周文斯，熊犍，鄭雪君，陳智光，王海萍，崔春*

(1.華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣州 510640；2.廣東真美食品股份有限公司，廣東 潮州 515637)

高濃技術(shù)是指在發(fā)酵或酶解過程中通過提高底物濃度、降低體系水分含量，從而提高單位設(shè)備生產(chǎn)效率、節(jié)約資源能源的一種新型綠色技術(shù)[1]。高濃蛋白酶解技術(shù)具有許多優(yōu)點(diǎn)：顯著提高了生產(chǎn)設(shè)備利用率，提升了單位設(shè)備的產(chǎn)能；單位產(chǎn)品產(chǎn)生廢水更少，廢水治理成本低；酶解產(chǎn)物的濃縮、干燥所耗能量更低。以生產(chǎn)水解度為4.5%的改性小麥面筋蛋白為例，當(dāng)酶解體系的固形物濃度從10%提高到40%時(shí)，單位重量改性面筋蛋白所需水的消耗和濃縮能耗分別降低6倍和5.97倍，單位體積酶解罐的產(chǎn)能提高3.97倍[2]。因此，高濃蛋白酶解技術(shù)在食品工業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用前景。本文將酶解液中固形物濃度超過20%或以上稱為高濃體系。

然而，高濃蛋白酶解體系中，不溶性酶解殘?jiān)济附怏w系的比例顯著增加，常規(guī)的離心或稀釋處理可能導(dǎo)致水解度和蛋白回收率測(cè)定產(chǎn)生較大誤差。此外，高濃蛋白酶解體系中蛋白質(zhì)的溶解度和聚集狀態(tài)發(fā)生較大變化[3，4]，其酶切位點(diǎn)和酶解工藝可能與常濃蛋白酶解體系有較大差異。

因此，本實(shí)驗(yàn)擬以大豆分離蛋白為原料，優(yōu)化了高濃蛋白酶解體系中水解度和蛋白回收率的測(cè)定方法，并通過酶種類、pH、溫度和加酶量單因素試驗(yàn)，結(jié)合感官評(píng)價(jià)，對(duì)高濃大豆分離蛋白酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為高濃大豆蛋白酶解的產(chǎn)業(yè)化提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

1.1.1.1 材料

大豆分離蛋白 山東香馳豆業(yè)科技有限公司；氫氧化鈉(分析純) 天津市明亮化學(xué)試劑廠；鹽酸(分析純) 廣東省東紅化工廠；硼酸(分析純) 天津市福晨化學(xué)試劑廠；硫酸(分析純) 江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司；甲醛(分析純) 廣東光華化學(xué)有限公司；硫酸鉀、溴甲酚綠、甲基紅(分析純) 廣州市金華大化學(xué)試劑有限公司。

1.1.1.2 酶制劑

復(fù)合蛋白酶(食品級(jí))、堿性蛋白酶(食品級(jí))、風(fēng)味蛋白酶(食品級(jí)) 北京諾維信酶制劑公司；中性蛋白酶(食品級(jí)) 杰能科生物工程有限公司；酸性蛋白酶(PR23食品級(jí)) 廣東裕力寶酶制劑公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

PHS-3E數(shù)顯pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；GL-21M高速冷凍離心機(jī) 湘儀離心機(jī)儀器有限公司；101A-2數(shù)顯電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海浦東躍欣科學(xué)儀器廠；Sartotius BP211D分析天平 中科院廣州化學(xué)研究院；KND-2C定氮儀、KDN-40消化爐 上海纖檢儀器有限公司；THZ-82A 水浴恒溫振蕩器 金壇市華城開元實(shí)驗(yàn)儀器廠；磁力攪拌器 國華電器有限公司。

1.2 檢測(cè)與分析方法

1.2.1 水解度的測(cè)定方法

配制pH為3.5的大豆分離蛋白溶液100 g，濃度分別為8%，16%，24%，32%，添加底物質(zhì)量1%的酸性蛋白酶(PR23)，磁力攪拌均勻。在55 ℃下分別酶解8，18，48 h，沸水浴20 min滅酶。酶解物的總氮含量為TN，采用以下4種預(yù)處理方法并測(cè)定水解度：

直接測(cè)定酶解物的氨基酸態(tài)氮含量AN1；分別將濃度為16%，24%，32%的酶解物稀釋到8%，測(cè)定稀釋后酶解物的氨基酸態(tài)氮含量AN2；酶解物經(jīng)6000 g離心15 min，過濾后獲得上清液，測(cè)定上清液的氨基酸態(tài)氮含量AN3；分別將濃度為16%，24%，32%的酶解物稀釋到8%，6000 g離心15 min，過濾后獲得上清液，測(cè)定上清液的氨基酸態(tài)氮含量AN4。水解度的測(cè)定參考Cui等的方法[5]，總氮含量的測(cè)定采用凱氏定氮法(參照GB 5009.5-2010)，氨基酸態(tài)氮含量的測(cè)定采用甲醛滴定法。

