李 健 孫語韜 劉成波 林日強(qiáng) 鄭 煒 任培根

1(中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究與發(fā)展中心 深圳 518055)

2(中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院 生物醫(yī)學(xué)光學(xué)與分子影像研究室 深圳 518055)

1 引 言

據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國每年因創(chuàng)傷、先天性畸形、骨質(zhì)疏松和骨腫瘤等原因造成的骨缺損人數(shù)超過350 萬[1]。大范圍骨缺損的修復(fù)和功能重建一直是矯形外科、顱面外科和整形外科所共同面臨的難題，也是國內(nèi)外重大研究課題之一。

傳統(tǒng)的骨缺損治療方法包括自體骨移植、同種異體骨移植和人工骨移植等[2-4]。與傳統(tǒng)方法不同的是，骨組織工程改變了以往創(chuàng)傷修復(fù)的傳統(tǒng)模式，能以少量組織細(xì)胞修復(fù)大范圍組織缺損，并可按需塑形達(dá)到理想形態(tài)，為實(shí)現(xiàn)創(chuàng)傷修復(fù)及完美的生物學(xué)重建提供了理論和方法。這也給臨界性骨缺損的修復(fù)帶來了新的希望?；蛐揎椫Ъ茉淮傺芑怯糜谂R界性骨修復(fù)的有效途徑之一。眾所周知，骨組織工程包括 3 個(gè)關(guān)鍵因素：生長因子、生物支架材料和種子細(xì)胞[5]。其中，生物支架材料的選擇是骨組織工程的核心問題。在新骨形成之前，生物支架不僅為細(xì)胞提供黏附、生長、增殖、分化、營養(yǎng)交換、新陳代謝的空間及機(jī)械支撐，而且也是細(xì)胞外基質(zhì)分泌的空間場所，是形成新的具有一定形態(tài)和功能的組織、器官的物質(zhì)基礎(chǔ)，是決定組織工程骨能否用于臨床的關(guān)鍵[6,7]。

傳統(tǒng)方法制備的支架材料，由于內(nèi)部缺乏必要的供營養(yǎng)物質(zhì)交流的通道及可控的微孔結(jié)構(gòu)，不利于細(xì)胞和血管長入[8-12]。3D 打印作為一種新型制造技術(shù)，因具有操作簡單、支架各參數(shù)可控性高、可保持材料生物活性并可根據(jù)缺損部位的影像學(xué)掃描數(shù)據(jù)按需塑形等優(yōu)勢，而被迅速應(yīng)用于骨組織工程支架材料的成型研究[13-17]。目前大部分研究主要集中于分析 3D 打印的支架材料本身的微觀結(jié)構(gòu)、孔徑尺寸、孔隙率、機(jī)械力學(xué)強(qiáng)度，或者體外細(xì)胞生物相容性等對細(xì)胞黏附增殖的影響[18,19]。研究表明，3D 打印支架植入體內(nèi)后，其細(xì)胞存活范圍僅在血供彌散的 150～200 μm范圍內(nèi)[20]。當(dāng)移植體積大于 3mm3時(shí)，支架不能依靠組織液的彌散支持種子細(xì)胞的生存，此時(shí)必須通過血管的再生來實(shí)現(xiàn)氧和營養(yǎng)物質(zhì)的供給，否則將因?yàn)槿毖鹾蜖I養(yǎng)匱乏，種子細(xì)胞很快會壞死或凋亡導(dǎo)致移植物失效。因此，促血管化的生物支架是促進(jìn)骨組織再生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其在體內(nèi)的血管化速度及程度將決定和制約其是否能夠用于修復(fù)骨缺損治療。

