黃俊偉，崔春*，鄭雪君，陳智光

(1.華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣州 510640； 2.廣東真美食品股份有限公司，廣東 潮州 521000)

南極磷蝦(Euphausiasuperba)，其蛋白氨基酸組成豐富，必需氨基酸齊全且高于WHO/FDA的推薦值。南極磷蝦蛋白消化率高，生物價(jià)也高于其他肉類蛋白和奶類蛋白[1]。但目前南極磷蝦主要在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)和釣魚業(yè)中用作飼料，產(chǎn)品附加值低。酶解處理是提高南極磷蝦蛋白利用率和產(chǎn)品附加值的有效手段，許多研究表明南極磷蝦酶解液具有抗氧化[2]、抑制有害菌[3]、預(yù)防骨質(zhì)疏松[4]、降血壓[5]等生理活性。氟是一種具有雙閾值的微量元素，適量的氟可以促進(jìn)骨質(zhì)生長(zhǎng)、預(yù)防齲齒，但過(guò)量的氟會(huì)導(dǎo)致人體出現(xiàn)氟斑牙和氟骨病等癥狀。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2762-2005和農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY 5073-2006規(guī)定魚類(淡水)的氟含量不得超過(guò)2 mg/kg，中國(guó)衛(wèi)生部在1981年規(guī)定3.5 mg/kg為每人每日氟安全攝入量[6]。南極磷蝦具有富氟特性，氟含量高達(dá)1102～1432 mg/kg，即使是南極磷蝦酶解液其氟含量也一般在40～70 mg/kg[7]。因此，從食用安全性的角度考慮，對(duì)南極磷蝦酶解液進(jìn)行脫氟處理顯得尤為必要。

關(guān)于南極磷蝦酶解液脫氟方面的研究目前已有許多報(bào)道。李紅艷等利用電滲析法將酶解液氟含量從58.97 mg/kg降低至1.25 mg/kg，但酶解液營(yíng)養(yǎng)價(jià)值損失嚴(yán)重，氨氮和總氮分別損失14.9%和19.0%。該學(xué)者也采用納濾法對(duì)酶解液進(jìn)行脫氟處理，氟含量由49.97 mg/kg 降低至2.45 mg/kg，但氨氮損失率和總氮損失率分別高達(dá)15.7%和22.5%。呂傳萍等[8]利用生石灰對(duì)酶解液進(jìn)行脫氟，最優(yōu)條件下脫氟率可達(dá)88.25%，但以酶解液氟含量為50 mg/kg來(lái)計(jì)算，脫氟后酶解液氟含量仍然高達(dá)5.88 mg/kg。此外，生石灰加入酶解液中會(huì)釋放出大量的熱，會(huì)對(duì)酶解液的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和生理活性產(chǎn)生不良影響。郭帆等[9]使用乳酸鈣和活性氧化鋁混合物對(duì)酶解液進(jìn)行脫氟處理，脫氟率高達(dá)93.98%，氨基酸損失率僅為3.49%，但由于鋁鹽對(duì)人體有毒害作用，反應(yīng)液需要通過(guò)微濾膜來(lái)除去殘留的脫氟材料，因而成本高。王靈昭[10]先用乳酸鈣然后使用生物脫氟劑對(duì)酶解液進(jìn)行脫氟處理，脫氟后酶解液氟含量?jī)H為1.53 mg/kg，總氮損失率為14.06%，但該學(xué)者并沒(méi)有明確說(shuō)明所使用的生物脫氟劑具體是什么物質(zhì)，因而限制了該工藝的推廣應(yīng)用。

