張 鑫

（天津創(chuàng)世生態(tài)景觀建設(shè)股份有限公司，天津 南開 300000）

鐵皮石斛（Dendrobium oきcinaleKimura et Migo）是蘭科（Orchidaceae）石斛屬（Dendrobium）多年生附生草本植物，因其老莖外呈黑色，又名為黑節(jié)草，是名貴中藥，居“中華九大仙草”之首，所含的主要成分為石斛多糖及生物堿，另外，還有酚類、菲類、芪類、倍半萜類及香豆素等。現(xiàn)代藥理研究證明石斛多糖具有抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力的功能。但由于鐵皮石斛生長(zhǎng)環(huán)境特殊，以及長(zhǎng)期采挖，自然資源日趨枯竭，已被國(guó)家列為重點(diǎn)保護(hù)的野生藥材。從20世紀(jì)中期開始就有關(guān)于鐵皮石斛的研究，主要涉及組織培養(yǎng)方法、有效成分含量和藥理作用方面的研究。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛在組織快繁過程中存在一些問題，例如通過組培生產(chǎn)出苗的成本過高，幼苗移栽成活率低，工廠化生產(chǎn)效率低。鑒于以上問題，現(xiàn)在對(duì)于鐵皮石斛原球莖的研究日益廣泛，鐵皮石斛原球莖是由鐵皮石斛種子通過無(wú)菌培養(yǎng)誘導(dǎo)繁殖形成的。它是種子萌發(fā)過程中，原胚萌動(dòng)膨大，突破種皮后形成的淺黃色小圓錐形胚性組織。以鐵皮石斛原球莖為材料進(jìn)行組織培養(yǎng)，通過改變培養(yǎng)基條件，可使鐵皮石斛原球莖生長(zhǎng)旺盛，繁殖率高，具有較好的開發(fā)前景[1]。原球莖在培養(yǎng)基上可以直接分化成幼苗，也是制備人工種子的材料，使幼苗移栽成活率低的問題得到了解決；原球莖中也還含有同石斛苗相同的藥用成分，通過大規(guī)模培養(yǎng)來(lái)提取，同樣可以滿足藥材市場(chǎng)對(duì)鐵皮石斛的需求。

