劉 緣 潘浩波 趙曉麗

(中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院 深圳 518055)

1 引 言

南極磷蝦屬節(jié)肢動(dòng)物門甲殼綱磷蝦目，是生活在南冰洋的南極洲水域的無脊椎動(dòng)物。南極磷蝦的蘊(yùn)藏量十分豐富，可達(dá) 6.5×108～10×108t[1,2]，是最為豐富的一種海洋動(dòng)物資源。在2010 年，中國(guó)水產(chǎn)品總產(chǎn)量近 6 000 萬噸[3]，不到南極磷蝦資源總量的 10%。南極磷蝦營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，含有豐富的脂肪酸、蛋白質(zhì)、維生素、微量元素及其他生物活性成分[4]。更為重要的是，從南極磷蝦廢棄的蝦殼中可以提取甲殼素，再經(jīng)過脫乙?？梢缘玫接猛緩V泛的殼聚糖。與近海資源相比，以南極磷蝦的蝦殼作為殼聚糖的新型來源，其優(yōu)勢(shì)在于無污染，重金屬含量低，巨大的生物質(zhì)存量可以保證殼聚糖質(zhì)量的穩(wěn)定性，同時(shí)南極極端的自然環(huán)境可能賦予它特殊的理化性質(zhì)。

殼聚糖，英文名 Chitosan，又名脫乙酰甲殼素，經(jīng)甲殼素脫去乙?；玫?，是甲殼素的主要改性產(chǎn)物；化學(xué)名β-(1,4)-2-氨基-2-脫氧-D-葡萄糖[5](圖1)，是自然界中唯一存在的堿性多糖，被稱為繼蛋白質(zhì)、糖、脂肪、維生素、礦物質(zhì)以外的第六生命要素。殼聚糖具有很好的生物相容性[6]、生物降解性及安全性，其固有的優(yōu)良性能使其在生物醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用[7,8]。

近年來，南極磷蝦作為殼聚糖的來源引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，南極磷蝦殼聚糖具有優(yōu)異的止血效果，在創(chuàng)傷和止血方面具有很好的應(yīng)用前景[9]。目前臨床應(yīng)用的止血材料主要包括沸石、馬鈴薯淀粉、明膠和膠原等，在使用中都存在一定局限性。其中，明膠和膠原的組織黏附性能較差，它們的止血功能均依賴于血小板和凝血因子，應(yīng)用受到限制[10]。沸石在吸收血液中的水分后會(huì)放出大量的熱，可能會(huì)導(dǎo)致傷口炎癥[11]。相比之下，無毒、無抗原性、抗菌性和生物相容性良好的殼聚糖在開發(fā)止血材料方面有著更大的優(yōu)勢(shì)，但提取殼聚糖的工藝還有待進(jìn)一步優(yōu)化。

圖1 殼聚糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig. 1 The molecular structure of chitosan

南極磷蝦的蝦殼中含有大量的甲殼素，其個(gè)體小，蝦殼薄，處理工藝與傳統(tǒng)的蝦殼和蟹殼不同。因此，本研究將對(duì)南極磷蝦殼聚糖的提取工藝進(jìn)行探索與優(yōu)化，對(duì)產(chǎn)物的各項(xiàng)性能進(jìn)行表征，并對(duì)其凝血效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

氫氧化鈉、鹽酸、冰醋酸等購自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，G250 考馬斯亮藍(lán)染色劑、標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，氘帶醋酸、重水購自 Aladdin(阿拉丁)公司。作為對(duì)照的殼聚糖分別購買于 Aladdin 公司(a-cs，脫乙酰度≥95%)，J&K 百靈威(b-cs，平均分子量 100 000～300 000)。

紅外光譜儀(Fourier Transform Infrared Spectroscopy，F(xiàn)TIR)，VERTEX 70，德國(guó)BRUKER 公司。熱重分析儀，TAQ600，賽默飛世爾科技公司。旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)，NJD-1，上海精純儀器設(shè)備有限公司。烏氏粘度計(jì)，賽默飛世爾科技公司。全波長(zhǎng)讀數(shù)儀，Multiskan Go，賽默飛世爾科技公司。核磁共振波譜儀，AVANCE Ⅲ 400，賽默飛世爾科技公司。冷凍干燥機(jī)，F(xiàn)D-1D-80，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