目前，組織工程骨促血管生成常采用的方法是單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用促血管生成生長因子[21-23]，已在臨床及基礎(chǔ)研究中取得較多成果。在眾多生長因子中，血小板源性生長因子-BB(PDGFBB)，不但具有促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的增殖和向成骨細(xì)胞分化[24,25]的作用，同時(shí)還能夠誘導(dǎo) MSCs 的趨化[26,27]。Caplan 等[24]和 Dohle 等[28]學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，PDGF-BB 與血管生成素/tie2 及TNF-β等蛋白協(xié)同在促進(jìn)血管形成、壁細(xì)胞動員方面必不可少。此外，PDGF-BB 還能促進(jìn)周細(xì)胞動員向新生血管或向平滑肌細(xì)胞分化[29]。因此，PDGF-BB 在骨組織重建的早期、中期和后期 3 個(gè)階段均能發(fā)揮多方面的作用：成骨細(xì)胞前體細(xì)胞的動員、增殖和分化，新生骨組織健康生長所必需的血管生成等，這是目前其他常用促進(jìn)骨再生的生長因子(VEGF、bFGF、BMP-2、TGF-β)所不具備的。為了解決目前使用生長因子存在的半衰期短、生物活性低、局部濃度不易調(diào)控、價(jià)格高昂等問題[30,31]，以及大量使用成體干細(xì)胞時(shí)存在的各種問題，本文采用將含有編碼生長因子基因的載體負(fù)載到生物支架上，使其進(jìn)入體內(nèi)細(xì)胞后原位、持續(xù)表達(dá)生長因子，達(dá)到誘導(dǎo)相關(guān)細(xì)胞的增殖、遷移和分化，從而促進(jìn)缺損組織再生的目的。在本研究中，選擇慢病毒載體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。該載體具有能長期穩(wěn)定表達(dá)目的基因、高轉(zhuǎn)染率、低免疫原性、全身副作用少等優(yōu)點(diǎn)，已在多種人類疾病中做過臨床試驗(yàn)[32]，也是目前T 細(xì)胞受體療法(TCR-T)、嵌合抗原受體-T 細(xì)胞(CAR-T)等細(xì)胞基因治療中的首選治療載體。目前關(guān)于慢病毒修飾支架的研究并不多[33]，也不系統(tǒng)，基于慢病毒介導(dǎo)的基因修飾組織工程研究仍在發(fā)展中。骨缺損的修復(fù)是一個(gè)由干細(xì)胞等多種細(xì)胞驅(qū)動的組織形成的動態(tài)變化過程，其通過復(fù)雜的內(nèi)分泌、自分泌和旁分泌作用使得骨再生和血管生成得以有序發(fā)生[34]。其中，缺損區(qū)的血管再生早于骨再生，因此在沒有血液運(yùn)輸?shù)竭_(dá)的缺損區(qū)不可能有成骨活動。骨組織支架植入機(jī)體后能否成活，關(guān)鍵看其能否在早期血管化并和周圍組織建立血供，其血管化過程貫穿于整個(gè)移植修復(fù)過程。

對組織工程骨中血管化程度進(jìn)行評估的傳統(tǒng)方法包括 X-線片光密度測定、放射性核素骨顯像(ECT)、CT 灌注成像、磁共振成像(MRI)、灌注成像和經(jīng)典的組織學(xué)方法等，但這些方法均難以滿足研究的需要[35,36]。自從 1990 年，美國 Cornell 大學(xué)的 Denk 等學(xué)者將雙光子成像用于生物學(xué)觀測，它通過激發(fā)生物組織中的內(nèi)源性物質(zhì)產(chǎn)生非線性信號進(jìn)行成像，可對樣本在不被固定、染色標(biāo)定以及切片的自然狀態(tài)下進(jìn)行在體實(shí)時(shí)、連續(xù)、無創(chuàng)成像檢查，在臨床上可以作為一種快速輔助診斷技術(shù)。由于該顯微鏡具有低細(xì)胞損傷、大成像深度和可用于活細(xì)胞甚至活體組織長時(shí)間三維成像等優(yōu)點(diǎn)，很快得到廣泛的應(yīng)用[37]。此外，在相同實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，研究者還探索了光聲成像在骨組織工程中的應(yīng)用。樣品被短脈沖激光照射后會受激產(chǎn)生超聲波，這種現(xiàn)象被稱為光聲效應(yīng)。光聲成像作為一種混合型的成像方式，結(jié)合了光學(xué)成像的高對比度和光譜識別特性，以及超聲成像大穿透深度下仍具備較高分辨率的特點(diǎn)，已在臨床及生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域體現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力[38,39]。然而，運(yùn)用非線性雙光子及光聲顯微成像技術(shù)在體、實(shí)時(shí)、連續(xù)、無創(chuàng)地監(jiān)測和定量骨組織工程支架在骨缺損修復(fù)過程中的血管化進(jìn)程以及血管化程度的相關(guān)研究鮮有報(bào)道。