本文根據(jù)有關(guān)鐵皮石斛原球莖組織培養(yǎng)技術(shù)研究方面進(jìn)行了綜述，以期為解決鐵皮石斛資源短缺問題提供一種有效方法。

1 培養(yǎng)基與激素

培養(yǎng)基是組織培養(yǎng)過程中培養(yǎng)材料吸收營(yíng)養(yǎng)的來(lái)源，是決定組織培養(yǎng)成功與否的關(guān)鍵因素。而植物激素在植物組織培養(yǎng)過程中同樣起著主要作用，影響植物的生長(zhǎng)代謝。研究證明，鐵皮石斛原球莖能夠通過固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，從最終的效果來(lái)看，比如產(chǎn)量和多糖的含量，懸浮培養(yǎng)效果更加理想[2]。其原因可能是液體培養(yǎng)不僅可以使植株更加全面的接觸到培養(yǎng)基，植株可以吸收較多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)和再分化[3]。而且在液體懸浮培養(yǎng)時(shí)，可以用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行生理生化調(diào)控，該技術(shù)的應(yīng)用可以大大提高控制能力，經(jīng)過懸浮培養(yǎng)的原球莖多糖含量可達(dá)20.1%，野生鐵皮石斛中的含量也不過如此[4]。魏小勇[5]建立的鐵皮石斛原球莖懸浮系，原球莖分散性好、整齊均一，為鐵皮石斛大規(guī)模培養(yǎng)開創(chuàng)了新途徑，同時(shí)，該研究組發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加0.5 mg·L-1ABA預(yù)先培養(yǎng)30 d，原球莖的質(zhì)量提高、同步性更好，可以大規(guī)模增殖鐵皮石斛的原球莖，用于制備人工種子。莫昭展等[6]的研究結(jié)果表明在改良MS中加入0.5 mg·L-1脫落酸，進(jìn)行液體振蕩培養(yǎng)，原球莖增殖的效果比較好。蘇鈦等[3]用正交設(shè)計(jì)方法研究了對(duì)鐵皮石斛原球莖具有高效增殖影響的激素（6-BA，NAA，KT，馬鈴薯汁）以及配比，結(jié)果表明，原球莖在1/2MS+6-BA2.0 mg·L-1+NAA1.0 mg·L-1+KT0.5 mg·L-1+3%糖的培養(yǎng)基上，以液體懸浮培養(yǎng)，原球莖50 d增殖達(dá)49.032 g。隨著工廠化育苗的發(fā)展，人們?cè)絹?lái)越重視經(jīng)濟(jì)效益，采用其他材料來(lái)代替培養(yǎng)基的部分成分，以期減少生產(chǎn)成本，李思梅等[7]通過研究沼肥以不同比例替換鐵皮石斛原球莖增殖培養(yǎng)基中部分營(yíng)養(yǎng)成分后，認(rèn)為沼肥按一定比例替代培養(yǎng)基中的部分營(yíng)養(yǎng)成分，可以促進(jìn)原球莖增殖，并驗(yàn)證了沼肥以10%的替代比例替代大量元素為最佳。蘇江[8]認(rèn)為培養(yǎng)基的滲透壓對(duì)鐵皮石斛原球莖的生長(zhǎng)有重要的作用，并以無(wú)菌鐵皮石斛原球莖為材料，通過添加不同濃度的甘露醇以調(diào)節(jié)其滲透壓，得出結(jié)論：添加低濃度的甘露醇可促進(jìn)鐵皮石斛原球莖生長(zhǎng)及增加多糖含量，而添加高濃度的甘露醇能明顯抑制鐵皮石斛原球莖生長(zhǎng)及降低多糖含量，而且當(dāng)甘露醇質(zhì)量濃度為20 g·L-1時(shí)，隨時(shí)間的推移，原球莖活力、生長(zhǎng)量、多糖含量和多糖產(chǎn)量總體呈上升趨勢(shì)。

2 碳源和氮源

細(xì)胞干物質(zhì)中的主要元素是碳，碳元素是構(gòu)成細(xì)胞骨架的重要成分，因此在培養(yǎng)基中添加一定的碳源是必要的[9]。在鐵皮石斛原球莖生長(zhǎng)過程中，培養(yǎng)基中的糖提供植株生長(zhǎng)所需要的碳源。在培養(yǎng)結(jié)束后，對(duì)培養(yǎng)基中的成分進(jìn)行研究測(cè)定，發(fā)現(xiàn)添加的糖分幾乎全被植株吸收利用。在糖消耗的同時(shí)，原球莖干重逐漸增加[2]。何鐵光等[10]研究，添加不同的糖類物質(zhì)作為碳源，發(fā)現(xiàn)蔗糖和葡萄糖能夠被優(yōu)先利用，對(duì)原球莖生長(zhǎng)速度和多糖積累含量的影響明顯高于乳糖和果糖。同時(shí)該研究組還研究了不同蔗糖濃度對(duì)鐵皮石斛原球莖生長(zhǎng)速度和多糖積累的影響，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，鐵皮石斛原球莖生長(zhǎng)的最佳蔗糖濃度和多糖積累所需的最佳蔗糖濃度是不同的。綜合各種因素考慮，如原球莖干重、多糖含量、生產(chǎn)成本等，實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)選取30 g·L-1的蔗糖濃度。