2.2 南極磷蝦殼聚糖的提取

首先通過兩次酸堿交替，從南極磷蝦的蝦殼中提取甲殼素。具體方法如下，將干蝦殼和1 mol/L HCl 按 1∶20 質(zhì)量體積比(m/v)在室溫下攪拌反應(yīng) 1 h，過濾沖洗至中性，進(jìn)行脫鈣。然后加入 1 mol/L NaOH 溶液(m/v＝1∶20)，于100℃ 下攪拌反應(yīng) 1 h 進(jìn)行脫蛋白，過濾沖洗至中性。分別重復(fù)一次脫鈣、脫蛋白的步驟，將得到的產(chǎn)物于 60℃ 烘箱中烘干得到甲殼素。

將得到的甲殼素脫乙酰制備殼聚糖，步驟如下：(1)將甲殼素與 50% 濃 NaOH 按 1∶50 質(zhì)量/體積加入三口燒瓶，在油浴鍋中 110℃ 回流反應(yīng) 1 h，于室溫?cái)嚢?2 h；重復(fù)上述脫乙酰步驟后，將收集得到的產(chǎn)物沖洗至中性，干燥可得殼聚糖粗品。(2)將殼聚糖粗品溶解在 1% 的乙酸溶液中進(jìn)行純化，過濾除去不溶性雜質(zhì)；然后用 1 mol/L NaOH 將溶液的 pH 調(diào)節(jié)至 8.5，待產(chǎn)生白色絮狀沉淀，對(duì)溶液進(jìn)行過濾收集沉淀物；(3)將沉淀物用雙蒸水洗滌至中性并通過冷凍干燥，即得到亮白色的南極磷蝦殼聚糖粉末(n-cs)。

2.3 殼聚糖的性質(zhì)表征

2.3.1 紅外光譜

采用溴化鉀(KBr)壓片法，將南極磷蝦殼聚糖樣品和 KBr 粉末混合，充分研磨制成壓片，用BRUKER VERTEX 70 傅里葉變換紅外光譜儀掃描，記錄樣品在 400～4 000 cm－1的紅外吸收光譜。

2.3.2 核磁共振圖譜

取 10 mg 殼聚糖粉末溶于 1 mL 2% 氘帶醋酸的重水溶液，用 AVANCE Ⅲ 400 核磁共振波譜儀測(cè)定殼聚糖的1H NMR 圖譜。

2.3.3 灰分含量測(cè)量

稱取 5～10 mg 的殼聚糖，采用熱重分析儀測(cè)量灰分含量。其中，天平和樣品載氣均為空氣，流速 20 mL/min，設(shè)定溫度從室溫升至800℃(保持 20 min)，由所得數(shù)據(jù)計(jì)算其灰分含量。

2.3.4 蛋白含量測(cè)量

用 Bradford 法[12]對(duì)殼聚糖蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定。首先，將標(biāo)準(zhǔn)蛋白配制成不同濃度梯度，加入 G250 染色劑，在 Multiskan Go 全波長(zhǎng)讀數(shù)儀上測(cè)定 595 nm 處吸光度，制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。其次，將殼聚糖樣品溶于 1% 的醋酸溶液中使其濃度為 10 mg/mL，G250 進(jìn)行染色后，在 595 nm處測(cè)定其吸光值。最后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出殼聚糖的蛋白含量。

2.3.5 分子量測(cè)量

采用烏氏粘度法測(cè)量其粘均分子量。首先，稱取 0.015 g 殼聚糖溶于 20 mL 0.3 mol/L 醋酸/0.2 mol/L 醋酸鈉溶劑中，充分溶解后用濾紙過濾除去微細(xì)不溶物。其次，調(diào)節(jié)恒溫槽溫度至(25.0±0.1)℃，將烏氏粘度計(jì)垂直放入恒溫槽，使水面完全浸沒 G 球，測(cè)得殼聚糖溶液流經(jīng)毛細(xì)管所需時(shí)間t，重復(fù) 3 次(每次的差值不超過 0.2 s)，計(jì)算平均值；測(cè)定純?nèi)軇┝鹘?jīng)毛細(xì)管所需時(shí)間t0。最后，相對(duì)粘度ηr＝t/t0，增比粘度ηsp＝ηr－1，根據(jù)一點(diǎn)法公式η＝(ηsp＋3㏑ηr)/4c(c為溶液濃度)計(jì)算出殼聚糖的粘度(η)，再由粘度計(jì)算粘均分子量M＝η／ka[13]。其中，k＝0.007 9，a＝0.796。