因此，在本研究中，我們將采用多模態(tài)雙光子-光聲顯微成像技術(shù)，通過在體、實(shí)時(shí)、連續(xù)地監(jiān)測，研究骨修復(fù)過程中多孔骨組織支架誘導(dǎo)血管化的動態(tài)過程證明基因修飾的多孔支架對在促血管生成方面的作用，建立血管再生與骨組織重建之間的偶聯(lián)相關(guān)性。該研究對組織工程支架血管化的科學(xué)研究和臨床應(yīng)用具有重要意義，可為基因修飾骨組織支架促進(jìn)臨界性骨缺損修復(fù)奠定基礎(chǔ)。

2 實(shí)驗(yàn)材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)動物 C57BL/6 小鼠，8 周齡，雄性，體重 20～25 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)由中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)(受理號 SIAT-IRB-170305-YGS-LIJ-A0313)；聚乳酸-羥基乙酸共聚物(Poly Lactic-co-Glycolic Acid，PLGA)購買于Sigma-Aldrich 公司，其中丙交酯、乙交酯比例為75∶25；1, 4-二氧六環(huán)購買于上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；PDGFB-pcDNA3.1(+)購買于北京義翹神州科技有限公司；Anti-PDGF-BB 多克隆抗體和 PDGF-BB 重組蛋白購買于 BioVision 公司；第三代慢病毒載體表達(dá)系統(tǒng)(pLP1、pLP2、pLPVSVG、pLVX-mCMV-zsGreen)由汕頭大學(xué)魏熾炬教師惠贈。除特別注明外，實(shí)驗(yàn)中用于細(xì)胞培養(yǎng)的試劑，包括 DMEM 培養(yǎng)基、DPBS(磷酸鹽緩沖液)、FBS(胎牛血清)等均購買于 Gibco 公司，質(zhì)粒去內(nèi)毒素大提試劑盒(貨號 12362)購買于 QIAGEN 公司。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 含有 pdgf-b 基因的慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建、生產(chǎn)、制備及滴度測定

通過分子克隆技術(shù)，利用EcoRI 和SpeI 限制性酶切位點(diǎn)將pdgf-b基因的 cDNA 片段插入到第三代慢病毒表達(dá)載體中，構(gòu)建新的慢病毒表達(dá)載體，用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法大量制備偽病毒顆粒[40]。在 293FT 細(xì)胞中包裝的偽病毒顆粒經(jīng)低溫高速離心沉淀培養(yǎng)基上清獲得，并利用 eGFP(增強(qiáng)型綠色熒光蛋白)報(bào)告基因檢測確定濃縮后的病毒液滴度，隨后保存于－80℃ 備用。

2.2.2 制備 3D 打印多孔支架

PLGA/nHAp 支架材料的制備工藝流程：稱取適量 PLGA 固體粉末，加入 1,4-二氧六環(huán)溶液(PLGA 和 1,4-二氧六環(huán)溶液的質(zhì)量比為 1∶20)，二者混合后磁力攪拌 4 h，充分溶解 PLGA 材料，隨后再向溶液中加入納米級 HAp(含量占混合固體質(zhì)量的 3%)，并繼續(xù)攪拌 4 h，形成均勻體系。利用 3D 打印低溫快速成型系統(tǒng)(圖1)，于－35℃下進(jìn)行直徑為 4mm 三維多孔支架的制備，完成后置于冷凍干燥機(jī)中，凍干 24 h，制備結(jié)束。

圖1 由控制系統(tǒng)和成型系統(tǒng)構(gòu)成的低溫快速 3D 打印機(jī)及打印出的 3D 支架Fig. 1 The 3D low temperature rapid prototyping printer comprised control system and molding system

2.2.3 基因修飾多孔支架的制備及體外病毒緩釋的生物活性研究

制備基因修飾支架步驟：把含有編碼pdgf-b基因的活性病毒顆粒溶液(已確定其病毒滴度)與多孔 PLGA/nHAp 支架在 37℃ 條件下共孵育 1 h，利用病毒顆粒和多孔支架中的納米羥基磷灰石(nHAp)表面之間的強(qiáng)靜電結(jié)合作用[41]，隨后洗脫支架上未結(jié)合的病毒顆粒(P洗脫)，經(jīng)低溫真空冷凍干燥，從而將慢病毒顆粒修飾固定在多孔骨組織支架的表面及內(nèi)部孔洞中，得到攜帶有基因修飾多孔支架材料。其中，未結(jié)合而被洗脫掉的病毒顆粒(P洗脫)轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞，根據(jù)慢病毒轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞的感染復(fù)數(shù)(MOI＝M)及 293T 陽性細(xì)胞(eGFP 作為報(bào)告基因)表達(dá)數(shù)量N確定P洗脫數(shù)值(P洗脫＝M×N)，進(jìn)而確定支架負(fù)載病毒顆粒數(shù)量為P結(jié)合＝P總數(shù)－P洗脫＝P總數(shù)－M×N，結(jié)合效率W＝(P總數(shù)－M×N)／P總數(shù)×100%。

