,,,,, ,,

(1.貴港出入境檢驗(yàn)檢疫局,廣西貴港 537100; 2.廣西出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心,廣西南寧 530028)

色素可以分為天然色素和人工合成色素。人工合成色素具有著色力強(qiáng)、性質(zhì)較穩(wěn)定、結(jié)合牢固、成本低廉等特點(diǎn),因此在食品著色方面有著廣泛的應(yīng)用。但超標(biāo)、超范圍使用會(huì)造成人體被動(dòng)攝入過(guò)量的食用合成色素,導(dǎo)致出現(xiàn)噯氣、偏頭痛、多種過(guò)敏癥狀以及中毒等癥狀,更有甚者造成致癌、致畸、致突變等危害[1-3],所以其安全性日益受到重視。歐美、日本和我國(guó)等對(duì)合成色素允許使用的食品種類(lèi)和最大使用量都做出了相應(yīng)的規(guī)定[4]。我國(guó)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》(GB 2760-2014)[5]對(duì)人工合成色素的使用范圍及最大使用限量作了明確規(guī)定,但部分食品生產(chǎn)中仍然存在超范圍或超量使用的情況。一些不良商家為了謀求高利潤(rùn)或使肉制品的外觀(guān)更鮮艷,將不允許添加的色素添加到肉制品中。

目前《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中合成著色劑的測(cè)定》(GB 5009.35-2016)[6]方法不適用肉制品的前處理,行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《食品中的誘惑紅、酸性紅、亮藍(lán)、日落黃的含量檢測(cè) 高效液相色譜法》(SN/T 1743-2006)[7]也只適用于糖果和飲料色素的檢測(cè),國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《肉制品 胭脂紅著色劑測(cè)定》(GB/T 9695.6-2008)[8]只是規(guī)定了肉制品中胭脂紅著色劑的測(cè)定方法,而對(duì)其他種類(lèi)的合成著色劑未作規(guī)定,且其前處理方法過(guò)程繁瑣、工作效率低。文獻(xiàn)[9-16]報(bào)道了幾種合成色素的檢測(cè)方法,但未見(jiàn)有同時(shí)測(cè)定檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅和酸性紅這6種色素的報(bào)道。本研究通過(guò)優(yōu)化樣品提取和測(cè)定條件,建立了一套快速準(zhǔn)確同時(shí)測(cè)定肉制品中檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅和酸性紅6種人工合成色素的高效液相色譜方法,以期為肉制品中人工合成色素的高通量測(cè)定提供新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

肉制品 在廣西范圍內(nèi)市場(chǎng)隨機(jī)采購(gòu);無(wú)水乙醇 色譜純,天津光復(fù)精細(xì)化工研究所;氨水 分析純,廣東光華科技股份有限公司;乙腈 色譜純,美國(guó)天地有限公司;乙醚 分析純,四川西隴化工有限公司;乙酸銨 分析純,廣東光華科技股份有限公司;檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) 濃度0.500 mg/mL,中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院;誘惑紅標(biāo)準(zhǔn)品(純度80.0%)、酸性紅標(biāo)準(zhǔn)品(純度95.4%) 德國(guó)Dr.Ehrenstorfer;乙醇-氨-水溶液(7∶1∶2,v/v);超純水 自制。

Agilent 1260型高效液相色譜儀(帶二極管陣列檢測(cè)器) 美國(guó)Agilent公司;GM 200刀式研磨儀 德國(guó)RETSCH(萊馳)公司;Milli-Q超純水系統(tǒng) 美國(guó)Millipore公司;L550臺(tái)式低速大容量離心機(jī) 湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司;LPD2500多管旋渦混合儀 萊普特科學(xué)儀器(北京)有限公司;HWS24型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司;ML204/02電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;KQ-400KDB型高功率數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理 稱(chēng)取絞碎的肉制品10 g(精確至0.01 g)放入50 mL塑料離心管中,加入15 mL乙醚,在混勻器上混勻3 min,棄去乙醚,反復(fù)處理3次清除脂肪。用氮?dú)鈱⒁颐褤]盡后,加25 mL乙醇-氨-水(7∶1∶2,v/v)溶液,漩渦混勻1 min后超聲(頻率40 KHz)提取30 min,4000 r/min離心5 min,上清液移入100 mL燒杯,殘?jiān)^續(xù)用乙醇氨水溶液提取,至提取液無(wú)明顯顏色。合并上清液于100 mL燒杯中,將提取液置于90 ℃水浴,揮至近干。再加25 mL乙醇氨溶液,振蕩混勻后4000 r/min離心5 min,收集上清液于90 ℃水浴蒸至2 mL左右,用水稀釋至10 mL,取適量經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾,待測(cè)。