2.3.6 黏度測(cè)量

采用旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)測(cè)量殼聚糖溶液的黏度。稱取 0.25 g 殼聚糖樣品溶于 25 mL 1% 醋酸溶液中，攪拌 30 min 使其充分溶解。靜置一段時(shí)間后，在 20℃ 左右條件下用 NJD-1 型旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)測(cè)試其黏度。

2.4 提取工藝對(duì)南極磷蝦殼聚糖理化性質(zhì)的影響

2.4.1 前處理對(duì)殼聚糖顏色的影響

將南極磷蝦蝦殼用 1 mol/L 的 NaOH 進(jìn)行前處理：室溫下攪拌浸泡 24 h，過濾水洗后重復(fù)一次，水洗至中性并干燥。之后與未做前處理的殼聚糖進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)。

2.4.2 酸濃度對(duì)殼聚糖灰分含量的影響

首先，將南極磷蝦蝦殼分別用 1 mol/L 和2 mol/L 的鹽酸進(jìn)行脫鈣處理，后續(xù)操作均相同。其次，采用熱重分析儀測(cè)量灰分，并比較 2種產(chǎn)物的灰分含量。

2.4.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)殼聚糖蛋白質(zhì)含量的影響

將南極磷蝦蝦殼在 1 mol/L NaOH 溶液于100℃ 分別反應(yīng) 1 h 和 1.5 h，其他操作均相同，用 Bradford 法，比較最終產(chǎn)物的蛋白質(zhì)含量。

2.4.4 不同反應(yīng)溫度和時(shí)間對(duì)殼聚糖脫乙酰度的影響

為探討不同反應(yīng)溫度和時(shí)間對(duì)殼聚糖脫乙酰度的影響，對(duì)甲殼素做 2 種處理，具體如下。

(1)將制備的甲殼素(6 g)平均分成 3 份，置于 220 mL 的三口燒瓶中，加入 100 mL 50% 的NaOH，分別在 100℃、110℃ 和 130℃ 的油浴鍋加熱攪拌回流 1 h 進(jìn)行脫乙酰反應(yīng)，水洗至中性；重復(fù)一次前述脫乙酰的操作，獲得脫乙酰殼聚糖。

(2)將制備的甲殼素(6 g)平均分成 3 份，置于 220 mL 的三口燒瓶中，加入 100 mL 50% 的NaOH，在 110℃ 的油浴鍋加熱攪拌回流進(jìn)行脫乙酰反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間分別為 1 h、2 h 和 3 h，水洗至中性；重復(fù)一次前述脫乙酰的操作，獲得脫乙酰殼聚糖。

對(duì)上述 2 種方法處理獲得的產(chǎn)物均采用核磁譜圖檢測(cè)其脫乙酰度。

2.5 凝血效果評(píng)價(jià)

采用試管法評(píng)價(jià)殼聚糖的凝血效果，具體步驟如下：(1)取最優(yōu)條件制備的南極磷蝦殼聚糖和從阿拉丁和百靈威購買的殼聚糖粉末(10 mg)，分別放入玻璃管中并預(yù)熱至 37℃；(2)通過 SD大鼠心臟取血實(shí)驗(yàn)獲得實(shí)驗(yàn)用血液，存放于抗凝試管中備用；(3)取 1.0 mL 血液分別加入到不同的殼聚糖試管中，而未加殼聚糖的血液凝固時(shí)間作為對(duì)照；(4)加入 0.2 mol/L CaCl2達(dá)到 20mmol/L[14]恢復(fù)血液凝血能力并開始計(jì)時(shí)；(5)每隔 30 s 傾斜試管檢查血液流動(dòng)情況，直到血液完全停止流動(dòng)，停止計(jì)時(shí)。所有實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組均同時(shí)做 3 份重復(fù)，最終取平均值。