慢病毒介導(dǎo)基因修飾多孔 LV-pdgfb/PLGA/nHAp 支架上的病毒顆粒體外緩釋分析及優(yōu)化：通過流式細(xì)胞術(shù)(FACS)測定病毒在支架上 5 天內(nèi)的緩釋效率，調(diào)整加載慢病毒的條件以及優(yōu)化靜電吸附和低溫冷凍方法的各種參數(shù)，包括靜電結(jié)合作用時(shí)間(T)、結(jié)合效率(P)以及低溫冷凍條件(C)等對病毒活性的影響，以求達(dá)到最佳緩釋效果，最終驗(yàn)證靜電吸附和低溫冷凍制備慢病毒介導(dǎo)基因修飾多孔 PLGA/nHAp 支架的可行性。

2.2.4 建立小鼠頂骨臨界性骨缺損模型及支架移植

小鼠手術(shù)均在 3% 異氟烷-100% 氧氣呼吸麻醉下進(jìn)行，同時(shí)設(shè)有保溫和防脫水處理，包括呼吸麻醉管道中加蒸餾水及術(shù)前皮下推注生理鹽水(200 μL)。動物麻醉后，用碘酊及 70% 酒精對手術(shù)部位皮膚進(jìn)行消毒處理，沿矢狀縫在頭頂皮膚作約 10mm 切口以暴露左側(cè)頂骨，用無菌棉簽將骨膜推開，用安裝有圓鋸的高速牙醫(yī)鉆在生理鹽水散熱下移除直徑 4mm 的頂骨，缺損處不與任何骨縫接觸，且移除骨片時(shí)不能損傷硬腦膜。給予不同實(shí)驗(yàn)處置后，恢復(fù)顱骨膜、頭部皮膚位置，縫合皮膚。小鼠頂骨臨界性骨缺損模型將分為 3 個(gè)組，每組 5 只。其中，A 組：骨缺損處不做任何處理(Empty)；B 組：移植 PLGA/nHAp支架；C 組：移植 LV-pdgfb/PLGA/nHAp 支架。

2.2.5 建立雙光子顯微成像條件下正常小鼠頂骨內(nèi)血管的形態(tài)結(jié)構(gòu)及分布

試驗(yàn)選取兩個(gè)光學(xué)通道用于收集正常小鼠顱骨組織的熒光信號。其中，一個(gè)通道選取388～420 nm 較窄波長范圍用于收集顱骨表層皮質(zhì)骨膠原蛋白產(chǎn)生的二次諧波(Second Harmonic Generation，SHG)信號，用綠色像素代表該熒光信號；另一個(gè)通道選取 450～650 nm 較寬波長范圍用于收集顱骨內(nèi)血管的雙光子激發(fā)熒光(Two-Photon Excited Fluorescence，TPEF)信號，用紅色像素代表該熒光信號。在試驗(yàn)中，為了進(jìn)一步提高顱骨內(nèi)血管的 TPEF 熒光信號對比度，給小鼠尾靜脈注射 150 μL、2 mg/mL 的 FITCDextran。每張成像圖片的像素為 256×256，圖片的大小為 512 μm×512 μm，獲取每張圖像耗時(shí)均為 8 s。具體步驟如下：對準(zhǔn)焦距找到清晰成像部位后，首先進(jìn)行x-y平面成像；然后適度調(diào)節(jié)焦距，沿z軸方向進(jìn)一步掃描成像，掃描深度為 200 層，每層間隔為 2 μm。

2.2.6 在 SHG/TPEF 顯微成像條件下監(jiān)測臨界性骨缺損部位血管生成的動態(tài)變化過程

利用建立起來的頂骨內(nèi)血管非線性雙光子顯微成像的基本參數(shù)，分別在第 2、3、4、5、6、7、8 周對 A、B、C 三組進(jìn)行監(jiān)測和定量在骨缺損修復(fù)過程中血管生成動態(tài)變化情況，探究基因修飾多孔 PLGA/nHAp 支架對誘導(dǎo)血管生成的重要作用。