目前成熟的脫氟方法主要集中在廢水治理和飲用水處理方面[11，12]，因此本文首先從常用的脫氟劑中篩選出適用于南極磷蝦酶解液的脫氟劑，在兼顧蛋白損失的情況下，正交試驗(yàn)優(yōu)化酶解液脫氟工藝并對(duì)脫氟前后酶解液的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值進(jìn)行評(píng)價(jià)。本研究旨在得到脫氟效果好、操作簡(jiǎn)便、成本低、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值損失少的脫氟工藝，以便為低氟南極磷蝦產(chǎn)品的商業(yè)性開(kāi)發(fā)提供理論指導(dǎo)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冰凍南極磷蝦(frozen krill)：-20 ℃保存?zhèn)溆?，青島遠(yuǎn)洋捕撈有限公司；酶制劑(胰酶)：重慶市祥盛生物制藥有限公司；超純水：實(shí)驗(yàn)室使用Milli Q超純水儀自制；磷酸、鹽酸、氫氧化鈉、氫氧化鈣、氧化鈣、檸檬酸鈣等其他化學(xué)試劑：均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HYP-308消化爐、KDN-103F型微量凱氏定氮儀 上海纖檢儀器有限公司；善美SM-G21型絞肉機(jī) 廣州新域機(jī)電制造有限公司；電子分析天平 梅特勒-托利多國(guó)際股份有限公司；pH-3E pH計(jì) 上海雷磁儀器廠；PF-202-C氟離子復(fù)合電極 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；THZ-82恒溫振蕩器 常州國(guó)華電器有限公司；TG20-WS離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司；Milli Q超純水儀 默克密理博Merck Millipore公司；L-8800 型氨基酸分析儀 日本日立公司。

1.3 南極磷蝦酶解液的制備

將冰凍南極磷蝦進(jìn)行解凍后絞成磷蝦肉糜，按料液比1∶1的比例往蝦肉糜中加入超純水，攪拌均勻后調(diào)節(jié)體系初始pH為7.5，然后加入0.1%(E/S)胰酶，45 ℃酶解7 h，沸水浴滅酶10 min后冷卻至室溫，8000 r/min離心20 min，上清液過(guò)濾紙，得到南極磷蝦酶解液。

1.4 基本理化指標(biāo)的測(cè)定

總氮含量：凱氏定氮法，參照GB/T 5009.5-2010；氨氮含量：甲醛滴定法，參照GB/T 5009.39-2003；氟含量：氟離子選擇性電極法，參照國(guó)標(biāo)GB/T 5009.18-2003。記錄脫氟前和脫氟后南極磷蝦酶解液的質(zhì)量，酶解液的蛋白損失率、氨氮損失率和脫氟率的計(jì)算公式如下：

蛋白損失率=(1-脫氟后酶解液蛋白總量/脫氟前酶解液蛋白總量)×100%。

公式(1)

氨氮損失率=(1-脫氟后酶解液氨氮總量/脫氟前酶解液氨氮總量)×100%。

公式(2)

脫氟率=(1-脫氟后酶解液氟含量/脫氟前酶解液氟含量)×100%。

公式(3)

1.5 脫氟劑的篩選

在參考部分文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)使用的脫氟劑包括硅藻土、高嶺土、活性炭、人造沸石、殼聚糖、幾丁質(zhì)、活性氧化鋁、聚合氯化鋁、氧化鎂和氯化鈣。分別添加溶液質(zhì)量1%的上述脫氟劑到氟化鈉溶液(CF-=50 mg/kg)和南極磷蝦酶解液中，攪拌均勻后放入搖床，在搖床轉(zhuǎn)速150 r/min、溫度30 ℃條件下反應(yīng)90 min，然后過(guò)濾紙得到濾液，測(cè)定氟含量。

1.6 鈣鹽的氟脫除效果比較

分析比較鈣鹽在氟化鈉溶液和南極磷蝦酶解液中的脫氟效果，使用的鈣鹽包括無(wú)機(jī)鈣(氫氧化鈣、氧化鈣、碳酸鈣、磷酸一氫鈣、磷酸二氫鈣、磷酸鈣、氯化鈣和硫酸鈣)和有機(jī)鈣(乳酸鈣、D-泛酸鈣、乙酸鈣、葡萄糖酸鈣和檸檬酸鈣)。添加終濃度20 mmol/kg 的上述鈣鹽(以 Ca2+計(jì))到反應(yīng)液中，攪拌均勻后放入搖床，在搖床轉(zhuǎn)速150 r/min、溫度30 ℃條件下反應(yīng)90 min，然后過(guò)濾紙得到濾液，測(cè)定氟含量。

