(沈陽理工大學,遼寧沈陽 110159)

葉酸(folic acid)又稱VB9,是一種重要的B族維生素,是維持人體正常物質代謝和某些特殊生理功能不可缺少的一類低分子有機化合物,在人體生長、代謝、發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用[1-3]。運動飲品是根據(jù)人體運動的生理消耗而配制的,主要含有碳水化合物、電解質、維生素和氨基酸等營養(yǎng)成分。人體飲用運動飲品后能合理補充所需的營養(yǎng)成分,平衡新陳代謝,提高機體的抗疲勞能力4-5]。國標GB 15266-2009《運動飲料》中[6],僅針對維生素C、硫胺素和核黃素這3種維生素作出了限量要求,并未對葉酸含量作出限量要求,但是針對特殊人群的飲品,有必要了解其葉酸的含量,以便保障人們科學、定量地攝入此種維生素。

國內外文獻中檢測葉酸的方法有紫外分光光度法、熒光法、液相色譜法、氣質聯(lián)用和高效液相色譜質譜聯(lián)用等[7-13]。國標方法中,GB/T 5009.211-2008《食品中葉酸的測定》和GB 5413.16-2010《嬰幼兒配方食品和乳品中葉酸(葉酸鹽活性)測定》中對食品、嬰兒食品和乳制品中葉酸的測定采用微生物法[14-15],此方法周期長、步驟繁瑣、重復性差,影響因素多。本研究利用質譜的多反應監(jiān)測模式的選擇性和特異性,結合運動飲品的基質成分相對簡單的特點,簡化了樣品的前處理過程,建立一種超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定運動飲品中葉酸的方法,靈敏度高、線性范圍寬,極大地提高了檢測效率,推廣可行性較高,為運動飲品中葉酸含量的測定提供技術支持和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

標準品葉酸 美國Sigma公司;乙腈、甲醇 色譜純,美國Fisher Scientific公司;甲醇、乙醇、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅 分析純,國藥集團化學試劑有限公司;超純水 由Mmi-Q Advantage A10超純水機制得。

超高效液相色譜儀 美國安捷倫公司;四極桿串聯(lián)質譜儀 美國AB公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 超高效液相色譜條件的優(yōu)化 本實驗先對色譜條件中的色譜柱及流動相進行優(yōu)化。色譜柱比較了C18(2.1 mm×150 mm,3 μm)和T3(2.1 mm×150 mm,3 μm)這2種常用的色譜柱[16-18];對甲醇(A)-水(B)、甲醇(A)-0.1%甲酸水溶液(B)以及10%甲醇水溶液(A)-0.1%甲酸水溶液(B)3種流動相進行優(yōu)化選擇,流動相梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program of mobile phase

1.2.2 質譜檢測器參數(shù)的優(yōu)化 采用針泵連續(xù)進樣的方式,在正離子模式(ESI+)下,對濃度為100 ng/mL的葉酸的標準溶液進行母離子全掃描,確定其分子離子,優(yōu)化母離子的錐孔電壓。再在上述母離子的基礎上,對其子離子進行全掃描,選擇兩組豐度最高的離子,較高的作為定量離子,次之的為定性離子,并對噴霧電壓、離子源溫度、碰撞氣、掃描停滯時間、去簇電壓及碰撞電壓等參數(shù)進行優(yōu)化。

1.2.3 標準曲線的配制 稱取一定量的葉酸標準品,配制成濃度為2.0、10.0、20.0、50.0、100.0 ng/mL的系列標準溶液,現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.4 樣品前處理條件的優(yōu)化 運動飲品若直接上樣測定其中的葉酸含量,樣品中的干擾成分太多會影響測定結果,故要對運動飲品中的一些干擾基質進行沉淀以達到凈化的效果。在對葉酸目標物提取的過程中,目標成分為水溶性維生素,容易在提取過程中被破壞或被樣品中沉淀物所吸附[19],本實驗參考相關文獻[20-23],結合葉酸是水溶性物質的特性以及樣品為運動飲品的特性,本實驗結合葉酸成分的化學性質以及運動飲品的特性,比較了亞鐵氰化鉀溶液(106 g/L)+乙酸鋅溶液(219 g/L)混合液、10%甲醇、10%乙醇、10%乙腈等4種提取液對目標物的提取效果。分別稱取10 g的運動飲料,加入10 mL提取溶液,用去離子水定容至50 mL,劇烈震搖1 min,以5000 r/min的速度離心5 min,取上清液過0.45 μm濾膜后進行上機檢測。

1.2.5 加標回收及與國標方法對比實驗 以已知目標成分含量的運動飲品為基質,加入葉酸標準溶液,選擇優(yōu)化后的條件上機檢測,并與現(xiàn)有國標方法(GB/T 5009.211-2008)的測定結果對比,檢驗其方法的有效性。