氮源的濃度對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育和代謝產(chǎn)物的形成有著重要的作用。培養(yǎng)基中的氮元素分為硝態(tài)氮和銨態(tài)氮，其NO3-/NH4+的比值的大小對(duì)原球莖的生長(zhǎng)代謝有著相當(dāng)大的影響。韋曉新等[11]研究表明，當(dāng)?shù)礉舛确秶刂圃跒?0～60 mmol·L-1、NO3-/NH4+分子比為 40∶20時(shí)，能夠促進(jìn)原球莖生長(zhǎng)，且高濃度NH4+會(huì)對(duì)原球莖生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制，因此在配培養(yǎng)基中應(yīng)注意控制NH+4的濃度。宋經(jīng)元等[12]以原有的研究基礎(chǔ)通過利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)來(lái)研究不同種類和濃度的氮源對(duì)鐵皮石斛原球莖生長(zhǎng)增值的影響。得到的結(jié)果如下，硝態(tài)氮有利于鐵皮石斛原球莖鮮重和干重的增加；而銨態(tài)氮僅有利于鐵皮石斛原球莖鮮重增加，通過試驗(yàn)還可以得到，無(wú)論對(duì)于鮮重還是干重，硝態(tài)氮和銨態(tài)氮的影響均不存在互作，培養(yǎng)基的最佳組合為：67-V培養(yǎng)液+30 g·L-1蔗糖+200 g·L-1馬鈴薯提取汁+100 mg·L-1（NH4）2S04+800 mg·L-1KNO3。李巧自等[13]以硝普鈉（SNP）為一氧化氮（NO）供體，研究了不同濃度的外源NO對(duì)鐵皮石斛原球莖生長(zhǎng)、葉綠素含量、蔗糖合成酶（SS）活性和多糖積累的影響，認(rèn)為低濃度的SNP有利于鐵皮石斛原球莖的生長(zhǎng)，而高濃度的SNP可以促進(jìn)多糖的合成。

3 金屬離子、真菌和天然附加物

培養(yǎng)基中的金屬離子來(lái)源于無(wú)機(jī)鹽中，植物從培養(yǎng)基中吸收金屬離子，以合成自身生長(zhǎng)發(fā)育所需的物質(zhì)，例如核酸、酶以及蛋白質(zhì)等。金屬離子同樣也影響原球莖的生長(zhǎng)代謝。林從發(fā)等[14]通過對(duì)5種金屬離子進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)得到，影響原球莖生長(zhǎng)增殖的順序?yàn)?Mg2+＞Fe2+＞Ca2+＞Mn2+＞Zn2+，并對(duì)3種天然附加物（馬鈴薯、蘋果和香蕉）對(duì)原球莖增殖的影響進(jìn)行研究，結(jié)果表明：3種附加物對(duì)原球莖增殖影響差異極大，馬鈴薯和蘋果更有利于原球莖的增殖，該培養(yǎng)基上的原球莖長(zhǎng)勢(shì)良好，顏色鮮綠，生長(zhǎng)參數(shù)平均分別達(dá)到10.6和9.3，而香蕉則不利于原球莖的增殖，原球莖在該培養(yǎng)基上增殖緩慢，顏色發(fā)黃，最終死亡。得到原球莖增殖的最佳培養(yǎng)基1/2MS+10%馬鈴薯汁+3%蔗糖+NAA0.5 mg·L-1（含Ca2+2 mmol·L-1、Mg2+1.0 mmol·L-1、Mn2+0.1 mmol·L-1、Fe2+0.1 mmol·L-1、Zn2+0.03 mmol·L-1）。研 究 表明適宜濃度的鍺有利于懸浮培養(yǎng)的原球莖生長(zhǎng)發(fā)育，通過在原球莖生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中添加適宜濃度的鍺發(fā)現(xiàn)，原球莖的鮮重，可溶性蛋白和葉綠素含量明顯增加，而且促進(jìn)超氧化物歧化酶（SOD），過氧化氫酶（CAT）活性升高，過氧化物酶（POD）的活性下降。因此適當(dāng)濃度的GeO2（5 mg·L-1）對(duì)原球莖的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用[15]。