1.2.2 蛋白回收率的測(cè)定方法

同1.2.1的方法，配制pH為3.5，不同濃度不同酶解時(shí)間的大豆分離蛋白溶液。原料總蛋白含量為M，采用以下2種預(yù)處理方法并測(cè)定蛋白回收率：

酶解物經(jīng)離心、過濾后獲得上清液，測(cè)定上清液的總蛋白含量為M1=上清液總氮×上清液質(zhì)量；

分別將濃度為16%，24%，32%的酶解物稀釋到8%，離心、過濾后獲得上清液，測(cè)定上清液的總蛋白含量為M2=上清液總氮×上清液質(zhì)量。

參考賈愛娟[6]的方法并稍做修改。采用凱氏定氮法分別測(cè)定上清液和原料中蛋白質(zhì)的含量。

1.3 高固形物濃度酶解工藝優(yōu)化

1.3.1 高固形物濃度酶解工藝中酶的篩選

配制底物濃度為32%，質(zhì)量為100 g的大豆分離蛋白溶液5份。選取5種商業(yè)蛋白酶，分別調(diào)節(jié)pH和溫度至各種酶的最適條件(風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶和中性蛋白酶的最適條件為50 ℃，pH 7.0，酶解時(shí)間8 h，加酶量1%；堿性蛋白酶的最適條件為55 ℃，pH 8.0，酶解時(shí)間8 h，加酶量1%；酸性蛋白酶(PR23)的最適條件為55 ℃，pH 3.5，酶解時(shí)間8 h，加酶量1%)，磁力攪拌均勻后酶解8 h，沸水浴20 min滅酶，分別稀釋至濃度為8%，測(cè)定其水解度和蛋白回收率。

1.3.2 高固形物濃度酶解工藝中pH、溫度和加酶量的確定

配制底物濃度為32%，質(zhì)量為100 g的大豆分離蛋白溶液10份，分別在pH為2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0條件下(溫度為55 ℃，加酶量為底物重量的1%)；在40，45，50，55，60 ℃條件下(pH 3.5，加酶量為底物重量的1%)；分別添加底物質(zhì)量0.2%，0.5%，1%，1.5%，2%的商業(yè)蛋白酶(溫度為55 ℃)；磁力攪拌均勻后酶解8 h，沸水浴20 min滅酶，分別稀釋至濃度為8%，測(cè)定其水解度和蛋白回收率。

1.3.3 最優(yōu)酶解工藝制備大豆鮮味基料的感官評(píng)價(jià)

感官評(píng)價(jià)法是對(duì)呈味物質(zhì)分析最常用的方法[7]。本實(shí)驗(yàn)使用定量描述分析(QDA)方法，在(23±2) ℃的感官評(píng)定室進(jìn)行評(píng)定。采用兩種配方，分別是0.1%酶解物直接評(píng)價(jià)和0.1%酶解物+0.3%食鹽調(diào)配，用飲用水配制成100 mL溶液。每個(gè)樣品溶液取10 mL盛放在杯中，鑒評(píng)員將溶液全部浸入口中，并保持10 s左右的時(shí)間，然后吐出。感官評(píng)價(jià)使用線性圖形標(biāo)度，0～9分制(無感覺-閾值感覺-微弱-中等-強(qiáng)烈)，定量描述分析結(jié)果用雷達(dá)圖表示[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 高固形物濃度酶解體系中水解度和蛋白回收率預(yù)處理方法的建立

水解度(degree of hydrolysis, DH)是指蛋白質(zhì)分子在水解過程中被斷裂的肽鍵數(shù)和原料中總肽鍵數(shù)的百分比[9]。在蛋白質(zhì)水解度的測(cè)定上，國際上普遍采用的預(yù)處理方法是離心或過濾處理[10，11]。

本實(shí)驗(yàn)將濃度為8%，16%，24%，32%的大豆分離蛋白溶液分別進(jìn)行8 h(輕度)，18 h(中度)，48 h(深度)不同程度的酶解，采用4種不同預(yù)處理方法處理大豆蛋白水解物并測(cè)定酶解物的水解度，結(jié)果見圖1。

圖1 預(yù)處理方法對(duì)不同濃度大豆蛋白酶解液的水解度的影響Fig.1 Influence of different pretreatments on DH of SPI for different concentration