1.7 氫氧化鈣脫氟工藝研究

以氫氧化鈣作為脫氟試劑，分別向氟化鈉溶液和南極磷蝦酶解液中加入1%的氫氧化鈣，攪拌均勻等量分成3份，一份作為空白對(duì)照(A工藝)，一份使用濃鹽酸調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH為7.0(B工藝)，一份使用磷酸溶液(濃磷酸稀釋5倍)調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH為7.0(C工藝)，30 ℃條件下反應(yīng)1 h，反應(yīng)液過(guò)濾紙后測(cè)定氟含量。

1.8 單因素試驗(yàn)

使用磷酸溶液來(lái)調(diào)節(jié)脫氟反應(yīng)的pH值，南極磷蝦酶解液脫氟試驗(yàn)的基本條件為：氫氧化鈣添加量1%，反應(yīng)pH 7.0，反應(yīng)時(shí)間1 h，反應(yīng)溫度40 ℃。脫氟結(jié)束后反應(yīng)液8000 r/min離心20 min，所得上清液即為脫氟酶解液。固定其他條件，改變其中1個(gè)因素來(lái)考察其對(duì)酶解液脫氟效果的影響。各因素變化范圍為脫氟反應(yīng)pH 3.0，4.0，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，9.0，10.0；氫氧化鈣添加量0.1%，0.3%，0.5%，0.8%，1.0%，1.5%；反應(yīng)溫度4，25，30，35，40，45，50 ℃；反應(yīng)時(shí)間15，30，45，60，75，90，120 min。

1.9 正交優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素的基礎(chǔ)上，兼顧酶解液的蛋白損失情況，固定脫氟反應(yīng)的pH為6.5，選擇氫氧化鈣添加量(A)、反應(yīng)時(shí)間(B)、反應(yīng)溫度(C)進(jìn)行三因素三水平正交優(yōu)化試驗(yàn)，因素設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal array design

1.10 脫氟前后酶解液營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)

參考GB/T 5009.124-2003對(duì)最優(yōu)條件下脫氟前后酶解液的氨基酸組成進(jìn)行分析。待測(cè)樣品通過(guò)6 mol/L的鹽酸在(110±1) ℃恒溫干燥箱中水解22 h后取出冷卻，然后過(guò)濾，取1 mL濾液揮干后加入1 mL去離子水溶解后蒸干，反復(fù)3次，最后加入4 mL pH 2.2緩沖溶液溶解后供氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定其氨基酸組成。

1.11 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)重復(fù)3次，試驗(yàn)結(jié)果采用Excel軟件進(jìn)行處理，SPSS 19.0進(jìn)行正交優(yōu)化設(shè)計(jì)和顯著性分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 脫氟劑的篩選

目前成熟的脫氟方法主要集中在廢水治理和飲用水處理方面[13]，在參考相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上考察了不同的脫氟劑對(duì)南極磷蝦酶解液氟脫除效果的影響，同時(shí)與氟化鈉溶液的脫氟效果進(jìn)行比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。

a.脫氟劑在氟化鈉溶液中脫氟效果比較a.Defluorination of sodium fluoride aqueous solution using different fluoride removal agents

b.脫氟劑在南極磷蝦酶解液中脫氟效果比較b.Defluorination of Antarctic krill protein hydrolysate using different fluoride removal agents圖1 脫氟劑的篩選Fig.1 Selection of fluoride removal agents

由圖1中a可知，在氟化鈉溶液中，氯化鈣脫氟效果最好，脫氟率高達(dá)94.92%。其次為聚合氯化鋁，脫氟率為43.38%?；钚蕴棵摲Ч患眩摲蕛H為7.39%，這可能是因?yàn)榛钚蕴棵摲頌榧兇獾奈锢砦剑瑢?duì)氟離子的吸附選擇性不高。陳紅紅等的研究表明改性后的人造沸石脫氟率可達(dá)91.56%，本實(shí)驗(yàn)的人造沸石除氟能力不強(qiáng)，可能是因?yàn)闆](méi)有對(duì)其進(jìn)行改性處理導(dǎo)致的。南極磷蝦外殼氟含量高達(dá)3828～4278 mg/kg，幾丁質(zhì)是南極磷蝦外殼的主要成分之一，因此我們也研究了幾丁質(zhì)及其脫乙?；a(chǎn)物——?dú)ぞ厶堑某芰ΑＳ蓤D1中a可知它們的脫氟效果都很差，脫氟率分別為7.39%和3.65%。可見(jiàn)南極磷蝦的富氟特性主要不是由幾丁質(zhì)的吸附作用造成的，這也與Wang等[14]的研究推論相一致。

