張揚(yáng)+方富+林元相

[摘要] 目的 研究AKT/HIF/VEGF信號(hào)通路與p-NMDAR2B在難治性癲癇相關(guān)性FCD致癇灶中的作用及相關(guān)因素分析，探討兩者在FCD致癇灶中的作用及相關(guān)因素分析。方法 該研究于2010年1月—2015年1月間方便選取在福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科進(jìn)行手術(shù)治療的50例難治性癲癇患者，所有患者均經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)為FCD，將術(shù)后病灶腦組織進(jìn)行研究分析，作為實(shí)驗(yàn)組；其中FCDⅠ型30例，F(xiàn)CDⅡ型20例。同時(shí)另外選取50例行減壓或清創(chuàng)手術(shù)的腦外傷患者，將術(shù)中獲取的和各種病變患者手術(shù)入路不可避免要切除的正常腦組織進(jìn)行研究，納入對(duì)照組。均利用免疫組織化學(xué)染色和Western blot方法檢測(cè)上述腦組織中的p-AKT1/2/3（Thr308）、HIF-1、VEGF以及p-NMDAR2B（Tyr1336）的表達(dá)情況和蛋白水平。觀察各型癲癇患者和正常腦組織p-AKT1/2/3（Thr308）、HIF-1、VEGF以及p-NMDAR2B（Tyr1336）的表達(dá)情況、免疫組化積分情況以及β-actin灰度比值情況。 結(jié)果 ①各型難治性癲癇相關(guān)性FCD致癇灶中AKT/HIF/VEGF信號(hào)通路發(fā)生不同程度激活表現(xiàn)，屬異?，F(xiàn)象。②Western blot：p-AKT1/2/3（Thr308）、HIF-1、VEGF以及p-NMDAR2B（Tyr1336）在FCDⅠ型病灶中表達(dá)水平分別為（0.619 3±0.078 4）、（0.779 2±0.039 1）、（0.752 8±0.099 4）以及（0.641 4±0.091 9）；在FCDⅡ型病灶中表達(dá)水平分別為（0.885 9±0.031 1）、（0.862 9±0.035 5）、（0.839 2±0.038 1）以及（0.908 8±0.037 3），均明顯高于正常腦組織的（0.404 2±0.084 9）、（0.467 9±0.013 8）、（0.479 8±0.045 1）以及（0.349 2±0.090 7），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 AKT/HIF/VEGF信號(hào)通路可能是通過調(diào)控NMDA受體活性參與了FCD相關(guān)難治性癲癇的發(fā)生發(fā)展。

[關(guān)鍵詞] 局灶性皮質(zhì)發(fā)育不良；難治性癲癇；機(jī)制；AKT/HIF/VEGF信號(hào)通路；NMDA受體

[中圖分類號(hào)] R737 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-0742（2017）10（c）-0015-04

The Significance and Relativity Analysis of AKT/HIF/VEGF Signal Path and p-NMDAR2B in the Epileptogenic Zone of the Focal Cortical Dysplasias Relative Intractable Epilepsy

ZHANG Yang1， FANG Fu2， LIN Yuan-xiang2

1.Neurosurgical Department， Fujian Provincial Hospital， Fuzhou， Fujian Province， 350001 China； 2.Neurosurgical Department， the First Hospital Affiliated to the Fujian Medical University， Fuzhou， Fujian Province， 350005 China