2 結果與討論

2.1 色譜柱及流動相的選擇

食品中葉酸的檢測比較常用的色譜柱有C18柱和T3柱,葉酸在反相C18柱上的保留能力較弱,目標物總離子流圖的分析效果不理想;但是在T3柱上保留效果較好,原因是由于以離子形態(tài)存在的葉酸組分能與T3柱上基團的離子鍵形成氫鍵,這種結合力比C18反相柱上的分子間作用力更強,在分離時更具有優(yōu)勢,目標物的分離效果更好,所以本實驗選擇T3柱作為葉酸的分析色譜柱。

在選擇T3柱作為葉酸分析色譜柱的前提下,參考相關文獻[24-28],考察甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水以及10%甲醇-0.1%甲酸3種流動相對葉酸分析結果的影響。結果發(fā)現(xiàn),10%甲醇-0.1%甲酸作為流動相時,葉酸的分離效果最好,分離度高,峰形尖銳,基線穩(wěn)定。

2.2 質譜檢測器參數(shù)的優(yōu)化

優(yōu)化后的質譜參數(shù)為:噴霧電壓4000 V、離子源溫度400 ℃、氮氣流量20 L/min、掃描停滯時間50 ms,其他質譜參數(shù)見表2。

表2 葉酸的多反應監(jiān)測掃描模式的質譜參數(shù)Table 2 Mass spectrometric parameters of a multi reaction monitoring scan for folic acid

注：“*”定量離子(Quantitative ion)。

依照表2所設定的質譜條件,以及超高效液相色譜的條件,選擇多反應監(jiān)測模式(MRM)進行檢測,葉酸與其他成分能在5 min內快速分離,葉酸的MRM圖如圖1所示,子離子掃描圖如圖2所示。

圖1 葉酸的MRM圖Fig.1 MRM chromatogram of folic acid

表3 葉酸的保留時間、標準曲線、相關系數(shù)、檢出限與定量限Table 3 Retention time,standard curve,correlation coefficient,detection limit and quantitative limit of folic acid

表4 方法的回收率及相對標準偏差(n=5)Table 4 Recoveries and relative standard deviations(RSD)of the method(n=5)

圖2 葉酸的離子掃描質譜圖 Fig.2 Ion scan of folic acid

注：“結果1”為按本實驗優(yōu)化后條件測定的加標回收結果,“結果2”為按國標GB/T 5009.211-2008 《食品中葉酸的測定》測定的加標回收結果。

2.3 標準曲線的配制

實驗結果表明,葉酸在2.0～100.0 ng/mL內均具有良好的線性關系(R2>0.999),目標組分的檢出限為1.0 μg/kg,定量限為3.0 μg/kg,結果見表3。

2.4 樣品前處理條件的優(yōu)化

4種提取液對葉酸回收率的影響如圖3所示,其中10%乙腈為提取液時,運動飲品中的葉酸回收率最高,然后依次為10%乙醇、10%甲醇和混合沉淀劑;當提取液為亞鐵氰化鉀溶液(106 g/L)+乙酸鋅溶液(219 g/L)混合沉淀劑時,雖然樣品中的基質沉淀效果明顯,但是葉酸的回收率不高,可能是混合沉淀劑對運動飲品中的葉酸有一定的吸附作用;其中10%乙醇提取率雖不及10%乙腈的提取效果好,但是考慮到乙腈的毒性比乙醇大,以及成本問題,所以本實驗選擇10%乙醇作為運動飲品葉酸成分的提取液。

圖3 提取液對葉酸的平均回收率的影響Fig.3 The effect of extract solution on the average recovery rate of folic acid

樣品經(jīng)過前處理與未經(jīng)前處理的色譜圖對比如圖4所示,我們可以很直觀的看出來,樣品經(jīng)10%乙醇處理后,可以有效地去除掉一些雜質干擾峰,減少基質效應的干擾,能夠更準確的定量目標化合物。

圖4 兩種處理方式的色譜圖比較Fig.4 The chromatograms of two treatment methods for comparison

2.5 加標回收及與國標方法對比實驗

在上述優(yōu)化后的條件下,利用已測定葉酸含量的運動飲品進行加標回收率實驗,分別添加50、100、200 μg/100 g 3個梯度濃度的標準溶液,每個濃度平行測定5次,測定結果見表4。

由表4可見,結果1葉酸的加標回收率為91.9%～98.0%,相對標準偏差(RSD)為2.6%～3.2%,說明本實驗所建立的方法具有可靠的準確度和精密度。與結果2對比發(fā)現(xiàn),本實驗的測定結果與國標方法基本一致,符合檢測要求。

3 結論

本文建立了一種超高效液相色譜-串聯(lián)質譜檢測運動飲品中葉酸含量的分析方法。結果表明,通過優(yōu)化后的色譜及質譜條件,在MRM掃描模式下,樣品經(jīng)過10%乙醇提取后,可有效去除運動飲品中的復雜基質,可實現(xiàn)對目標化合物的凈化,能準確、快速、有效地檢測運動飲品中的葉酸成分。本方法具有快速、簡單、準確、靈敏等特點,可對較寬濃度范圍內的葉酸含量進行分析,有助于提高食品檢測實驗室的分析效率,降低成本,為運動飲品中葉酸的測定提供參考。

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