由圖1中b可知，在南極磷蝦酶解液中，聚合氯化鋁的脫氟效果最好，脫氟率高達(dá)93.96%，脫氟后酶解液含氟量?jī)H為2.21 mg/kg，略高于NY 5073-2006氟限量標(biāo)準(zhǔn)。氯化鈣的脫氟效果次之，脫氟率為76.84%，脫氟后酶解液氟含量為8.46 mg/kg。人造沸石和氧化鎂有一定脫氟效果，脫氟率分別為29.94%和21.12%，而幾丁質(zhì)則完全沒(méi)有脫氟效果。比較圖1中a和b可知，脫氟劑在不同體系中的除氟效果有明顯差異，這可能是因?yàn)榕c氟化鈉溶液相比，酶解液成分更復(fù)雜，游離氨基酸、小分子肽、無(wú)機(jī)鹽等物質(zhì)會(huì)對(duì)脫氟劑除氟效果有影響。

盡管聚合氯化鋁脫氟效果最好，但實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)其在酶解液中有較大殘留，考慮到鋁鹽的毒害作用，聚合氯化鋁不宜用作AKPHs的脫氟劑。氯化鈣能有效降低酶解液氟含量，這主要是因?yàn)槠涿摲頌镃a2++2F-=CaF2↓?？梢?jiàn)鈣鹽具有較好的脫氟效果，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中本文將深入研究不同鈣鹽(包括有機(jī)鈣和無(wú)機(jī)鈣)的脫氟能力。

2.2 鈣鹽的篩選

a.鈣鹽在氟化鈉溶液中脫氟效果比較a.Defluorination of sodium fluoride aqueous solution using calcium materials

b.鈣鹽在南極磷蝦酶解液中脫氟效果比較b.Defluorination of Antarctic krill protein hydrolysate using different calcium materials圖2 鈣鹽脫氟能力的比較Fig.2 Comparison of the fluoride removal ability of calcium materials

鈣鹽具有良好的除氟效果，其除氟能力與鈣鹽的類型有關(guān)。由圖2中a可知，在氟化鈉溶液中，無(wú)機(jī)鈣的脫氟能力普遍優(yōu)于有機(jī)鈣。除了碳酸鈣和磷酸二氫鈣脫氟效果非常差，其他的無(wú)機(jī)鈣鹽的脫氟率均超過(guò)85%，其中磷酸氫鈣的脫氟效果最好，脫氟率高達(dá)99.42%，脫氟后水中氟含量?jī)H為0.29 mg/kg。有機(jī)鈣鹽中，乙酸鈣的脫氟率高達(dá)88.35%；D-泛酸鈣和乳酸鈣脫氟效果較好，脫氟率分別為53.54% 和36.25%；葡萄糖酸鈣脫氟效果非常差，而檸檬酸鈣則基本沒(méi)有脫氟能力。

由圖2中b可知，在南極磷蝦酶解液中，無(wú)機(jī)鈣鹽間的脫氟能力有差異明顯，而有機(jī)鈣鹽間的脫氟能力相差不大。無(wú)機(jī)鈣鹽中，氫氧化鈣的脫氟效果最好，脫氟率為71.28%；其次為氧化鈣，脫氟率為70.12%；氯化鈣有一定脫氟效果，其脫氟率為60.60%。李紅艷和呂麗萍對(duì)酶解液進(jìn)行脫氟處理選擇的鈣鹽分別為氯化鈣和生石灰，通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化后的脫氟率可達(dá)89.43%和88.25%。磷酸鈣鹽中，磷酸三鈣對(duì)酶解液的脫氟率為41.49%，而磷酸氫鈣和磷酸二氫鈣則基本沒(méi)有脫氟效果，脫氟率僅為2.17%。有機(jī)鈣普遍具有較好的脫氟能力，它們的脫氟率都大于50%，其中乙酸鈣的脫氟效果最好，脫氟率為59.01%，脫氟酶解液氟含量?jī)H為17.93 mg/kg；而葡萄酸鈣的脫氟能力最弱，脫氟率為50.05%，脫氟酶解液氟殘留量為21.85 mg/kg。