[Abstract] Objective This paper tries to investigate the role and correlation of AKT / HIF / VEGF signaling pathway and p-NMDAR2B in refractory epilepsy-related FCD-induced epileptic foci， and to explore the role and correlation of AKT / HIF / VEGF signaling pathway in FCD-induced epileptic foci. Methods In this study， 50 patients with refractory epilepsy who underwent surgical treatment at the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University from January 2010 to January 2015. All patients were convenient confirmed to be FCD by postoperative pathology. The postoperative brain tissue was performed and analyzed， as the experimental group； of which 30 cases of FCD Ⅰ， 20 cases of FCD Ⅱ type. At the same time， 50 patients with brain injury undergoing decompression or debridement were selected. The normal brain tissue was removed from the control group. The p-AKT1/2/3 （Thr308）， HIF-1， VEGF and p-NMDAR2B （Tyr1336） in the brain tissue were detected by immunohistochemical staining and Western blot. The expressions of p-AKT1/2/3 （Thr308）， HIF-1， VEGF and p-NMDAR2B （Tyr1336） in the epilepsy and normal brain tissues were observed. The expressions of immunohistochemistry and β-actin gray ratio were observed. Results ①Various types of refractory epilepsy-related FCD-induced epilepsy in the AKT / HIF / VEGF signaling pathway to varying degrees of activation performance were abnormal phenomena. ②Western blot： The expression levels of PIF-AKTb 1/2/3 （Thr308）， HIF-1α， VEGF and p-NMDAR2B（Tyr1336） in FCD Ⅰ lesions were （0.619 3±0.078 4）， （0.779 2±0.039 1）， （0.752 8±0.099 4）， （0.641 4±0.091 9） respectively， and those in FCDⅡwere （0.885 9±0.031 1）， （0.862 9±0.035 5）， （0.8392±0.0381） and （0.908 8±0.037 3）， which were significantly higher than those in the control group of （0.404 2±0.084 9）， （0.467 9±0.013 8）， （0.479 8±0.045 1） and （0.349 2±0.090 7）， the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion The AKT / HIF / VEGF signaling pathway may be involved in the development of FCD-associated refractory epilepsy by regulating NMDA receptor activity.endprint

[Key words] Focal cortical dysplasia； Refractory epilepsy； Mechanism； AKT/HIF/VEGF signaling pathway； NMDA receptor

癲癇是臨床兒科最常見疾病之一，雖然近年來(lái)抗癲癇藥物不斷出現(xiàn)，但仍然有部分患兒進(jìn)展為難治性癲癇，給患兒帶來(lái)極大危害。隨著對(duì)難治性癲癇的不斷深入研究，顯示難治性癲癇與AKT/HIF/VEGF以及p-NMDAR2B等信號(hào)通路有密切關(guān)系。因此該文對(duì)福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科2010年1月—2015年1月期間收治的50例難治性癲癇患者作為研究對(duì)象，探討AKT/HIF/VEGF信號(hào)通路與p-NMDAR2B在難治性癲癇相關(guān)性FCD致癇灶中的作用及相關(guān)性分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

該研究方便選取在福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科進(jìn)行手術(shù)治療的50例難治性癲癇患者，所有患者均經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)為FCD，將術(shù)后病灶腦組織蠟塊進(jìn)行研究分析，根據(jù)2011年國(guó)際抗癲癇聯(lián)盟專家共識(shí)標(biāo)準(zhǔn)重新分類[1]，該次研究中實(shí)驗(yàn)組所有蠟塊均行HE染色后分類評(píng)估，結(jié)果表明符合診斷為FCDⅠ型30例，F(xiàn)CDⅡ型20例。排除標(biāo)準(zhǔn)：不典型病變、存在FCD診斷爭(zhēng)議、血管畸形、腦軟化灶、良性腫瘤、海馬硬化等FCDⅢ型。

同時(shí)另外選取50例行減壓或清創(chuàng)手術(shù)的腦外傷患者，將術(shù)中獲取的和各種病變患者手術(shù)入路不可避免要切除的正常腦組織進(jìn)行研究，納入對(duì)照組。這些患者之前無(wú)驚厥史和其他神經(jīng)病史，納入標(biāo)準(zhǔn)：該次研究已取得患者及家屬知情同意；取得福建醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合各項(xiàng)準(zhǔn)則。