1.2.2 色譜條件 色譜柱:Agilent Poroshell 120 SB-C18(4.6 mm×150 mm,2.7 μm);柱溫:35 ℃;流動(dòng)相:A相為0.02 mol/L乙酸銨溶液,B相為乙腈,流速:0.8 mL/min;梯度洗脫程序:0 min 95% A,5 min 80% A,10 min 80% A,15 min 95% A;進(jìn)樣量:10.0 μL;二極管陣列檢測(cè)器;檢測(cè)波長(zhǎng):檸檬黃 428 nm,莧菜紅520 nm,胭脂紅508 nm,日落黃482 nm,誘惑紅515 nm,酸性紅516 nm。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 濃度為0.500 mg/mL的酸性紅、誘惑紅標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:分別稱(chēng)取按其純度折算為100%質(zhì)量的酸性紅、誘惑紅標(biāo)準(zhǔn)品0.0500 g,分別置于100 mL容量瓶中,用水溶解,并用水定容至刻度。

分別準(zhǔn)確吸取1 mL檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅和酸性紅母液于10 mL容量瓶中,用水定容至刻度,配制成濃度50 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,將混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液分別稀釋為1.0、3.0、5.0、7.0、10.0 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)系列。檢測(cè)時(shí),在上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定,以標(biāo)準(zhǔn)系列溶液濃度為橫坐標(biāo)(X)、相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線(xiàn)性回歸。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理?xiàng)l件的確定

2.1.1 蛋白的沉淀 在大量的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,發(fā)現(xiàn)當(dāng)遇到蛋白質(zhì)、脂肪含量高,樣品基質(zhì)復(fù)雜的情況時(shí),按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《肉制品 胭脂紅著色劑測(cè)定》(GB/T 9695.6-2008)提取色素步驟繁瑣,合成著色劑無(wú)法被聚酰胺粉完全吸附,在洗滌的時(shí)候色素也不能完全洗滌下來(lái),造成色素?fù)p失。

在研究中使用沉淀劑來(lái)沉淀蛋白質(zhì),但是在加入沉淀劑后,可以發(fā)現(xiàn)沉淀物上有顏色沉著。而且離心后也會(huì)出現(xiàn)絮狀物漂浮,在經(jīng)過(guò)水浴蒸干時(shí),有大量的沉淀物,無(wú)法過(guò)柱,如果經(jīng)過(guò)離心再過(guò)柱，肉眼只能看見(jiàn)少量色素富集在沉淀物上。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中比對(duì)加入沉淀劑和不加沉淀劑的回收率(詳見(jiàn)表1),結(jié)果表明,使用沉淀劑的回收率低于不加沉淀劑的。所以可以確定在使用沉淀劑沉淀蛋白的同時(shí),也有一部分色素隨之沉淀。

表1 加沉淀劑和不加沉淀劑回收率比對(duì)表(n=6)Table 1 Recoveries of added precipitant and without precipitant(n=6)

表2 一次提取和二次提取回收率比對(duì)表(n=6)Table 2 Recoveries of single extraction and twice extraction(n=6)

2.1.2 提取次數(shù) 在第一次使用乙醇氨溶液提取色素后,提取液水浴蒸至5 mL左右,大量的蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)高溫后變性產(chǎn)生沉淀,如果直接用水定容需要離心后才能用0.45 μm濾膜過(guò)濾,實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)這些沉淀吸附色素能力強(qiáng),經(jīng)過(guò)離心后色素沉著嚴(yán)重,特別是對(duì)含量不超過(guò)1 mg/kg的樣品的影響較大。所以本方法采取二次使用乙醇氨溶液提取,由于合成色素易溶于乙醇氨溶液中,離心后色素不會(huì)隨著變性的蛋白質(zhì)沉淀,這樣大大提高了回收率(見(jiàn)表2)。

2.1.3 濃縮條件 在水浴揮干乙醇-氨溶液時(shí),水浴溫度要控制在90 ℃以下,并且揮發(fā)至2 mL左右即可,如果水溫過(guò)高或蒸至太干,會(huì)影響其回收率,酸性紅甚至?xí)霈F(xiàn)檢測(cè)不出的情況,與文獻(xiàn)[17]的報(bào)道一致。

