μL Reverse Primer （10 μM）， 2 μL DNA 模板 （100 ng）， 7.2 μL ddH2O。 混勻，離心后，用Bio－Rad CFX96熒光定量PCR儀中進行反應(yīng)，反應(yīng)選用兩步法程序，退火溫度60℃?；虻谋磉_差異通過分析實驗組、對照組的目的基因和管家基因，經(jīng)2－△△CT方法進行比較；每個樣本的每個基因均做三個重復(fù)，取平均值進行最后的統(tǒng)計學分析。

1.7 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學分析。采用兩因素的方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 牛蒡子苷元對骨肉瘤細胞MG－63增殖的影響 實驗在細胞水平檢測了不同濃度牛蒡子苷元對人骨肉瘤細胞MG－63增殖的影響 （圖1），隨著細胞生長時間的延長，MG－63細胞處于增殖狀態(tài)。而與對照相比較發(fā)現(xiàn)，牛蒡子苷元對細胞MG－63增殖具有明顯的抑制作用，并且隨著藥物劑量的增加，其抑制效率更加明顯。

圖1 牛蒡子苷元對骨肉瘤細胞MG－63增殖的影響

2.2 牛蒡子苷元對骨肉瘤細胞MG－63凋亡的影響 用不同濃度的牛蒡子苷元處理骨肉瘤細胞MG－63，用流式細胞儀檢測其對細胞凋亡的影響 （圖2），從結(jié)果中發(fā)現(xiàn)隨著牛蒡子苷元濃度的增加，凋亡的MG－63細胞明顯增加。該結(jié)果提示牛蒡子苷元對骨肉瘤細胞MG－63細胞增殖的影響可能與其凋亡有關(guān)。從圖中看出在對照組中發(fā)生凋亡的細胞占總細胞數(shù)的1.88%；在 1 μg／mL 藥物濃度下， 凋亡細胞上升至 8.83%； 在 5 μg／mL藥物濃度下，凋亡細胞上升至15.9%；在 10 μg／mL藥物濃度下，凋亡細胞上升至36.0%。藥物處理組與對照相比較凋亡細胞百分比具有顯著差異。

圖2 流式檢測牛蒡子苷元對骨肉瘤細胞MG－63凋亡的影響

2.3 熒光定量PCR檢測牛蒡子苷元對相關(guān)基因表達的影響 進一步對不同濃度牛蒡子苷元處理過的MG－63細胞提取其RNA，反轉(zhuǎn)錄后對Bcl－2、Bax、VEGFR－2基因進行熒光定量PCR檢測 （圖3）。隨著牛蒡子苷元濃度的增加，基因Bcl－2的表達水平呈下降趨勢，Bcl－2具有抑制細胞凋亡的作用，這提示著牛蒡子苷元能夠下調(diào)Bcl－2基因的表達，從而促進MG－63細胞的凋亡。同時檢測了促凋亡基因Bax的表達水平，結(jié)果顯示隨著藥物濃度的增加，其Bax的表達水平明顯上升，這提示著藥物能夠增加對細胞凋亡的影響。血管內(nèi)皮細胞生長因子受體2（VEGFR－2）能夠促進血管的生成，隨著牛蒡子苷元濃度的增加，VEGFR-2基因的表達下降，提示藥物具有抑制骨肉瘤細胞MG－63血管生成的作用。

圖3 熒光定量PCR檢測牛蒡子苷元對Bcl－2、Bax和VEGFR－2基因表達的影響

3 討論

天然藥物作為抗腫瘤藥物研發(fā)的重要來源被廣大學者廣泛關(guān)注。天然抗腫瘤藥物具有其特有的治療機制，同時臨床效果明顯、毒副作用弱，已經(jīng)被越來越多的研究證明。目前臨床使用量已占到腫瘤治療藥物的3／4。隨著近年來對牛蒡子苷元的研究及廣泛的臨床前研究，發(fā)現(xiàn)牛蒡子苷元具有廣泛的藥理活性，不僅具有調(diào)控炎性因子的表達和免疫調(diào)節(jié)的作用，還具有抑制多種腫瘤的作用， 如乳腺癌［6］、 肺癌［7］、 膀胱癌［8］、 結(jié)腸癌等［9］。其作用機制主要集中在阻止細胞周期G0／G1期，或在G2／M期抑制腫瘤細胞的增殖；然而牛蒡子苷元在骨肉瘤中的作用及機制尚未有研究報道。

本研究結(jié)果顯示，在沒有藥物干預(yù)的情況下MG－63細胞一直處于增殖狀態(tài)。經(jīng)過牛蒡子苷元處理后，其增殖會受到明顯抑制，并且隨著藥物劑量的增加，其抑制效率更加明顯。采用流式細胞術(shù)檢測不同濃度的牛蒡子苷元處理后骨肉瘤細胞MG－63的凋亡情況 （圖2），結(jié)果也證實隨著牛蒡子苷元濃度的增加，凋亡的MG－63細胞明顯增加。上述結(jié)果提示牛蒡子苷元對骨肉瘤細胞MG－63細胞增殖的影響可能與其凋亡有關(guān)。進一步的統(tǒng)計學處理也表明藥物處理組與對照相比較凋亡細胞百分比具有顯著差異。為了探討牛蒡子苷元殺傷MG－63細胞的機制，本研究對不同濃度牛蒡子苷元處理過的MG－63細胞提取其RNA，反轉(zhuǎn)錄后對Bcl－2、Bax、VEGFR－2基因進行熒光定量PCR檢測 （圖3）。在細胞凋亡過程中，Bcl－2家族成員起著至關(guān)重要的作用。Bcl－2是細胞死亡的負調(diào)因子，在許多類型的細胞受到外界刺激時能保護細胞免于凋亡。隨著牛蒡子苷元濃度的增加，Bcl－2基因的表達水平呈下降趨勢，Bcl－2具有抑制細胞凋亡的作用，這提示牛蒡子苷元能夠下調(diào)Bcl－2基因的表達，從而促進MG－63細胞的凋亡。Bax是Bcl－2同源相關(guān)蛋白，Bax的過度表達可拮抗Bcl－2的保護效應(yīng)而使細胞趨于死亡。本研究結(jié)果也顯示隨著藥物濃度的增加，Bax的表達水平明顯上升，這提示著藥物能夠增加對細胞凋亡的影響。

血管內(nèi)皮細胞生長因子受體2（VEGFR－2）能夠促進血管的生成，在促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要的作用。隨著牛蒡子苷元濃度的增加，VEGFR－2基因的表達下降，提示藥物具有抑制骨肉瘤細胞MG－63血管生成的作用。

本研究結(jié)果表明，牛蒡子苷元能夠抑制MG－63細胞的增殖，同時能夠使其發(fā)生細胞凋亡。在基因水平檢測細胞凋亡相關(guān)的基因發(fā)現(xiàn)，牛蒡子苷元也能夠降低凋亡抑制基因Bcl－2的表達水平，提高促凋亡基因Bax的表達水平，而且對血管生長因子受體VEGFR－2基因的表達也有抑制作用。這些結(jié)果都表明，在細胞水平牛蒡子苷元具有抗骨肉瘤細胞MG－63的作用。本研究為體外試驗，牛蒡子苷元抗骨肉瘤的生物活性還需建立體內(nèi)試驗進行進一步的驗證，其藥物作用的精確靶點及其作用機制還需要深入研究，為牛蒡子苷元進一步的改構(gòu)及臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

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