比較圖2中a和b可知，鈣鹽在不同體系中的除氟效果有明顯差異。與在氟化鈉溶液中的脫氟效果相比，無(wú)機(jī)鹽對(duì)酶解液的脫氟能力明顯變?nèi)?，而有機(jī)鈣的脫氟能力普遍有所增強(qiáng)(除了乙酸鈣)。綜上，選擇脫氟效果最好的氫氧化鈣作為南極磷蝦酶解液的脫氟劑。

2.3 氫氧化鈣脫氟工藝研究

選擇氫氧化鈣作為酶解液的脫氟試劑，考慮到南極磷蝦的鈣、磷分布與氟具有明顯相關(guān)性[15]，而氟磷酸鈣Ca5(PO4)3F是自然界中溶解度最小的化合物之一，溶度積遠(yuǎn)比氟化鈣小(僅為1.44×10-119)[16]，所以本文探討使用氫氧化鈣和磷酸來(lái)降低酶解液氟含量的可行性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 氫氧化鈣脫氟方法比較Table 2 Comparison of defluorination efficiency using calcium hydroxide

注：工藝A不調(diào)節(jié)脫氟反應(yīng)pH；工藝B使用濃鹽酸調(diào)節(jié)脫氟反應(yīng)pH為7.0；工藝C使用磷酸溶液(1+5)調(diào)節(jié)脫氟反應(yīng)pH為7.0；同一列數(shù)據(jù)標(biāo)記不同字母表示結(jié)果間存在顯著性差異(P<0.05)。

由表2可知，在氟化鈉溶液中，與A工藝相比， B工藝的脫氟率僅為29.83%；而C工藝脫氟率則提高到97.53%。在南極磷蝦酶解液中，B工藝的脫氟率為85.47%；而C工藝的脫氟率則高達(dá)98.68%，其脫氟酶解液氟含量?jī)H為0.54 mg/kg，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于GB 2762-2005和NY 5073-2006氟限量標(biāo)準(zhǔn)。C工藝的脫氟效果與A，B工藝相比有明顯差異，這可能是因?yàn)樗鼈兊拿摲聿煌瑢?dǎo)致的。A，B工藝的脫氟原理為Ca2++2F-=CaF2↓。CaF2溶度積為3.95×10-11，18 ℃時(shí)溶解度為16.3 mg/L，以氟計(jì)算其在水中溶解度也大約有8 mg/kg，因而很難通過(guò)形成CaF2沉淀將氟含量降低到2 mg/kg以下[17]。而使用磷酸調(diào)節(jié)pH時(shí)，磷酸能夠與氫氧化鈣發(fā)生反應(yīng)，生成磷酸鈣、羥基磷酸鈣(HAP)等有明顯脫氟作用的化合物[18,19]，這些物質(zhì)以及氫氧化鈣能夠有效吸附氟離子，或者通過(guò)與酶解液中的氟發(fā)生反應(yīng)形成氟磷酸鈣、氟化鈣等難溶化合物，從而有效地降低氟含量。畢華銀等在對(duì)水進(jìn)行降氟實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，在pH 6.2～7.5時(shí)，向高氟水中按比例加入Ca2+和PO43+可以將水中的氟含量降低到0.8 mg/L以下。Gogoi等[20]首先向含氟水溶液中加入稀磷酸，然后使用石灰石對(duì)其進(jìn)行吸附，水中的氟含量可由0.526 mmol/L(10 mg/L)降低到0.50～52.6 μmol/L(0.0095～1 mg/L)。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明C工藝具有降低南極磷蝦酶解液氟含量的可行性，因此選擇C工藝對(duì)南極磷蝦酶解液進(jìn)行脫氟研究。