2.2.7 光聲成像監(jiān)測正常小鼠頂骨內(nèi)血管分布

在保留小鼠頭皮和不保留小鼠頭皮 2 種情況下，分別用聲學(xué)(AR-PAM)和光學(xué)分辨率(OR-PAM)的多尺度光聲顯微成像觀測頂骨內(nèi)血管分布，評估光聲成像在頂骨血管成像的精度(深度和分辨率)，并建立起小鼠正常頂骨血管光聲顯微成像的基本參數(shù)和具體步驟，為后續(xù)骨缺損部位移植支架血管再生的檢測奠定基礎(chǔ)。

2.2.8 Micro-CT 分析骨缺損部位骨再生情況

術(shù)后 8 周進(jìn)行活體 Micro-CT 掃描分析骨缺損部位再生情況，并進(jìn)行三維骨結(jié)構(gòu)重建，通過對比分析基因修飾和未修飾多孔 PLGA/nHAp 支架修復(fù)骨缺損比例的結(jié)果，探究基因修飾多孔PLGA/nHAp 支架可以加快促進(jìn)骨組織的再生，建立骨組織重建與血管再生之間的相關(guān)性。

2.2.9 組織學(xué)方法檢查

Micro-CT 掃描之后，安樂處死小鼠，取出顱骨，并采用 4% 多聚甲醛進(jìn)行顱骨的固定，5%硝酸脫鈣，浸泡、透明、石蠟包埋后，連續(xù)切片(厚度 5 μm)，隨后進(jìn)行組織學(xué)染色(H&E)，觀察新骨形成和骨缺損部位連接情況。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

3.1 含有 pdgf-b 基因的慢病毒顆粒濃縮及滴度測定

圖2 慢病毒顆粒的生產(chǎn)制備及病毒滴度測定Fig. 2 Preparation of the lentivirus and evaluation of virus titer

本實(shí)驗(yàn)采用的第 3 代慢病毒系統(tǒng)由包膜質(zhì)粒 pLP1、pLP2 和 pLP-VSVG 及慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pLVX-PDGFB-mCMV-zsGreen 組成。其中，表達(dá)質(zhì)粒 pLVX-PDGFB-mCMV-zsGreen 表達(dá) PDGFBB 蛋白及綠色熒光蛋白。在熒光顯微鏡下觀察可看到，慢病毒表達(dá)質(zhì)粒與包膜質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT 細(xì)胞 24 h 后，大部分細(xì)胞可見綠色熒光表達(dá)(圖2)。這說明慢病毒表達(dá)載體及包膜質(zhì)粒已經(jīng)順利轉(zhuǎn)染細(xì)胞并表達(dá)相應(yīng)蛋白。接著，換取含有丙酮酸鈉的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng) 48 h ，此時(shí)可見少量細(xì)胞漂浮，細(xì)胞有融合現(xiàn)象，收集培養(yǎng)上清，即為含有慢病毒顆粒的病毒上清。與腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒不同，慢病毒不能在包裝細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制擴(kuò)增。為了獲得足夠量的病毒上清，首先，將細(xì)胞轉(zhuǎn)染于 10 個(gè)直徑為 15 cm 培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)，最終收集病毒上清 200 mL；隨后，采用超高速離心機(jī)在 4℃、25 000 rpm 條件下，離心 2 h，對病毒上清進(jìn)行濃縮；最后用 1 mL 冷DPBS 緩沖液重懸病毒顆粒，獲得濃縮后的病毒溶液，并按照每次實(shí)驗(yàn)用量進(jìn)行分裝，于－80℃保存?zhèn)溆谩Ｓ脻饪s后的 1 μL 病毒原液，進(jìn)行 10 倍倍比稀釋至 10－5后轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞(5×104/孔)，24 h 后用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行綠色熒光蛋白陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)，確定其病毒滴度為 1.0×108TU/ mL。