鐵皮石斛是一種與真菌共生的蘭科植物。真菌促進(jìn)其種子的萌發(fā)并與之形成菌根而促進(jìn)其對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收[16]。從野生的鐵皮石斛中可以分離出相應(yīng)的真菌菌株，而真菌添加物是通過將原始菌株進(jìn)行分離、發(fā)酵培養(yǎng)并將得到的發(fā)酵液與菌絲體混合，然后勻漿滅菌后得到的。侯丕勇等研究發(fā)現(xiàn)真菌添加物不利于原球莖增殖分化[17]。宋經(jīng)元等[12]利用從白蘭科植物體內(nèi)分離的14種原始菌制的相應(yīng)的真菌誘導(dǎo)子，發(fā)現(xiàn)其對(duì)原球莖的鮮重和干重沒有顯著的影響，這14種誘導(dǎo)子對(duì)原球莖的增殖都有不同程度的抑制，這與侯丕勇的研究結(jié)果是一致的。研究表明，活體真菌MF24在適宜的環(huán)境下能夠與原球莖共培養(yǎng)，而且會(huì)對(duì)原球莖的次生代謝水平產(chǎn)生影響[18]。在原球莖懸浮培養(yǎng)的后期加入MF24發(fā)酵制備的誘導(dǎo)子會(huì)促進(jìn)原球莖多糖含量的積累[19]，并有利于原球莖的增殖生長(zhǎng)，影響生物堿的合成[20]。在鐵皮石斛內(nèi)生真菌的研究中，獲得了對(duì)組培苗的生長(zhǎng)呈現(xiàn)不同影響的兩株內(nèi)生真菌DCN-1和DCN-3，喻靜[21]通過試驗(yàn)得出菌株DCN-1對(duì)組培階段和移栽后的組培苗和原球莖的生長(zhǎng)無(wú)明顯影響，菌株DCN-3會(huì)導(dǎo)致組培階段的植株苗枯萎甚至死亡而對(duì)移栽后的組培苗影響不大，但抑制原球莖的生長(zhǎng)。符合之前研究得出的結(jié)論，真菌添加物不利于原球莖的增殖分化。