2.4 單因素試驗(yàn)

選擇氫氧化鈣作為脫氟劑，磷酸溶液調(diào)節(jié)脫氟反應(yīng)的pH，反應(yīng)pH、氫氧化鈣添加量、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)南極磷蝦酶解液脫氟效果的影響見(jiàn)圖3。

a.反應(yīng)pH對(duì)脫氟效果的影響a.Effect of reaction pH on the defluorination

b.氫氧化鈣添加量對(duì)脫氟效果的影響b.Effect of calcium hydroxide amount on the defluorination

c.反應(yīng)溫度對(duì)脫氟效果的影響c.Effect of reaction temperature on the defluorination

d.反應(yīng)時(shí)間對(duì)脫氟效果的影響d.Effect of reaction time on the defluorination圖3 單因素對(duì)南極磷蝦酶解液脫氟效果的影響Fig.3 Effect of single factor on the defluorination of Antarctic krill protein hydrolysate

注：固定因素水平為氫氧化鈣添加量1%，反應(yīng)pH 7.0，反應(yīng)時(shí)間1 h，反應(yīng)溫度40 ℃。

由圖3中a可知，隨著反應(yīng)pH的升高，脫氟南極磷蝦酶解液的氟含量呈現(xiàn)先下降后恒定然后升高的趨勢(shì)。反應(yīng)pH在3.0～5.0時(shí)脫氟效率并不高，這可能是因?yàn)樵谒嵝詶l件下，酶解液中的氟離子容易與氫離子反應(yīng)形成HF，導(dǎo)致溶液中氟離子濃度下降。在反應(yīng)pH為5.5～7.0時(shí)脫氟效率明顯提高，脫氟率超過(guò)99%，脫氟后酶解液氟含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于2 mg/kg。畢華銀等的研究表明在pH 6.2～7.5時(shí)，向高氟水中按比例加入Ca2+和PO43+可以將水中的F-降低到0.8 mg/L以下。當(dāng)反應(yīng)pH在堿性條件下時(shí)，脫氟效果明顯下降；在pH 11.0時(shí)脫氟率僅為65.45%，這可能是因?yàn)樵趬A性條件下，溶液中的Ca2+與OH-反應(yīng)形成微溶于水的Ca(OH)2導(dǎo)致Ca2+濃度有所下降。由圖3中b可知，氫氧化鈣添加量在0.1%～0.5%時(shí)，隨著添加量的增加，脫氟效率呈急劇上升趨勢(shì)；當(dāng)添加量為0.5%時(shí)，隨著添加量的進(jìn)一步增加脫氟率趨于穩(wěn)定，因此選擇0.1%～0.5%作為添加量的最優(yōu)范圍。由圖3中c可知，在4 ℃條件下，脫氟率僅為95.36%，脫氟酶解液氟含量為1.9 mg/kg。當(dāng)反應(yīng)溫度提高到25 ℃時(shí)，脫氟效率明顯提高到99.18%，酶解液氟含量降低到0.34 mg/kg。隨著溫度的進(jìn)一步提高，脫氟率增加趨勢(shì)不明顯。由此可見(jiàn)，氫氧化鈣-磷酸脫氟法是一個(gè)吸熱反應(yīng)，適當(dāng)提高反應(yīng)溫度可以提高脫氟效率。但考慮到過(guò)高的反應(yīng)溫度可能會(huì)對(duì)酶解液的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和生理活性造成損失，選擇40 ℃作為最適反應(yīng)溫度。由圖3中d可知，反應(yīng)30 min后就已經(jīng)有較好的脫氟效果，此時(shí)的脫氟率為99.21%。隨著反應(yīng)時(shí)間的進(jìn)行，脫氟率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間增加到120 min時(shí)，脫氟效率反而略有下降。為避免脫氟時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致微生物的生長(zhǎng)繁殖消耗酶解液的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)考慮脫氟效果，選擇60 min作為最佳反應(yīng)時(shí)間。

