張霞+馬麗曼+王妍+劉春+翟艷杰+邢艷秋

【摘要】 目的：研究大鼠心肌能量代謝的底物隨年齡的變化及調(diào)節(jié)機(jī)制。方法：選用2個月和14個月的雄性SD大鼠，分別為青年對照（young & control，YC）組和老齡對照（aging & control，AC）組。實驗?zāi)┢诶贸曅膭訄D測量左心室收縮功能及舒張功能；利用高壓液相波譜分析（HPLC）測定心臟ATP的含量；應(yīng)用Western blot方法檢測心肌GLUT-4及CPT-1的表達(dá)；用臨床生化法檢測血Glu、TG、TC、LDL-C、HDL-C、AST、ALT、ALP、BUN、Cr、LDH等指標(biāo)。結(jié)果：實驗?zāi)┢冢瑑山M大鼠LVEF比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。AC組的大鼠心尖ATP含量明顯低于YC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。Western blot檢測顯示，AC組大鼠GLUT-4與CPT-1表達(dá)量較YC組均下降，GLUT-4/CPT-1比值增大（P<0.05）。YC組大鼠血清ALP水平顯著高于AC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；兩組大鼠的血清TG、Glu、TC、LDL-C、HDL-C、ALT、AST、Cr、BUN以及LD比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：大鼠隨年齡增長出現(xiàn)的心肌能量代謝改變，能量產(chǎn)生的減少早于心臟功能的改變。

【關(guān)鍵詞】 老齡化； ATP； 葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子-4； 肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶-1

【Abstract】 Objective：To observe the changes and mechanisms of energy metabolism in the aging rat heart.Method：2 months and 14 months male SD rats were chosen and divided into the young & control（YC） group and the aging & control（AC）group.At the end of the experiment using echocardiographic measurements of left ventricular systolic function and diastolic function；phase spectrum analysis using high pressure liquid （HPLC） determination of cardiac ATP expression；application of Western blot method for detection of myocardial GLUT-4

and CPT-1；by clinical biochemical assay of blood Glu，TG， TC，LDL-C，HDL-C，AST，ALT，ALP，BUN，Cr，LDH and other indicators.Result：At the end of the experiment，there was no significant difference in LVEF between the two groups （P>0.05）.The content of apical ATP in the AC group was significantly lower than that in the YC group，the difference was statistically significant（P<0.05）.Western blot analysis showed that the expression of GLUT-4 and CPT-1 in AC group were lower than those in YC group，the ratio of GLUT-4/CPT-1

was increased（P<0.05）.The serum ALP level of YC group was significantly higher than that of AC group，the difference was statistically significant（P<0.05）；the serum TG，Glu，TC，LDL-C，HDL-C，ALT，AST，Cr，BUN and LD in the two groups were not significantly different（P>0.05）.Conclusion：The change of myocardial energy metabolism in rats increases with age，and the decrease of energy production is earlier than the change of cardiac function.

【Key words】 Aging； ATP； Glucose transporter-4； Carnitine acyl transferase-1

First-authors address：Qilu Hospital of Shandong University， Jinan 250012，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.33.007

心臟是一個高耗能的器官，為了保證心臟的泵功能，每天要產(chǎn)生大量的高能代謝產(chǎn)物。因此，心臟的能量代謝直接關(guān)系到心臟的結(jié)構(gòu)和功能，而毫無疑問各種心臟疾病和病理改變也會影響到心臟的能量代謝過程[1-4]。目前研究也顯示衰老的心臟也出現(xiàn)線粒體結(jié)構(gòu)和功能異常、胰島素抵抗、脂肪酸代謝障礙等一系列的能量代謝變化。在正常生理狀態(tài)下，心臟的主要高能產(chǎn)物三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）約有30%來源于葡萄糖有氧氧化，65%來源于脂肪酸有氧氧化。而在心肌肥厚、心肌缺血以及心力衰竭等多種病理狀態(tài)時，脂肪酸氧化減少，葡萄糖氧化增加，心肌細(xì)胞的能量代謝底物轉(zhuǎn)變?yōu)橐云咸烟茄趸癁橹?，這種代謝底物的重構(gòu)與胚胎時期心肌的能量代謝底物構(gòu)成相似，有人稱其為“能量代謝胚胎型再演”現(xiàn)象[2-3]。曾有研究報道，在衰老的動物心臟和衰老的人類心臟中均出現(xiàn)脂肪酸氧化減少，并伴有整體氧化代謝水平低下[1-3]，即在衰老的心臟也出現(xiàn)了“能量代謝胚胎型再演”現(xiàn)象。但由于相關(guān)的研究非常少，關(guān)于老年心臟能量代謝的具體的變化和調(diào)節(jié)機(jī)制仍不清楚。因此，本研究擬對比觀察大鼠心臟能量代謝隨年齡變化的規(guī)律及調(diào)節(jié)。endprint