注：DH分別隨酶解時(shí)間8 h(a)，18 h(b)，48 h(c)的變化趨勢(shì)。

由圖1(a，b，c)可知，隨著酶解時(shí)間的延長，大豆蛋白的水解度越高。在水解度的測(cè)定方面，不離心直接測(cè)定和稀釋到8%測(cè)定酶解物水解度的結(jié)果基本一致，而采用離心處理后水解度顯著降低，且固形物濃度越高，離心預(yù)處理造成的誤差越大。推測(cè)是由于固形物濃度較高時(shí)，酶解物離心后殘留渣較多，而殘?jiān)斜Ａ粢徊糠钟坞x氨基酸和寡肽導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏低。而稀釋后離心處理可有效降低殘留在殘?jiān)邪钡?，從而縮小測(cè)定值差距。上述結(jié)果表明：離心處理后所測(cè)的不同濃度下蛋白水解度不能反映其真實(shí)水解效果，因此本實(shí)驗(yàn)選取不離心直接測(cè)酶解物的方法作為高濃酶解物水解度測(cè)定的預(yù)處理方法。

采用兩種不同預(yù)處理方法處理大豆蛋白水解物并測(cè)定酶解物的蛋白回收率，結(jié)果見圖2。

圖2 預(yù)處理方法對(duì)不同濃度大豆蛋白酶解液的蛋白回收率的影響Fig.2 Influence of different pretreatments on protein recovery of SPI for different concentration

蛋白回收率表示原料中的蛋白質(zhì)經(jīng)生物酶分解作用后，酶解液上清液中的蛋白總量占原料中的蛋白總量的百分比，即原料中的蛋白質(zhì)被分解回收的程度。由圖2可知，直接離心測(cè)定的蛋白質(zhì)回收率測(cè)定結(jié)果偏低，而稀釋到8%再離心測(cè)定的蛋白回收率更接近準(zhǔn)確值。這是由于固形物濃度較高時(shí)，蛋白質(zhì)分子容易發(fā)生聚集反應(yīng)，因此降低了可溶蛋白質(zhì)含量。因此，本實(shí)驗(yàn)選取稀釋到8%再離心酶解物的方法作為高濃酶解物蛋白回收率測(cè)定的預(yù)處理方法。經(jīng)相關(guān)性分析，水解度(直接測(cè)定)和蛋白回收率(稀釋離心)的相關(guān)系數(shù)r=0.773，相關(guān)性極顯著(P<0.01)，兩個(gè)指標(biāo)存在很強(qiáng)的相關(guān)性。在相同水解條件下，水解度越高，蛋白回收率越高。

2.2 高固形物濃度酶解工藝的優(yōu)化

以大豆分離蛋白為原料，以水解度和蛋白回收率為指標(biāo)，通過酶種類、pH、溫度和加酶量單因素試驗(yàn)，結(jié)合感官評(píng)價(jià)，對(duì)高濃大豆分離蛋白酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化。

2.2.1 不同商業(yè)蛋白酶對(duì)高濃大豆分離蛋白酶解效率的影響

大豆分離蛋白經(jīng)控制酶解后可產(chǎn)生氨基酸和呈味肽，一般經(jīng)驗(yàn)表明，水解度越高，大豆蛋白酶解物的呈味強(qiáng)度越高。本試驗(yàn)對(duì)各種商業(yè)蛋白酶的水解效率進(jìn)行了評(píng)價(jià)，從而篩選出適用大豆蛋白水解的最佳酶制劑。不同商業(yè)蛋白酶對(duì)高濃大豆分離蛋白溶液水解的效果見圖3。

圖3 不同商業(yè)蛋白酶對(duì)高濃大豆分離蛋白溶液水解效率的影響Fig.3 Influence of different proteases on hydrolysis degree of high-concentration SPI

由圖3可知，5種商業(yè)蛋白酶對(duì)高濃大豆分離蛋白溶液均產(chǎn)生了不同程度的水解，其中酸性蛋白酶(PR23)、堿性蛋白酶、風(fēng)味酶的效果較為明顯，其中酸性蛋白酶(PR23)水解度最高，風(fēng)味酶次之，分別達(dá)到12.98%和10.24%，其他3種酶均低于8%。堿性蛋白酶蛋白回收率最高，酸性蛋白酶(PR23)和風(fēng)味蛋白酶次之，分別達(dá)到52.97%，50.28%和50.27%，其他兩種酶均低于50%。綜合考慮水解度和蛋白回收率這兩個(gè)指標(biāo)，選擇酸性蛋白酶(PR23)進(jìn)一步研究。