3 結(jié) 果

3.1 南極磷蝦殼聚糖外觀顏色

本研究采用酸堿交替法提取南極磷蝦殼聚糖，免去了傳統(tǒng)的殼聚糖制備工藝過程中的脫色操作。與商品化的淡黃色殼聚糖相比，南極磷蝦殼聚糖的顏色為亮白色(如圖2)。

圖2 南極磷蝦殼聚糖產(chǎn)物形貌Fig. 2 The morphology of Antarctic krill shell fi sh

3.2 紅外光譜

南極磷蝦殼聚糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)由紅外光譜確定，結(jié)果如圖3 所示。在譜圖中，殼聚糖的特征吸收峰在 1 653、1 570 和 1 077 cm－1處，分別屬于 C＝O 伸縮(酰胺 I 帶)、N－H 變形(酰胺 II帶)和 C－O 伸縮振動(dòng)[15]。產(chǎn)物符合殼聚糖的特征峰。

圖3 不同種類的殼聚糖紅外譜圖Fig. 3 The FTIR of the different kinds of chitosan

3.3 1H 核磁共振

目前可用來測(cè)定殼聚糖的脫乙酰度的方法有很多，但1H 核磁共振法是檢測(cè)殼聚糖脫乙酰度最為準(zhǔn)確、快速的方法，并且重復(fù)性好，其譜圖結(jié)果如圖4 所示。

圖4 不同種類殼聚糖的核磁氫譜Fig. 4 The 1H NMR of the different kinds of chitosan

脫乙酰度按以下公式[16]計(jì)算：

由表1 可知，南極磷蝦殼聚糖和購買于阿拉丁公司的殼聚糖的脫乙酰度都高于 90%，滿足醫(yī)用級(jí)殼聚糖的標(biāo)準(zhǔn)。而購買于百靈威公司的殼聚糖脫乙酰度較低，僅為 72.64%。

表1 不同來源的殼聚糖脫乙酰度Table 1 The degree of deacetylation of chitosan from different sources

3.4 南極磷蝦殼聚糖理化性質(zhì)

國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局在 2008 年制定了YY/T0606.7—2008《組織工程醫(yī)療產(chǎn)品第 7 部分：殼聚糖》[17]。其中，對(duì)殼聚糖的雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)做了規(guī)定：規(guī)定殼聚糖中灰分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)≤0.5%，蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)≤0.2%。鑒于該步驟得到的殼聚糖蛋白含量(0.55%)及灰分含量(0.85%)都還比較高(見表2)，將在純化過程中進(jìn)一步進(jìn)行處理。

表2 南極磷蝦殼聚糖的理化性質(zhì)Table 2 The physiochemical properties of Antarctic krill chitosan

3.5 提取工藝對(duì)南極磷蝦殼聚糖理化性質(zhì)的影響

3.5.1 前處理對(duì)殼聚糖顏色的影響

在南極磷蝦中，顯色的物質(zhì)為蝦紅素，它在高溫、紫外光照射、酸堿等條件下易分解，同時(shí)在加熱的條件下可以和蛋白質(zhì)結(jié)合。雖然在脫蛋白的過程中可以去除部分蝦紅素，但一般仍有殘留，最終以糖蛋白的結(jié)合形式殘留在殼聚糖中。本研究通過增加堿浸泡的前處理工序，減少殼聚糖中蝦紅素的殘留。通過對(duì)比可發(fā)現(xiàn)，未做前處理的殼聚糖顏色偏粉，而用增加堿液進(jìn)行前處理工藝得到的殼聚糖顏色亮白(圖5)。表明堿液前處理可以降低殼聚糖中蝦紅素的含量，獲得更好的殼聚糖形貌。目前其他文獻(xiàn)報(bào)道和商品化的殼聚糖多為淡粉色或淡黃色[18,19]，而這一前處理工藝可以解決殼聚糖顏色偏黃的問題，從而具有更廣泛的應(yīng)用[20]。

圖5 前處理工藝對(duì)殼聚糖的影響Fig. 5 Effects of pretreatment in NaOH solution on the color of chitosan