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康、雄性、清潔級SD大鼠月齡2、14個月，各8只，體質(zhì)量分別為270～350 g、600～800 g。大鼠分籠飼養(yǎng)，控制室溫為20～24 ℃、濕度為50%～60%、動物房光暗周期為12 h/12 h，飲用水及標(biāo)準(zhǔn)“大小鼠維持飼料”均經(jīng)滅菌后動物自由攝取。兩組大鼠分為老齡組和青年組：Aging & Control（AC）組8只，Young & Control（YC）組8只。

1.2 藥品與試劑 BCA法測定蛋白濃度，試劑盒由武漢博士德生物科技有限公司生產(chǎn)。ATP標(biāo)準(zhǔn)品鈉鹽由美國Sigma公司購入。GLUT-4抗體由英國abcam公司購入，肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶-1（CPT-1）抗體由北京博奧森生物科技有限公司購入，GAPDH抗體由杭州賢至生物科技有限公司購入，二抗：采用已被堿性磷酸酶作為標(biāo)記的羊抗兔抗體，由北京中杉金橋生物科技有限公司購入。

1.3 超聲心動圖 灌胃4周末，常規(guī)3%的戊巴比妥麻醉，大鼠仰臥位。于左室長軸切面測定收縮末和舒張末室間隔的厚度（IVSs、IVSd）和收縮末和舒張末左心室的內(nèi)徑（LVIDs、LVIDd），以及收縮末和舒張末左心室后壁的厚度（LVPWs、LVPWd），計算出收縮末和舒張末左室容量（LVESV、LVEDV）、左室射血分?jǐn)?shù)（EF）、左室短軸收縮分?jǐn)?shù)（FS）[5]。

1.4 血液采集 于腹主動脈采血2～3 mL，以3000 r/min的速率，離心10 min，將血清標(biāo)記之后凍存于-80 ℃冰箱備用。檢測血脂（TG）、血糖（Glu）、膽固醇（TC、LDL-C、HDL-C）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）以及乳酸脫氫酶（LDH）的含量均應(yīng)用分光光度儀測量。

1.5 HPLC測定心尖組織ATP含量 把離體的心臟置于4 ℃預(yù)冷的生理鹽水中，切取心尖部的心肌組織（大約300 mg），迅速放入液氮中，隨后轉(zhuǎn)移至-80 ℃超低溫冰箱凍存。HPLC系統(tǒng)采用ODS HYPERSIL C18色譜分析柱（規(guī)格型號：250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫為室溫（<25 ℃）；采用50 mmol/L的磷酸鉀緩沖液（pH 6.5）作為流動相，流速設(shè)置為1 mL/min；紫外線檢測波長254 nm；樣品進(jìn)樣體積20 μL；以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算ATP含量[6-7]。根據(jù)被測心肌的質(zhì)量和所含ATP量進(jìn)一步推算出每1 g心肌組織含有ATP的質(zhì)量。

1.6 Western blot檢測心肌GLUT-4和CPT-1表達(dá)情況 取30～40 mg心肌組織，常規(guī)提取心肌組織，BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，99 ℃水浴變性10 min，10%的SDS-PAGE凝膠，電泳分離，轉(zhuǎn)印硝酸纖維素膜上，室溫（25 ℃）條件下封閉1.5 h，加入一抗（GLUT-4濃度為1∶250，CPT-1濃度為1∶1000，GAPDH濃度為1∶800）4 ℃條件下孵育過夜，用TBST洗膜10 min×3次，加入二抗（堿性磷酸酶標(biāo)記，羊抗兔，濃度為1∶4000）室溫孵育1.5 h，TBST洗膜10 min×3次，采用EBCL進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯色。以GAPDH作為內(nèi)參蛋白，利用Image-J圖像分析軟件進(jìn)行相對灰度值分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 統(tǒng)計學(xué)分析均采用SPSS 17.0，計量資料采用（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組超聲心動圖指標(biāo)比較 兩組大鼠左心室射血分?jǐn)?shù)均大致正常，AC組較YC組左心室射血分?jǐn)?shù)略下降，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；兩組大鼠左室短軸縮短率、室間隔厚度、左心室舒張末期內(nèi)徑、E/A比值比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表1。

2.2 兩組大鼠心尖組織ATP含量比較 AC組大鼠左心室ATP含量為（16.80±1.60）ng/g，明顯低于YC組的（69.60±1.08）ng/g，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.3 Western blot檢測心肌組織GLUT-4和CPT-1的表達(dá) AC組大鼠心肌GLUT-4與CPT-1表達(dá)量分別為0.45±0.23、0.40±0.36，均低于YC組的0.61±0.30、0.60±0.35，AC組大鼠GLUT-4/CPT-1比值為1.12±0.56，高于YC組的1.02±0.48，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖1。