在原球莖組織培養(yǎng)過程中通常添加香蕉汁、土豆汁、芋頭汁等天然附加物，這些物質(zhì)中一般含有有機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分并對(duì)原球莖的誘導(dǎo)、增殖和分化有重要作用，天然附加物的研究是鐵皮石斛原球莖最重要的一個(gè)方面。張治國(guó)等[22-23]在培養(yǎng)基中分別添加了馬鈴薯、荸薺和香蕉三種相應(yīng)的植物提取液來(lái)觀察其對(duì)原球莖的生長(zhǎng)狀況的影響，得出馬鈴薯的增殖系數(shù)最高，香蕉的最低而且原球莖生長(zhǎng)情況不良；未添加天然附加物的對(duì)照組的原球莖未分化，增殖比較明顯；而添加馬鈴薯的分化狀況也是很明顯的，分化成的幼苗顏色鮮綠，生長(zhǎng)健壯；得到的結(jié)論為原球莖增殖時(shí)不添加天然附加物，原球莖分化時(shí)添加馬鈴薯的提取液。包英華等[24]為探討鐵皮石斛原球莖的培養(yǎng)基中添加物的作用，在1/2MS培養(yǎng)基中加入椰肉、甘蔗渣、香蕉皮和麥麩等4種添加物，研究不同濃度添加物和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)原球莖生長(zhǎng)和多糖含量的影響。結(jié)果表明，4種添加物對(duì)鐵皮石斛原球莖的增殖、分化和多糖含量均有一定影響，其中添加15.0 g·L-1甘蔗渣，培養(yǎng)60 d能明顯促進(jìn)鐵皮石斛原球莖的增殖與分化（146.1%）；而添加20.0 g·L-1甘蔗渣，培養(yǎng)40 d能顯著提高鐵皮石斛原球莖多糖含量（50.4%）。這說明甘蔗渣是培養(yǎng)鐵皮石斛原球莖的適宜添加物，既能促進(jìn)鐵皮石斛原球莖的生長(zhǎng)發(fā)育，還能降低生產(chǎn)成本。徐玲等[25]同樣對(duì)多種天然有機(jī)物進(jìn)行組合添加，探索具有促進(jìn)作用的有機(jī)附加物新種類和新組合。在原球莖增殖培養(yǎng)基中添加100 g·L-1土豆汁與100 g·L-1其他有機(jī)物（香蕉汁、玉米汁、西瓜汁、荔枝汁及小麥面粉），以土豆汁與玉米汁對(duì)增殖的促進(jìn)效果最佳（平均增殖5.66倍，鮮重提高4.12倍），而分化程度較低（分化率67.9%，排第3），適合作為原球莖繼代培養(yǎng)前期的添加成分。添加土豆汁與小麥面粉，原球莖分化率（平均95.1%）和鮮重增加（平均5.35倍）最高，分化苗健壯度最高，適合作為原球莖繼代培養(yǎng)后期的添加成分。在鐵皮石斛幼苗階段，對(duì)天然附加物也有進(jìn)一步的研究，董燕婧等[26]以鐵皮石斛試管小苗為材料，以MS+0.5 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA+20 g·L-1蔗 糖 +6 g·L-1瓊脂為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法研究3種不同添加物（普通香蕉汁、食用馬鈴薯汁、活性炭）對(duì)鐵皮石斛幼芽生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明，香蕉汁對(duì)鐵皮石斛的鮮質(zhì)量、根數(shù)、莖高有促進(jìn)作用，在促進(jìn)莖的伸長(zhǎng)方面效果較為顯著；馬鈴薯汁對(duì)鐵皮石斛的根長(zhǎng)、莖粗影響不大，但在鮮質(zhì)量和莖高等方面有顯著性促進(jìn)作用；添加一定量的活性炭可以促進(jìn)鐵皮石斛根的生長(zhǎng)。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基里添加30%香蕉汁，10%馬鈴薯汁，0.6 g·L-1活性炭，有利于鐵皮石斛的壯苗生根。

4 培養(yǎng)方式

搖床的轉(zhuǎn)速快慢對(duì)原球莖在培養(yǎng)過程中對(duì)氧氣的吸收有重要的影響，因此同樣影響原球莖的生長(zhǎng)和多糖的積累。韋曉新等[11]的研究表明當(dāng)初始培養(yǎng)基的pH值為7.0，接種量選擇30 g·L-1時(shí)，選取110 r·min-1為原球莖培養(yǎng)最適搖床轉(zhuǎn)速，有利于原球莖的生長(zhǎng)和增殖。有研究表明原球莖在培養(yǎng)過程中發(fā)生褐變與搖床的轉(zhuǎn)速有關(guān)，經(jīng)過懸浮培養(yǎng)90 d后，原球莖在高轉(zhuǎn)速培養(yǎng)中開始褐變，顏色發(fā)黃，而在低轉(zhuǎn)速中未褐變，長(zhǎng)勢(shì)良好[5]。其結(jié)果與上述的試驗(yàn)結(jié)果不一致，需要進(jìn)一步研究。培養(yǎng)瓶的材質(zhì)同樣對(duì)鐵皮石斛原球莖的生長(zhǎng)有影響。萬(wàn)珠珠等分別設(shè)置N6+玻璃瓶、N6+塑料杯、1/2 N6+玻璃瓶、1/2 N6+塑料杯4組處理進(jìn)行增殖培養(yǎng)。認(rèn)為塑料杯的污染率為8%，大于玻璃瓶的污染率3%；N6培養(yǎng)基在玻璃瓶下對(duì)鐵皮石斛原球莖分化最好[27]。