3.5.2 酸濃度對(duì)殼聚糖灰分含量的影響

通過不同酸濃度處理結(jié)果顯示，用 1 mol/L的鹽酸進(jìn)行脫鈣處理后得到的南極磷蝦殼聚糖灰分含量為 0.85%，而用 2 mol/L 的鹽酸進(jìn)行脫鈣處理得到的南極磷蝦殼聚糖，其灰分含量降到0.095%，達(dá)到醫(yī)用標(biāo)準(zhǔn)。這表明增加酸處理濃度可降低殼聚糖中的灰分含量。

3.5.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)南極磷蝦殼聚糖蛋白質(zhì)含量的影響

在脫蛋白過程中，對(duì)南極磷蝦蝦殼分別用堿液反應(yīng) 1 h 和 1.5 h，將得到的殼聚糖的蛋白含量進(jìn)行對(duì)比。由結(jié)果(表3)可見，延長(zhǎng)脫蛋白時(shí)間對(duì)南極磷蝦殼聚糖中蛋白質(zhì)的去除沒有顯著的影響。蛋白質(zhì)去除困難的原因可能是甲殼動(dòng)物外殼中的蛋白質(zhì)與甲殼素通過共價(jià)、靜電、疏水和氫鍵等作用方式形成甲殼素-蛋白質(zhì)糖蛋白復(fù)合物[20]。這種較強(qiáng)的相互作用，給提取殼聚糖帶來了難度。同時(shí)，由于殼聚糖在脫蛋白工藝中通過強(qiáng)堿已經(jīng)去除了大部分的蛋白質(zhì)，剩余蛋白含量極少，因而再增加堿處理時(shí)間對(duì)去除殼聚糖中剩余蛋白質(zhì)作用不明顯[21]，完全去除殼聚糖的蛋白還需通過其他方式進(jìn)一步研究。

表3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)南極磷蝦殼聚糖蛋白含量的影響Table 3 The effects of different reaction time of alkali treatments on the protein content of Antarctic krill chitosan

3.5.4 不同脫乙酰處理?xiàng)l件對(duì)殼聚糖脫乙酰度的影響

通過脫乙酰過程中不同反應(yīng)溫度和時(shí)間，研究其對(duì)殼聚糖脫乙酰度的影響。由結(jié)果(表4)可見，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為 1 h 、溫度為 100℃ 時(shí)，殼聚糖脫乙酰度為 83% 左右。當(dāng)升高溫度至 110℃后，脫乙酰度增加了約 7%，但繼續(xù)升高溫度對(duì)脫乙酰度的影響不大。在 110℃ 反應(yīng)溫度下研究增加脫乙酰反應(yīng)時(shí)間對(duì)脫乙酰度的影響發(fā)現(xiàn)，不同反應(yīng)時(shí)間下的殼聚糖脫乙酰度都約為 90%，沒有顯著性區(qū)別，說明增加反應(yīng)時(shí)間對(duì)脫乙酰度的提高影響不大?？赡苁怯捎诿撘阴＿^程中，酰胺鍵的斷裂主要發(fā)生在反應(yīng) 1 h 內(nèi)，由于空間結(jié)構(gòu)和結(jié)合形式等原因，剩余少量的酰胺鍵在當(dāng)前的反應(yīng)條件下達(dá)不到斷裂反應(yīng)條件，而繼續(xù)增加反應(yīng)時(shí)間會(huì)發(fā)生殼聚糖主鏈的斷裂，導(dǎo)致分子量的下降，黏度降低。因此，由以上結(jié)果可確定脫乙酰反應(yīng)的最優(yōu)條件為 110℃ 反應(yīng) 1 h。

表4 不同脫乙酰處理?xiàng)l件對(duì)殼聚糖脫乙酰度的影響Table 4 The effects of different deacetylation conditions on the degree of deacetylation of chitosan

3.6 凝血效果評(píng)價(jià)

圖6 不同殼聚糖的凝血效果Fig. 6 The effect of different chitosan on the blood coagulation

殼聚糖可以凝血的原因是由于它所攜帶的正電荷可以吸附帶有負(fù)電的血小板及凝血蛋白等，并有激活血小板的凝血功能。本研究通過凝血實(shí)驗(yàn)對(duì)比提取的南極磷蝦殼聚糖與商品化的殼聚糖的凝血效果。由圖6 可見，復(fù)凝血液的自凝固時(shí)間需要約 1 000 s，而不同來源的殼聚糖均能夠有效地降低血液凝固的時(shí)間。其中，阿拉丁殼聚糖(a-cs)和百靈威殼聚糖(b-cs)能夠?qū)⒛獣r(shí)間降低至對(duì)照組的約 40%，而南極磷蝦殼聚糖(n-cs)具有更明顯的凝血作用，能夠進(jìn)一步縮短 15% 的凝血時(shí)間。這說明南極磷蝦殼聚糖的凝血效果更佳。