2.5 正交優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素的基礎(chǔ)上，選擇對(duì)脫氟效果影響較大的氫氧化鈣添加量、反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度作為試驗(yàn)因素，兼顧蛋白損失情況對(duì)南極磷蝦酶解液脫氟工藝進(jìn)行正交優(yōu)化，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果與極差分析Table 3 Results of orthogonal experiment and range analysis

續(xù) 表

由表3的極差分析結(jié)果可知，不管對(duì)于脫氟率還是蛋白損失率，極差的大小排序均為A>B>C，說(shuō)明氫氧化鈣添加量對(duì)脫氟率和蛋白損失率的影響最大，其次為反應(yīng)時(shí)間，而反應(yīng)溫度的影響最小。由k值結(jié)果可知，脫氟率最高的較優(yōu)組合為A3B3C3，蛋白損失率最低的較優(yōu)組合為A1B1C2。

對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，見(jiàn)表4。

表4 正交試驗(yàn)方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiment

注：F0.01(2,2)=99.00， F0.05(2,2)=19.00。

由表4可知，對(duì)于脫氟率而言，F(xiàn)(A)>F0.01(2,2)=99>F(B)>F(C)，說(shuō)明氫氧化鈣添加量對(duì)脫氟率有極顯著性影響(P<0.01)，而反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度對(duì)脫氟率影響不顯著(P>0.05)。對(duì)于蛋白損失率而言，F(xiàn)(A )>F0.05(2,2)=19>F(B)>F(C)，說(shuō)明氫氧化鈣添加量對(duì)蛋白損失率有顯著性影響(P<0.05)，而反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度對(duì)蛋白損失率影響不顯著(P>0.05)。因此，為了能夠?qū)⒚附庖旱姆鷿舛冉档偷? mg/kg以下，氫氧化鈣添加量應(yīng)該要盡量大，氫氧化鈣添加量選擇3水平。為了減少酶解液蛋白損失情況，同時(shí)兼顧效率和脫氟成本，反應(yīng)溫度選擇2水平，反應(yīng)時(shí)間選擇2水平。綜上，南極磷蝦酶解液的最佳脫氟工藝為A3B2C2，即氫氧化鈣添加量0.5%，反應(yīng)時(shí)間60 min，反應(yīng)溫度40 ℃，但是該條件在上述正交表中沒(méi)有出現(xiàn)，需要進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

采用上述的最優(yōu)工藝條件，驗(yàn)證試驗(yàn)的結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 南極磷蝦酶解液脫氟工藝驗(yàn)證試驗(yàn)Table 5 Validation of orthogonal experiment for defluorination of Antarctic krill protein hydrolysates

由表5可知，最優(yōu)條件下脫氟率高達(dá)99.27%，脫氟效果優(yōu)于目前已知的文獻(xiàn)報(bào)道，脫氟后南極磷蝦酶解液的氟含量從41.07 mg/kg 降低到0.30 mg/kg，符合NY 5073-2006的氟限量標(biāo)準(zhǔn)；蛋白損失率和氨氮損失率分別為8.57%和8.26%，說(shuō)明脫氟處理對(duì)酶解液的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值損失較少。

2.7 脫氟前后酶解液營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)

為了進(jìn)一步了解本文的脫氟工藝對(duì)南極磷蝦酶解液營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的影響，對(duì)脫氟前后酶解液的氨基酸組成進(jìn)行分析，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 脫氟前后南極磷蝦酶解液的氨基酸組成分析Table 6 Effect of defluorination on the amino acid composition of Antarctic krill hydrolysates

由表6可知，南極磷蝦酶解液氨基酸種類齊全，含有人體所需的所有氨基酸和必需氨基酸(色氨酸被強(qiáng)酸破壞未檢出)。脫氟后，酶解液的酪氨酸和胱氨酸損失明顯，它們的損失比例分別為59.38%和34.62%。除了酪氨酸、胱氨酸和苯丙氨酸，酶解液中的其他氨基酸損失比例均在5%以下。根據(jù) FAO/WHO理想蛋白質(zhì)推薦模式，優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的必需氨基酸與總氨基酸的比值(EAA/TAA)應(yīng)該在 40%左右，必需氨基酸與非必需氨基酸的比值(EAA/NEAA)在 60%以上。脫氟后，酶解液的EAA/TAA和EAA/NEAA分別從41.17%和69.97%提高到了42.18%和72.94%。由表6可知，脫氟后酶解液的總氨基酸僅損失5.03%，必需氨基酸僅損失2.71%，可見(jiàn)脫氟處理后酶解液中的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值損失少。