2.4 兩組大鼠相關(guān)血清學(xué)指標(biāo)比較 YC組大鼠血清ALP水平顯著高于AC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；兩組大鼠的血清TG、Glu、TC、LDL-C、HDL-C、ALT、AST、Cr、BUN以及LD比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表2。

3 討論

與人體其他器官不同，心臟依靠高耗能來維持它的高動力狀態(tài)。正常心臟每天產(chǎn)生約4 kg ATP等高能磷酸化合物，每天泵出血液約8000 L。心肌能量代謝一般分為三個階段：在心肌細(xì)胞漿內(nèi)進(jìn)行的底物利用環(huán)節(jié)，在線粒體內(nèi)進(jìn)行的氧化磷酸化環(huán)節(jié)，在細(xì)胞漿內(nèi)進(jìn)行的高能磷酸化合物的轉(zhuǎn)運(yùn)和利用環(huán)節(jié)。心臟產(chǎn)生的ATP約70%由脂肪酸有氧氧化產(chǎn)生，30%由葡萄糖有氧氧化產(chǎn)生，也有非常少量的ATP由乳酸、酮體生成。在饑餓、飽餐、運(yùn)動、應(yīng)激等反應(yīng)中，上述代謝底物的組成會發(fā)生相應(yīng)的變化。研究顯示在心肌缺血、心肌肥厚、心力衰竭以及衰老等病理、生理情況下，心肌能量的代謝在各個環(huán)節(jié)均發(fā)生了不同改變以維持心臟高能磷酸化合物的生成，而在底物利用環(huán)節(jié)，最主要的表現(xiàn)是能量代謝底物組成的比率發(fā)生了變化，即脂肪酸和葡萄糖氧化的比率發(fā)生了變化[4]。

衰老是正常的生理變化，但也是心臟病的獨立危險因素，尤其是心功能減退和各種心臟退行性疾病，發(fā)病率隨著年齡的增加而明顯增加，這種相關(guān)性獨立于動脈粥樣硬化和高血壓等心臟疾病之外[8-12]。而衰老引起的心臟結(jié)構(gòu)和功能改變，與衰老心臟的能量代謝紊亂有密切的關(guān)系。而這種代謝紊亂表現(xiàn)在代謝底物的改變、線粒體功能減退、高能磷酸化合物合成障礙。本研究也證實在衰老心臟發(fā)生了底物利用的改變。endprint

有多種脂肪酸參與心肌細(xì)胞的氧化過程，其中人類心肌細(xì)胞最常見的是十八烯酸（oleic acid），脂肪酸的攝取是一個主動的過程，長鏈脂肪酸先轉(zhuǎn)化為脂酰輔酶A，在肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶-1（CPT-1）作用下進(jìn)入線粒體進(jìn)行脂肪酸的β氧化，這一過程是脂肪酸氧化的關(guān)鍵限速步驟，CPT-1也是脂肪酸氧化的關(guān)鍵酶[4]。因此，檢測CPT-1的表達(dá)量可以準(zhǔn)確的反映脂肪酸的氧化利用情況。

葡萄糖幾乎可用于全身的能量合成，心肌細(xì)胞葡萄糖的攝取依賴于血液直接攝取，也可以由細(xì)胞內(nèi)的糖原轉(zhuǎn)化而來。葡萄糖的有氧氧化因為高效率、高彈性在心肌能量供應(yīng)中占有非常重要的地位。心肌細(xì)胞攝取葡萄糖依靠細(xì)胞膜上的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（GLUT-1）和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（GLUT-4）[13-16]，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是葡萄糖氧化的關(guān)鍵限速酶。葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)速度依賴于葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)量，在心肌缺血、飽餐、運(yùn)動等生理及病理情況下，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)量會明顯增加。本研究選擇心肌細(xì)胞GLUT-4的表達(dá)量來反映葡萄糖的氧化利用情況。

文獻(xiàn)[17-20]研究顯示，在老齡化的心臟，能量代謝存在著“胚胎型再演”的現(xiàn)象，整體氧化代謝能力減低，生成的總ATP減少。本研究結(jié)果也證實：YC組大鼠GLUT-4/CPT-1比值接近1，顯示在年輕的大鼠心臟中葡萄糖和脂肪酸的氧化利用率基本相當(dāng)，而AC組大鼠心臟兩者比值較YC組升高（P<0.05），說明隨著年齡的增長，大鼠心肌能量代謝底物逐漸轉(zhuǎn)向依賴葡萄糖代謝為主；AC組GLUT-4和CPT-1表達(dá)量均較YC組有所下降（P<0.05），說明隨著年齡的增長，大鼠心臟利用葡萄糖及脂肪酸的能力均有所下降，其整體氧化代謝能力減低；本實驗檢測AC組大鼠心肌ATP含量明顯降低，甚至出現(xiàn)心臟收縮/舒張功能減退的趨勢。