培養(yǎng)周期對(duì)懸浮培養(yǎng)下原球莖的生長(zhǎng)代謝有很大的影響，當(dāng)繼代培養(yǎng)的周期過長(zhǎng)時(shí)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)會(huì)逐漸消耗殆盡，原球莖的生長(zhǎng)發(fā)育就會(huì)減緩，與此同時(shí)培養(yǎng)基中會(huì)積累有害物質(zhì)，進(jìn)一步影響原球莖的增值；而周期過短，不利于原球莖對(duì)培養(yǎng)基的吸收，浪費(fèi)實(shí)驗(yàn)材料。有研究表明的原球莖培養(yǎng)周期為45 d[22]；而宋經(jīng)元等[28]經(jīng)過研究表明，30 d的培養(yǎng)周期可使原球莖的干重與鮮重的比值、增殖系數(shù)等指標(biāo)均達(dá)到最佳，而通過縮短培養(yǎng)周期的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，原球莖較以前相比生長(zhǎng)周期明顯加快。魏小勇[5]的試驗(yàn)證明原球莖的繼帶周期選擇10～15 d比較好，原球莖長(zhǎng)勢(shì)良好而且不易發(fā)生褐變。

光照是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必須的，有研究表明原球莖在2 000 Lx光照強(qiáng)度下培養(yǎng)30 d后長(zhǎng)勢(shì)良好，原球莖顏色鮮綠，其多糖的積累量達(dá)到了最大[29]。林小蘋等[30]以鐵皮石斛的原球莖、無(wú)根試管苗、莖段和葉片為材料，研究不同光質(zhì)條件對(duì)鐵皮石斛原球莖增殖及4種材料中多糖和生物堿含量的影響。結(jié)果表明，在綠光下原球莖的增長(zhǎng)率明顯低于其他光質(zhì)，在白光和藍(lán)光下原球莖的增長(zhǎng)率較好。在4種材料中，藍(lán)光能促進(jìn)生物堿的合成，有利于生物堿積累，而紅光能促進(jìn)碳水化合物的積累．有利于多糖含量增加，綠光則不同程度地抑制多糖和生物堿的積累。

隨著對(duì)原球莖規(guī)?；囵B(yǎng)的研究日益增多，發(fā)現(xiàn)接種量與培養(yǎng)基體積對(duì)規(guī)?；囵B(yǎng)有著顯著的影響，對(duì)工廠化培養(yǎng)有較大的指導(dǎo)意義，也可作為參考依據(jù)。宋經(jīng)元等[28]經(jīng)過試驗(yàn)研究表明接種量和培養(yǎng)液體積對(duì)原球莖生長(zhǎng)發(fā)育均有影響，接種量對(duì)干重與鮮重的影響要大于培養(yǎng)液的體積，而兩種因素的互作很小，對(duì)兩種因素的最佳處理為：接種量6.194 g·瓶-1+培養(yǎng)液體積150 mL·瓶-1或100 mL·瓶-1。

5 研究意義

由于長(zhǎng)期過量采集使野生鐵皮石斛的資源迅速下降，難以滿足日益增長(zhǎng)的需求而鐵皮石斛的組織快繁存在著許多問題，例如生產(chǎn)成本高、幼苗移栽成活率低等。如今對(duì)鐵皮石斛原球莖的組織培養(yǎng)研究日益廣泛，原球莖可以直接分化成幼苗、成熟植株，而且其可以制作成為人工種子來(lái)解決組織快繁中遇到的問題；原球莖中同樣含有藥用成分，可以直接從中提取以滿足需求。利用鐵皮石斛原球莖進(jìn)行組培快繁，建立鐵皮石斛高效的組培快繁體系，不僅可保護(hù)鐵皮石斛野生資源，促進(jìn)工廠化育苗，還有利于推進(jìn)鐵皮石斛藥源的良性發(fā)展[31]。

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