2.8 討論

南極磷蝦酶解液營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，具有抗氧化、抑制有害菌、預(yù)防骨質(zhì)疏松、降血壓等生理活性，但由于其氟含量比較高，相關(guān)的脫氟工作一直是研究的熱點(diǎn)。目前關(guān)于南極磷蝦酶解液的脫氟研究已有很多報(bào)道，例如李紅艷等利用電滲析法和納濾法對(duì)南極磷蝦酶解液進(jìn)行脫氟處理，盡管取得良好的脫氟效果，但是酶解液氨氮損失率均超過(guò)10%，蛋白損失率均超過(guò)15%，此外這些設(shè)備較為昂貴，成本高。郭帆等使用乳酸鈣和活性氧化鋁混合物對(duì)酶解液進(jìn)行脫氟處理，脫氟率高達(dá)93.98%，氨基酸損失率僅為3.49%，但是鋁鹽對(duì)人體有害，因而該工藝安全性不高。呂傳萍等利用生石灰對(duì)酶解液進(jìn)行脫氟，但是生石灰溶解度低，而且生石灰溶于水會(huì)放出大量的熱，會(huì)對(duì)酶解液的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和生理活性產(chǎn)生不良影響，遠(yuǎn)不如使用氫氧化鈣作為脫氟劑。與目前文獻(xiàn)已報(bào)道的南極磷蝦酶解液脫氟方法相比，本脫氟工藝具有脫氟效果好、操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)條件溫和、成本低、酶解液營(yíng)養(yǎng)價(jià)值損失少等優(yōu)點(diǎn)，可為低氟南極磷蝦產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)指導(dǎo)。

3 結(jié)論

反應(yīng)體系會(huì)對(duì)脫氟劑的脫氟效果有明顯影響。與氟化鈉溶液相比，南極磷蝦酶解液成分復(fù)雜，多肽、游離氨基酸、無(wú)機(jī)鹽離子等組分會(huì)影響其脫氟效果。

聚合氯化鋁對(duì)南極磷蝦酶解液的脫氟效果最好，脫氟率高達(dá)93.96%，而幾丁質(zhì)則完全沒(méi)有脫氟效果。鈣鹽的類型對(duì)酶解液的氟脫除效果有很大影響，無(wú)機(jī)鈣鹽對(duì)酶解液的脫氟效果差異很大，其中氫氧化鈣脫氟效果最好，脫氟率為71.28%，而磷酸一氫鈣的脫氟效果最差，脫氟率僅為2.17%；有機(jī)鈣鹽對(duì)酶解液普遍具有較好的脫氟效果，它們的脫氟率均超過(guò)50%。

氫氧化鈣作為脫氟劑時(shí)，使用磷酸來(lái)調(diào)節(jié)脫氟反應(yīng)的pH能夠?qū)⒚附庖悍拷档偷? mg/kg以下。正交試驗(yàn)優(yōu)化得到的最佳脫氟工藝為氫氧化鈣添加量0.5%，反應(yīng)pH 6.5，反應(yīng)時(shí)間60 min，反應(yīng)溫度40 ℃，此時(shí)的脫氟率高達(dá)99.27%，脫氟后酶解液氟含量?jī)H為0.30 mg/kg，蛋白損失率和氨氮損失率分別為8.57%和8.26%。盡管脫氟后酪氨酸和胱氨酸損失嚴(yán)重，但是酶解液的總氨基酸和必需氨基酸分別僅下降5.07%和2.71%。本脫氟工藝具有操作時(shí)間短、反應(yīng)條件溫和、成本低、酶解液營(yíng)養(yǎng)價(jià)值損失少等優(yōu)點(diǎn)，可為低氟南極磷蝦產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)指導(dǎo)。

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