2.2 測(cè)定條件選擇

2.2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 按照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中合成著色劑的測(cè)定》(GB 5009.35-2016)測(cè)定合成色素采用254 nm檢測(cè)波長(zhǎng),在此波長(zhǎng)下,有吸收的化學(xué)成分太多[18],測(cè)定時(shí)容易受樣品中其他成分干擾,峰重疊現(xiàn)象嚴(yán)重,無(wú)法明顯分離,特別是對(duì)于一些成分復(fù)雜的樣品,樣品中的其他雜質(zhì)與目標(biāo)物質(zhì)分不開(kāi)。6種色素選擇不同波長(zhǎng)檢測(cè),色譜峰分離效果明顯(見(jiàn)圖1),相互干擾現(xiàn)象大大降低。

2.2.2 流動(dòng)相條件的選擇 文獻(xiàn)[19]證實(shí)在甲醇中加入適量的乙腈作為流動(dòng)相能夠有效地提高色譜峰的對(duì)稱(chēng)性,本研究發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用乙腈也可以很好得分離檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅和酸性紅這六種色素。采用0.02 mol/L乙酸銨-乙腈溶液作為流動(dòng)相,為了利于色譜峰的分離,多次對(duì)流動(dòng)相的比例進(jìn)行調(diào)整,后來(lái)發(fā)現(xiàn)乙酸銨和乙腈在流動(dòng)相中比例的變化可以提高分離效果,故采用梯度洗脫條件,6種色素得到較好的分離,并能得到理想的色譜圖(見(jiàn)圖1)。

2.3 干擾物質(zhì)的排除

本方法雖然采取不同波長(zhǎng)對(duì)6種色素分別進(jìn)行檢測(cè),避開(kāi)大部分干擾物質(zhì)的吸收,但是肉制品樣品本身環(huán)境十分復(fù)雜,除含有大量的脂肪和蛋白質(zhì)成分外,一些經(jīng)過(guò)加工處理的樣品,如牛肉條、豬肉條等小吃類(lèi)的肉制品,由于添加物質(zhì)多,樣品處理后雜質(zhì)也較多,檢測(cè)樣品時(shí),出現(xiàn)的可能是雜質(zhì)峰,可用6種色素的特征光譜進(jìn)行確認(rèn)。核查該物質(zhì)的光譜時(shí),與相應(yīng)對(duì)照品光譜比對(duì),如光譜一致,則確認(rèn)檢出目標(biāo)色素,反之則可以排除。樣品加標(biāo)和空白樣品按照1.2.1方法進(jìn)行前處理、標(biāo)準(zhǔn)溶液按照1.2.3方法配制,后于1.2.2條件下檢測(cè),6種人工合成色素保留時(shí)間重現(xiàn)性好,樣品處理后無(wú)明顯干擾,其標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品加標(biāo)和空白樣品的色譜圖見(jiàn)圖1～圖3。

圖1 濃度為10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.1 Chromatogram of 10 μg/mL mixed standard solution

圖2 空白樣品添加10 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)色素的標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.2 Chromatogram of blank sample added with concentration of 10 μg/mL mixed standard solution

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及檢出限

將混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液在1.2.2色譜條件下進(jìn)行分析,以混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液濃度為橫坐標(biāo)(X),相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線(xiàn)性回歸?；貧w方程、相關(guān)系數(shù)及線(xiàn)性范圍、方法的檢出限(按3倍信噪比計(jì)算)見(jiàn)表3。

表3 線(xiàn)性范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限Table 3 Standard curve of regression equation,correlation coefficient and linearity ranges

圖3 空白樣品色譜圖Fig.3 Chromatogram of blank sample

2.5 回收率及精密度

分別稱(chēng)取10 g(精確至0.01 g)經(jīng)過(guò)絞碎混勻的肉制品共20份,加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,添加量相當(dāng)于1、2、10 mg/kg的平行樣品各6份,其中2份不加標(biāo)準(zhǔn)溶液作為本底樣品,按照方法1.2.2進(jìn)行測(cè)定,檢測(cè)本底樣品不含6種色素。經(jīng)計(jì)算,檸檬黃的回收率為87.19%～90.86%、莧菜紅的回收率為70.33%～78.93%、胭脂紅的回收率為80.47%～88.43%、日落黃的回收率為86.98%～90.32%、誘惑紅的回收率為86.24%～93.08%、酸性紅的回收率為72.03%～79.53%。樣品的平均回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 回收率、精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)Table 4 Result of recovery and precision(n=6)