隨著大鼠老齡化，心臟整體氧化能力降低，心肌葡萄糖代謝和脂肪酸代謝下降，心臟代謝底物轉(zhuǎn)化為以葡萄糖為主，心臟ATP濃度下降，甚至出現(xiàn)大鼠心臟收縮/舒張功能減退。

參考文獻(xiàn)

[1] Sung M M，Dyck J R.Energy Metabolism in the aging heart[J].Heart & Metabolism，2011，52：3-7.

[2] Lopaschuk G D，Belke D D，Gamble J，et al.Regulation of fatty acid oxidation in the mammalian heart in health and disease[J].Biochimica Et Biophysica Acta，1994，1213（3）：263-276.

[3] Koonen D P，F(xiàn)ebbraio M，Bonnet S，et al.CD36 expression contributes to age-induced cardiomyopathy in mice[J].Circulation，2007，116：2139-2147.

[4]殷仁富，陳金明.心臟能量學(xué)：代謝與治療[M].上海：第二軍醫(yī)大學(xué)出版社，2002.

[5]劉聰聰.左西孟旦和尼可地爾治療心力衰竭的療效及其作用機(jī)制評價[D].濟(jì)南：濟(jì)南大學(xué)，2013.

[6]張玲，潘杰.高效液相色譜法測定小鼠心肌組織中ATP、ADP、AMP的含量[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2008，28（21）：1888-1890.

[7]繆宇，王承龍，殷惠軍，等.高效液相色譜測定大鼠心肌組織腺苷酸含量[J].北京大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2005，37（2）：201-202.

[8]姜國良，于曉，徐愷，等.腹腔和皮下注射D-半乳糖衰老大鼠模型分析[J].中國老年學(xué)雜志，2013，33（5）：1101-1103.

[9] Kates A M，Herreo P，Dence C，et al.Impact of aging on substrate metabolism by the human heart[J].J Am Coll Cardiol，2003，41（2）：293-299.

[10]朱慶磊，楊契，薛橋，等.人工致衰老和自然衰老小鼠抗氧化能力改變的對比研究[J].中國老年學(xué)雜志，2003，23（7）：448-450

[11] Desler C，Hansen T L，F(xiàn)rederiksen J B，et al.Is There a Link between Mitochondrial Reserve Respiratory Capacity and Aging[J].J Aging Res，2012，2012：192 503.

[12] Tocchi A，Quarles E K，Basisty N，et al.Mitochondrial dysfunction in cardiac aging[J].Biochim Biophys Acta，2015，1847（11）：1424-1433.

[13] Kolwicz S C，Purohit S，Tian R.Cardiac Metabolism and its Interactions With Contraction， Growth， and Survival of Cardiomyocytes[J].Circulation Research，2013，113（5）：603-616.

[14]關(guān)付，于波.心肌細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的研究進(jìn)展[J].心血管病學(xué)進(jìn)展，2005，26（4）：338-342.

[15] Soraya H，Masoud W G，Gandhi M，et al.Myocardial mechanical dysfunction following endotoxemia：role of changes in energy substrate metabolism[J].Basic Res Cardiol，2016，111（2）：24.

[16]李為民，劉怡希.心臟能量代謝重構(gòu)研究進(jìn)展[J].中國醫(yī)學(xué)前沿雜志，2013，5（4）：8-11.

[17]于成瑤，王碩仁，趙明鏡，等.自然衰老生理性心氣虛大鼠心臟能量代謝酶學(xué)的物質(zhì)基礎(chǔ)研究[J].山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2008，30（4）：337-338.

[18]孫忠實.衰竭心臟能量代謝藥物治療新策略-兼評磷酸肌酸二鈉的臨床應(yīng)用[J].中國醫(yī)院用藥評價與分析，2016，16（1）：6-9.

[19]王文艷，鐘萍，謝紅軍，等.正電子發(fā)射斷層顯像評價衰老心肌葡萄糖代謝的變化[J].中華老年心腦血管病雜志，2010，12（4）：292-294.

[20]張會珍，邢艷秋，肖冬，等.磷酸肌酸聯(lián)合缺血后適應(yīng)對大鼠心肌缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用[J].中國藥理學(xué)通報，2012，28（11）：1611-1614.

（收稿日期：2017-10-12） （本文編輯：張爽）endprint