3.2 3D 多孔 PLGA/nHAp 骨組織支架結(jié)構(gòu)表征

從圖3(a)可以看到，3D 打印的圓柱型多孔 PLGA/nHAp 骨組織支架形態(tài)規(guī)則，孔隙均勻。將制備的 3D 多孔 PLGA/nHAp 支架切成厚度為 5～6mm 的薄片，噴金后用掃描電子顯微鏡進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖3(b)～(d)所示。掃描電子顯微鏡結(jié)果表明，多孔支架的孔徑范圍分布在200～400 μm，各孔隙間具有較高的連通性；在5 000 倍放大后可發(fā)現(xiàn)，在多孔支架表面分布著大量的微孔結(jié)構(gòu)，微孔大小范圍在 2～10 μm(圖3(d))。3D 打印的支架表面及內(nèi)部具有眾多的孔洞結(jié)構(gòu)有利于細(xì)胞的貼附、遷移、增殖及分化，為細(xì)胞之間的交流通訊提供了條件，有利于支架內(nèi)部血管生成和骨組織的長入。

圖3 3D PLGA/nHAp 骨組織支架結(jié)構(gòu)表征Fig. 3 Structural characterization of the 3D PLGA/nHA scaffold

3.3 靜電吸附和低溫冷凍方法制備基因修飾多孔支架及病毒緩釋的生物活性研究

利用病毒顆粒和多孔支架中的納米羥基磷灰石(nHAp)表面之間的強(qiáng)靜電結(jié)合特性，經(jīng)低溫真空冷凍干燥，將慢病毒顆粒固定在多孔骨組織支架的表面及內(nèi)部孔洞中，得到攜帶有基因修飾多孔支架材料。為了進(jìn)一步確定結(jié)合到支架表面的病毒活性及其釋放曲線，在體外進(jìn)行病毒顆粒緩釋及活性檢測實(shí)驗(yàn)。研究發(fā)現(xiàn)，慢病毒顆粒從支架上持續(xù)(可長達(dá) 5 天)釋放出的病毒顆粒能夠有效轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞并表達(dá) PDGF-BB 因子(圖4)，這為基因修飾支架體內(nèi)移植提供了基礎(chǔ)。

3.4 多模態(tài)雙光子及光聲顯微成像監(jiān)測和定量骨缺損部位血管生成

按照實(shí)驗(yàn)分組，將多孔支架移植到小鼠臨界性骨缺損模型上，術(shù)后第 2 周開始利用雙光子顯微成像(SHG/TPEF)技術(shù)實(shí)時(shí)監(jiān)測和定量移植支架上血管生成及分布(圖5)。術(shù)后 8 周雙光子顯微成像結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在移植 LV-pdgfb/PLGA/nHAp 支架上有大量的血管生成，其血管生成的數(shù)量顯著高于 PLGA/nHAp 組，同時(shí)在移植支架的實(shí)驗(yàn)組上發(fā)現(xiàn)伴隨著新生膠原的出現(xiàn)；但在對照(Empty)組并沒有發(fā)現(xiàn)有血管生成和膠原的生成(圖5(b))。此外，利用 ImageJ 軟件從術(shù)后第 2 周開始統(tǒng)計(jì)骨缺損部位血管生成面積發(fā)現(xiàn)，在移植LV-pdgfb/PLGA/nHAp 支架組血管生成的面積顯著大于其他兩組(圖5(c))。在相同實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，我們利用具有聲學(xué)(AR-PAM)和光學(xué)分辨率(OR-PAM)的多尺度光聲顯微成像設(shè)備觀察到了正常小鼠頂骨血管分布情況(圖6、7)。本文利用光聲顯微成像技術(shù)在監(jiān)測實(shí)驗(yàn)組小鼠骨缺損部位血管再生的過程中，由于骨組織的反射性高、密度高等特點(diǎn)，目前沒有獲得高清晰度的實(shí)驗(yàn)圖片。為了解決光聲成像在骨組織工程應(yīng)用中所遇到的難題，本文合作者團(tuán)隊(duì)已開始搭建新的光聲顯微成像系統(tǒng)平臺，包括提高其分辨率(5～10 μm)、大視野成像范圍(10mm)、成像速度以及提高信噪比等方面，這將為后續(xù)骨缺損部位血管再生的實(shí)時(shí)檢測和定量提供條件。相信伴隨著光聲顯微成像技術(shù)的發(fā)展，其將為生物醫(yī)學(xué)成像領(lǐng)域提供一種新的具有顛覆價(jià)值的成像思路和方法。