2.6 樣品的測(cè)定

按照本實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定了從大型超市抽取的86個(gè)樣品和從農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)抽取的44個(gè)熟食樣品,抽取的這些樣品包含了叉燒、鹽焗雞、燒鴨、鹵雞爪、臘腸、臘肉、鹵豬腳、鹵鴨脖、火腿、牛肉干和豬肉干等。結(jié)果顯示大型超市的檢出率比較低,僅有2個(gè)樣品檢出,其中一個(gè)檢出酸性紅,另一個(gè)檢出檸檬黃。農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)檢出率比較高,44個(gè)樣品中共有15個(gè)樣品檢出添加有1種或幾種色素,主要是檸檬黃、胭脂紅、日落黃和誘惑紅,檢出率為34%,有的色素添加濃度甚至高達(dá)300 mg/kg。本課題還從市場(chǎng)抽取了25個(gè)生鮮類(lèi)樣品,包括雞肉、牛肉、豬肉,按照此方法進(jìn)行檢測(cè),均未檢出添加色素。

3 結(jié)論

本方法不需吸附、過(guò)濾、解析等步驟,前處理操作便捷、快速,能在較短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅和酸性紅6種合成色素的檢測(cè),有較好的回收率和精密度,加標(biāo)回收率為70.33%～93.08%,檢出限為0.12～0.21 mg/kg,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%,表明該方法檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠,為肉制品中違法或超量添加各種色素的監(jiān)督檢驗(yàn)提供了科學(xué)的方法,具有很好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

[1]Kus E,Eroglu H E. Genotoxic and cytotoxic effects of sunset yellow and brilliant blue,colorant food additives,on human blood lymphocytes[J].Pakistan Journal of Pharmaceutical Sciences,2015,28(1):227-230.

[2]Goodman d w .Artificial food colour exclusion and free fatty acid supplementation may reduce symptom severity in children with ADHD[J].Evidence Based Mental Health,2013,16(3):77.

[3]Sarikaya R,Selvi M,Erkoc F. Evaluation of potential genotoxicity of five food dyes using the somatic mutation and recombination test[J].Chemosphere,2012,88(8):974-979.

[4]葛宇.食品中合成色素使用法規(guī)及檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)展[J].質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)化,2011(9):31-35

[5]國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì). GB 2760-2014 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)[S]. 北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2014.

[6]中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì). GB 5009.35-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中合成著色劑的測(cè)定[S]. 北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2004.

[7]國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局. SN/T 1743-2006 食品中的

誘惑紅、酸性紅、亮藍(lán)、日落黃的含量檢測(cè) 高效液相色譜法[S]. 北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2006.

[8]中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì). GB/T 9695.6-2008 肉制品胭脂紅著色劑測(cè)定[S]. 北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2008.

[9]李瑩,付騁宇,何強(qiáng),等.高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)肉制品中4種著色劑[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào),2015,6(11):4416-4421.

[10]胡漢高,張紅菱,周威,等.高效液相色譜法檢測(cè)熟肉制品中5種人工合成色素方法的建立[J].食品科學(xué),2011,32(20):171-174

[11]劉忠秋.高效液相色譜法測(cè)定肉制品中人工合成著色劑方法探究[J].遼寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào).2009,30(3):265

[12]歐陽(yáng)燕玲,陳玲,謝維平.肉制品中人工合成著色劑測(cè)定前處理方法的研究[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2006,16(10):1269.

[13]王紅梅,郭偉,王繼鵬,等.高效液相色譜法測(cè)定肉制品中使用合成色素的含量[J].食品研究與開(kāi)發(fā) 2007,28(6):106-108.

[14]林春曉,曾紅慧,付斌,等.高效液相色譜法檢測(cè)熟食肉制品中人工合成色素的研究[J].中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué),2005,5(3):556-557.

[15]戚榮平,邱曉楓,商曉春.熟肉制品中防腐劑、合成著色劑檢測(cè)方法的探討[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志2009,19(1):50-51.

[16]俞俊,周丹,葉燕,等.高效液相色譜法測(cè)定肉制品中四種合成著色劑的研究[J].安徽化工,2011,37(6)：59-60.

[17]李瑾瑾.食品中合成著色劑分析方法研究[D].南昌:南昌大學(xué),2011:27.

[18]林建忠.HPLC法測(cè)定食品中色素條件優(yōu)化的研究[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,1998,8(4):205.

[19]Dinc E,Aktas A H,Ustundag O. New liquid chromatographic-chemometric a pproach for the determination of Sunset Yellow and Tartrazine in commercial preparation[J]. Journal of AOAC International,2005,88(6):1748-1755.