2.2.2 不同pH對(duì)高濃大豆分離蛋白酶解效率的影響

不同pH酸性蛋白酶(PR23)對(duì)高濃大豆分離蛋白酶解的影響見圖4。

圖4 不同pH值對(duì)酸性蛋白酶(PR23)酶解高濃大豆分離蛋白的影響Fig.4 Influence of different pH on hydrolysis degree of high-concentration SPI enzymatic hydrolyzed by acid protease(PR23)

pH是影響蛋白體系酶解效率的重要因素之一，影響酶分子的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和底物的解離，從而影響酶解效率[12，13]。由圖4可知，當(dāng)pH從2.5上升到3.5時(shí)，水解度和蛋白回收率隨之增大，當(dāng)pH繼續(xù)升高時(shí)，兩指標(biāo)反而下降。蛋白體系pH為3.5時(shí)，水解度和蛋白回收率分別達(dá)到13.00%和50.45%，為酸性蛋白酶(PR23)的最適pH值。

2.2.3 不同溫度對(duì)高濃大豆分離蛋白酶解效率的影響

不同溫度酸性蛋白酶(PR23)對(duì)高濃大豆分離蛋白酶解的影響見圖5。

圖5 不同溫度對(duì)酸性蛋白酶(PR23)酶解高濃大豆分離蛋白的影響Fig.5 Influence of different temperatures on hydrolysis degree of high-concentration SPI enzymatic hydrolyzed by acid protease(PR23)

蛋白酶作用都有一個(gè)最適溫度范圍，溫度過低不利于酶解，溫度過高酶失活。由圖5可知，當(dāng)反應(yīng)溫度從40 ℃上升到55 ℃時(shí)，水解度和蛋白回收率隨之增大，當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí)，兩指標(biāo)反而下降。蛋白體系反應(yīng)溫度為55 ℃時(shí)，水解度和蛋白回收率分別達(dá)到13.01%和54.71%，為酸性蛋白酶(PR23)的最適反應(yīng)溫度。

2.2.4 不同加酶量對(duì)高濃大豆分離蛋白酶解效率的影響

不同酶用量酸性蛋白酶(PR23)對(duì)高濃大豆分離蛋白酶解的影響見圖6。

圖6 不同加酶量對(duì)酸性蛋白酶(PR23)酶解高濃大豆分離蛋白的影響Fig.6 Influence of different protease amount on hydrolysis degree of high-concentration SPI enzymatic hydrolyzed by acid protease(PR23)

在酶解反應(yīng)過程中，當(dāng)酶濃度較低時(shí)，體系反應(yīng)速度隨著酶濃度的升高而加快，但當(dāng)酶達(dá)到一定濃度時(shí)，酶自身相互水解限制了酶對(duì)底物的水解作用。由圖6可知，隨著酶用量的增加，水解度和蛋白回收率不斷增大。工業(yè)生產(chǎn)的過程中，除了考慮酶解效率外，還需要考慮生產(chǎn)成本。因此，綜合考慮，選擇1%作為最適酶用量，水解度和蛋白回收率分別達(dá)到13.08%和51.13%。

2.2.5 大豆蛋白高濃酶解產(chǎn)物的感官評(píng)價(jià)

圖7 兩種配方高濃大豆分離蛋白酶解產(chǎn)物感官對(duì)比Fig.7 Comparison of two formula of SPI concentrated enzymatic hydrolysates on sensory quality results

由圖7可知，兩種配方高濃大豆分離蛋白酶解產(chǎn)物的感官評(píng)分相對(duì)差別較大。0.1%酶解物直接評(píng)價(jià)鮮味評(píng)分均為5.0，苦味評(píng)分均為5.0，酸味評(píng)分均為2.0，厚味評(píng)分均為4.0，咸味評(píng)分均為5.0；而0.1%酶解物+0.3%食鹽調(diào)配的鮮味評(píng)分均為6.0，苦味評(píng)分均為3.0，酸味評(píng)分均為1.5，厚味評(píng)分均為6.0，咸味評(píng)分均為5.0。這表明添加食鹽可顯著地降低大豆蛋白酶解物的苦味，增強(qiáng)其鮮味和厚味。

3 結(jié)論

在高濃蛋白酶解體系中，水解度測(cè)定采用不離心直接測(cè)酶解物的預(yù)處理方法，蛋白回收率測(cè)定采用稀釋離心的預(yù)處理方法較能反映真實(shí)水解效果。選擇酸性蛋白酶(PR23)在pH 3.0，溫度55 ℃，加酶量1%條件下，酶解8 h，水解度和蛋白回收率分別達(dá)到13.08%和51.13%；同時(shí)感官評(píng)價(jià)結(jié)果表明；0.1%高濃蛋白酶解物與3%食鹽進(jìn)行調(diào)配，顯著降低了苦味，增強(qiáng)了鮮味和厚味。本文可為高濃大豆分離蛋白酶解制備鮮味基料的產(chǎn)業(yè)化提供理論指導(dǎo)。

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