3.5 Micro-CT 觀察骨再生

圖4 體外測定支架上釋放的慢病毒生物活性及 PDGF-BB 蛋白表達(dá)情況Fig. 4 Assessment of the bioactivity of virus particles cumulatively released from PLGA/nHAp scaffolds and PDGF-BB expressed

圖5 多模態(tài)雙光子顯微成像監(jiān)測和定量骨缺損部位血管生成Fig. 5 Two-photon microscopy (SHG/TPEF) imaging and quanti fi cation of angiogenesis in the bone defect region

圖6 聲學(xué)分辨光聲顯微成像(AR-PAM)在保留頭皮(a)和去除頭皮的條件下(b)觀察正常小鼠頂骨血管分布(n=6)Fig. 6 Ultrasound (US) and photoacoustic (PA) images along with their 2D images of normal tissue components of the cranial area with(a) or without skin (b) by AR-PAM (n=6)

術(shù)后 8 周對實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行 Micro-CT 掃描，并進(jìn)行三維骨結(jié)構(gòu)重建。結(jié)果顯示，在有移植支架的實(shí)驗(yàn)組觀察到有不同數(shù)量的新生骨組織長入支架中，并觀察到不同程度的生物支架降解。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，移植基因修飾支架的實(shí)驗(yàn)組的骨密度(BMD)、骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)以及骨小梁數(shù)量(Tb.N)顯著高于另外兩實(shí)驗(yàn)組(圖8)，表明基因修飾多孔 PLGA/nHAp 支架可以加快促進(jìn)骨組織的再生。

3.6 組織學(xué)觀察染色

圖7 光學(xué)分辨光聲顯微成像(OR-PAM)在保留頭皮(a)和無頭皮的條件下(b)觀察不同掃描深度下正常小鼠頂骨血管分布(n=6)Fig. 7 Imaging of normal tissue components of the cranial area with (a) or without skin (b) at different depths by OR-PAM (n=6)

圖8 術(shù)后 8 周 micro-CT 評估骨缺損部位新生骨組織再生情況Fig. 8 Micro-CT scanning evaluation of bone formation at 8-weeks post-implatation

對組織切片進(jìn)行蘇木精-伊紅(Hematoxylin-Eosin Saining)染色，在顯微鏡下觀察結(jié)果如下：在沒有移植支架(Empty)組發(fā)現(xiàn)，骨缺損部位被較多的纖維組織覆蓋，沒有新生骨組織的出現(xiàn)；在 LV-pdgfb/PLGA/nHAp 和 PLGA/nHAp 組均發(fā)現(xiàn)了有新生骨組織的生成，并且觀察到多孔支架降解現(xiàn)象，其中，LV-pdgfb/PLGA/nHAp 組多孔支架降解程度最高，降解空間被大量新生的骨組織填充，而在 PLGA/nHAp 組多孔支架還基本保持著原有空間結(jié)構(gòu)，降解速率較慢(圖9)。表明基因修飾多孔 PLGA/nHAp 支架可以加快促進(jìn)骨組織的再生。

4 與國內(nèi)外相似研究的對比分析

骨缺損修復(fù)重建是個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程[34]。骨組織支架植入機(jī)體后能否成活，關(guān)鍵看其能否早期血管化并和周圍組織建立血供。如果錯過了這一個(gè)關(guān)鍵期，血管新生的速度和效率就會顯著降低，從而影響骨修復(fù)重建的速度[42]。

目前，常用單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用促血管生成生長因子[21-23]達(dá)到促進(jìn)血管化的目的，但存在很多問題[30,31]：(1)細(xì)胞因子與材料復(fù)合制備時(shí)，往往造成其生物活性顯著下降；(2)體內(nèi)易擴(kuò)散或被蛋白酶降解，半衰期短，作用于靶細(xì)胞的時(shí)間受限；(3)局部含量不易調(diào)控，低含量因子作用效果十分有限，而高含量可能導(dǎo)致變形的、無功能的血管生成，有潛在的致瘤性。為了解決臨界性骨缺損部位血管化速度和程度緩慢的問題，促進(jìn)血管網(wǎng)絡(luò)在生物支架表面、內(nèi)部及周圍盡早重建，基因修飾生物支架誘導(dǎo)血管化是骨再生的有效方法之一，其血管化程度是決定和制約骨修復(fù)效率的關(guān)鍵環(huán)節(jié)?；诙嗄B(tài)雙光子-光聲顯微成像技術(shù)可以從分子與細(xì)胞層面實(shí)現(xiàn)骨組織支架血管發(fā)生、發(fā)展過程的動態(tài)監(jiān)測。本研究通過靜電吸附和低溫冷凍方法制備慢病毒介導(dǎo)基因修飾促血管化的多孔 PLGA/nHAp 功能性支架，實(shí)現(xiàn)生長因子 PDGF-BB 在內(nèi)源性細(xì)胞中原位、持續(xù)表達(dá)，誘導(dǎo)體內(nèi) MSCs、成骨前體細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖、遷移、分化，促使血管生成貫穿于整個(gè)骨再生過程。