4 討 論

南極磷蝦生物蘊(yùn)藏量十分豐富，其蝦殼作為殼聚糖的新型來源，相對(duì)近海資源來說具有無污染的優(yōu)勢(shì)，而且南極磷蝦個(gè)體小、蝦殼薄，易于處理。對(duì)于從南極磷蝦提取的殼聚糖，傳統(tǒng)工藝多采用酸堿交替的實(shí)驗(yàn)方法，酸處理和堿處理都在 3 次以上[22]，操作步驟較多，有些還需用到高錳酸鉀來進(jìn)行脫色[18]。本研究采用 2 次酸堿交替法，且每次處理僅需 1 h，相對(duì)地減少了操作步驟，縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間；同時(shí)，南極磷蝦殼聚糖為亮白色，無需再進(jìn)行脫色處理，避免了造成環(huán)境污染的可能。得到南極磷蝦殼聚糖的脫乙酰度高于 90%，分子量為 123 kDa，灰分含量為 0.095%，達(dá)到醫(yī)藥級(jí)的標(biāo)準(zhǔn)。但蛋白含量仍然較高，需要針對(duì)天然多糖的蛋白去除做進(jìn)一步研究。

凝血實(shí)驗(yàn)表明，南極磷蝦殼聚糖的凝血效果優(yōu)于其他商品化的殼聚糖。殼聚糖的多種理化性質(zhì)，如分子量、脫乙酰度、特性黏度、水合度、結(jié)晶度、蛋白含量和灰分等[23]對(duì)止血效果均有一定的影響。其中，脫乙酰度、分子量和水合度起主要作用，蛋白含量和灰分對(duì)于凝血作用的影響較小。提高脫乙酰度對(duì)殼聚糖促凝血效果具有促進(jìn)作用，高分子量的殼聚糖凝血效果略優(yōu)于低分子量的殼聚糖。據(jù)報(bào)道，南極磷蝦殼聚糖結(jié)構(gòu)內(nèi)的自由羥基含量高[22]。而我們前期研究也發(fā)現(xiàn)這種殼聚糖的水化能力明顯高于其他來源的殼聚糖[9]，再加上結(jié)晶度、分子量等的差別，使得南極磷蝦殼聚糖的凝血效果更好，這也從一定程度上表明其在止血材料方面具有極大的應(yīng)用前景。

5 結(jié) 論

本研究以生活在南極水域的南極磷蝦為來源，進(jìn)行殼聚糖提取的工藝研究。通過脫蛋白、脫鈣和脫乙酰得到的殼聚糖為亮白色，脫乙酰度達(dá) 90.6%，分子量為 123 kDa，灰分含量為0.095%。通過對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化可以發(fā)現(xiàn)，堿液前處理能夠改善殼聚糖表觀顏色，提高酸濃度能夠降低灰分，延長(zhǎng)脫蛋白時(shí)間對(duì)降低蛋白含量作用較小，脫乙酰的最適溫度在 110℃，而延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間對(duì)提高脫乙酰度作用不大。將優(yōu)化制備工藝后的殼聚糖進(jìn)行止血效果評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)，南極磷蝦殼聚糖的凝血效果優(yōu)于其他殼聚糖。應(yīng)用南極磷蝦作為殼聚糖的提取來源，將提高現(xiàn)有殼聚糖止血產(chǎn)品的止血效果，具有重要的應(yīng)用前景。

[1]張倩. 南極磷蝦蝦油脫氟提取的工藝研究與設(shè)計(jì)[D]. 濟(jì)南: 山東師范大學(xué), 2013.

[2]張霖保. 南極磷蝦魚類資源量估算 [J]. 現(xiàn)代漁業(yè)信息, 1987(12): 22.

[3]周雨思, 阮雯, 王茜, 等. 文萊漁業(yè)近況與發(fā)展趨勢(shì) [J]. 漁業(yè)信息與戰(zhàn)略, 2013, 28(4): 312-316.

[4]楊洋, 劉曉芳. 南極磷蝦主要營(yíng)養(yǎng)成分及保健機(jī)能研究進(jìn)展 [J]. 大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2014(2): 186-189, 194.

[5]Mach RL, Peterbauer CK, Payer K, et al.Expression of two major chitinase genes of trichoderma atroviride (T. harzianum P1) is triggered by different regulatory signals [J]. Applied& Environmental Microbiology, 1999, 65(5): 1858-1863.

[6]Pillai CKS, Paul W, Sharma CP. Chitin and chitosan polymers: chemistry, solubility and fi ber formation[J]. Progress in Polymer Science, 2009, 34(7): 641-678.

[7]Bautista-Ba?os S, Hernández-Lauzardo AN,Velázquez-del Valle MG, et al. Chitosan as a potential natural compound to control pre and postharvest diseases of horticultural commodities[J]. Crop Protection (Guildford, Surrey), 2006,25(2): 108-118.

[8]Hamidi M, Ra fi ei P, Azadi A, et al. Encapsulation of valproate-loaded hydrogel nanoparticles in intact human erythrocytes: a novel nano-cell composite for drug delivery [J]. Journal of Pharmaceutical Sciences, 2011, 100(5): 1702-1711.

[9]Wu S, Huang ZY, Yue JH, et al. The efficient hemostatic effect of antarctic krill chitosan is related to its hydration property [J]. Carbohydrate Polymers, 2015, 132: 295-303.

[10]馬軍陽, 陳亦平, 李俊杰, 等. 甲殼素/殼聚糖止血機(jī)理及應(yīng)用 [J]. 北京生物醫(yī)學(xué)工程, 2007, 26(4):442-445.

[11]李保強(qiáng), 方一帆, 楊傳瑞, 等. 新型快速止血材料的止血評(píng)價(jià)與止血機(jī)制 [J]. 實(shí)驗(yàn)技術(shù)與管理,2007, 24(7): 51-54.

[12]國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典(2015 年版一部) [M]. 北京: 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 2015.

[13]Brugnerotto J, Desbrières J, Roberts G, et al.Characterization of chitosan by steric exclusion chromatography [J]. Polymer, 2001, 42(25): 09921-09927.

[14]Behrens AM, Sikorski MJ, Li T, et al. Bloodaggregating hydrogel particles for use as a hemostatic agent [J]. Acta Biomaterialia, 2014,10(2): 701-708.

[15]Kang ML, Kim JE, Ko JY, et al. Intra-articular delivery of kartogenin-conjugated chitosan nano/microparticles for cartilage regeneration [J].Biomaterials, 2014, 35(37): 9984-9994.

[16]Hirai A, Odani H, Nakajima A. Determination of degree of deacetylation of chitosan by1H NMR spectroscopy [J]. Polymer Bulletin, 1991, 26(1):87-94.

[17]國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局. 中華人民共和國(guó)醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(YY/T0606.7-2008)——組織工程醫(yī)療產(chǎn)品 第7部分: 殼聚糖 [S]. 2008.

[18]姚宏亮. 南極磷蝦蝦殼制備甲殼素/殼聚糖的工藝研究 [J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2004, 23(5): 34-36.

[19]梁玉佳. 南極磷蝦蝦殼中甲殼素的制取與應(yīng)用[D]. 大連: 大連工業(yè)大學(xué), 2013.

[20]Kurita K. Chitin and chitosan: functional biopolymers from marine crustaceans [J]. Marine Biotechnology, 2006, 8(3): 203-226.

[21]楊久林, 謝紅國(guó), 于煒婷, 等. 組織工程用殼聚糖研究進(jìn)展 [J]. 功能材料, 2013, 44(11): 1521-1525.

[22]Wang YC, Chang YG, Yu L, et al. Crystalline structure and thermal property characterization of chitin from Antarctic krill (Euphausiasuperba) [J].Carbohydrate Polymers, 2013, 92(1): 90-97.

[23]Rhazi M, Desbrières J, Tolaimate A, et al.Investigation of different natural sources of chitin:in fl uence of the source and deacetylation process on the physicochemical characteristics of chitosan [J].Polymer International, 2000, 49(4): 337-344.