圖9 術(shù)后 8 周骨缺損部位組織切片蘇木精-伊紅(HE)染色Fig. 9 Histological analysis of tissue regeneration in bone defect areas at 8 weeks post-implantation

在骨缺損修復(fù)的過程中，骨再生和血管生成是兩個(gè)相互協(xié)調(diào)的作用過程。從時(shí)間和空間尺度同步分析骨生成和血管生成之間的關(guān)聯(lián)作用，是研究骨修復(fù)的重要內(nèi)容，而傳統(tǒng)的技術(shù)手段和成像條件難以實(shí)時(shí)、在體地達(dá)成此研究目的[35,36]。以往對組織工程骨血管化程度進(jìn)行監(jiān)測主要采用 X-線片光密度測定、ECT、CT灌注成像、MRI 灌注成像和經(jīng)典的組織學(xué)方法——血管免疫組化檢查等。但這些方法均存在一定的缺陷[35,43]：(1)X-線片光密度測定不能對組織工程骨的血管化進(jìn)行早期監(jiān)測，靈敏度差，存在射線輻射情況；(2)ECT 需要使用放射性藥物，對實(shí)驗(yàn)動物尚能使用檢查，但對于臨床應(yīng)用的病人難以接受；(3)CT 灌注成像、MRI 灌注成像對設(shè)備要求條件較高、操作較復(fù)雜、檢查所需時(shí)間較長、需要注射對比劑、分辨率低、檢查成本較高；(4)組織學(xué)方法需要制作病理切片，耗時(shí)較長，且需要使用抗體，費(fèi)用昂貴，對于實(shí)驗(yàn)動物需要處死取出樣本觀察，而對于病人患者則會引起局部的創(chuàng)傷疼痛。為了解決監(jiān)測和定量組織工程骨血管化過程存在的難題，本研究以小鼠頂骨臨界性骨缺損為模型，利用多模態(tài)雙光子-光聲顯微成像技術(shù)在體、實(shí)時(shí)、連續(xù)、無創(chuàng)地監(jiān)測，研究骨修復(fù)過程中多孔 PLGA/nHAp 支架血管化發(fā)生、發(fā)展的動態(tài)過程，并闡明該功能性支架植入體內(nèi)后調(diào)控內(nèi)源性細(xì)胞促成骨、成血管的偶聯(lián)作用機(jī)制。

5 結(jié) 論

本文以慢病毒介導(dǎo)基因修飾多孔 PLGA/nHAp 支架誘導(dǎo)血管生成在骨修復(fù)中的作用為研究對象，采用靜電吸附和低溫冷凍方法制備基因修飾多孔 PLGA/nHAp 支架，并在體外進(jìn)行長達(dá)5 天的病毒緩釋的生物活性研究；并以小鼠頂骨臨界性骨缺損為動物模型，進(jìn)行體內(nèi)血管再生研究。研究結(jié)果表明，慢病毒介導(dǎo)的基因修飾多孔PLGA/nHAp 骨組織支架，可以實(shí)現(xiàn) PDGF-BB因子原位表達(dá)，促進(jìn)局部、遠(yuǎn)處干細(xì)胞等細(xì)胞遷移，加快誘導(dǎo)血管生成從而提高骨缺損部位骨組織的再生能力。此外，本文成功使用并比較了多模態(tài)雙光子及光聲顯微成像技術(shù)在體、實(shí)時(shí)、連續(xù)監(jiān)測 3D 骨組織支架內(nèi)血管形成的動態(tài)變化過程，并驗(yàn)證了基因修飾對于提高 3D 打印支架的生物學(xué)反應(yīng)性的作用。本研究為研究不同支架對血管生成作用的監(jiān)測與鑒定提供了新的技術(shù)手段。

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