1.2 標(biāo)本分組及石蠟切片制作

分實(shí)驗(yàn)組1（FCDⅠ型30例）、實(shí)驗(yàn)組2（FCDⅡ型20例）以及對(duì)照組（正常腦組織8例）。

1.2.1 取材、固定、標(biāo)本切片 取得標(biāo)本后，分成2個(gè)部分，一部分立即浸泡于10%福爾馬林溶液中固定，固定時(shí)間>24 h，予石蠟包埋，逐步進(jìn)行腦組織脫水透明浸蠟，切片備用。另一部分組織取出后放液氮保存1 h后移到-80℃冰箱保存，做好標(biāo)記予Western blot備用。

1.2.2 結(jié)果判定 在神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞中，觀察p-AKT1/2/3（Thr308）、HIF-1、VEGF以及p-NMDAR2B（Tyr1336）表達(dá)結(jié)果顯示免疫組化染色陽(yáng)性結(jié)果為棕黃色或棕褐色顆粒[1]。

1.3 Western blot

經(jīng)過以下步驟：采用組織裂解方法進(jìn)行蛋白樣本提取制備，采用BCA法蛋白定量，及 SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉及雜交、曝光等步驟，最后進(jìn)行結(jié)果判定。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

免疫組化得分和Western blot灰度值相關(guān)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，使用GraphPad Prism統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；采用SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，根據(jù)數(shù)據(jù)特征獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，結(jié)合方差齊性分析得出統(tǒng)計(jì)結(jié)果，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

各指標(biāo)在FCDⅠ型、Ⅱ型及正常腦組織中總體半定量分析、免疫組化積分得分情況表1、表2；各指標(biāo)在FCDⅠ型和Ⅱ型免疫組化得分情況見表3；各組指標(biāo)與 -actin灰度比值分析件表4；各指標(biāo)在FCDⅠ型和Ⅱ型 -actin灰度比值分析見表5。

3 討論

國(guó)內(nèi)外對(duì)于FCD致癇機(jī)制的研究仍不十分明確，目前普遍認(rèn)為是由于興奮性與抑制性神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)紊亂，亦可其受體損害所致[1-3]。

AKT/HIF/VEGF是一條經(jīng)典的血管機(jī)制信號(hào)通路[4]，已有研究發(fā)現(xiàn)此信號(hào)通路不僅僅作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，還可以直接作用于神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞。PI3K是一種可使肌醇環(huán)上第3位羥基磷酸化的磷脂酰肌醇激酶，PI3K活化后，其可使細(xì)胞膜上的肌醇磷酸化，磷酸化過程中產(chǎn)生的第二信使結(jié)合AKT及下游信號(hào)通路；AKT在Thr308磷酸化后被活化為p-AKT，直接或間接調(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)及影響凋亡蛋白活性的表達(dá)[5-6]。

該實(shí)驗(yàn)針對(duì)難治性癲癇相關(guān)性FCD致癇灶中p-AKT1/2/3（Thr308）、HIF-1、VEGF以及p-NMDAR2B（Tyr1336）的表達(dá)情況和蛋白水平，檢測(cè)FCD致癇灶中是否存在上述各指標(biāo)的差異表達(dá)，AKT/HIF/VEGF信號(hào)通路是否異常激活，VEGF與p-NMDAR2B在FCD相關(guān)性難治性癲癇的發(fā)生發(fā)展中是否存在一定的因果關(guān)系。我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，p-AKT1/2/3（Thr308）、HIF-1、VEGF以及p-NMDAR2B（Tyr1336）在FCDⅠ型病灶中表達(dá)水平分別為（0.619 3±0.078 4）、（0.779 2±0.039 1）、（0.752 8±0.099 4）以及（0.641 4±0.091 9）；在FCDⅡ型病灶中表達(dá)水平分別為（0.885 9±0.031 1）、（0.862 9±0.035 5）、（0.839 2±0.038 1）以及（0.908 8±0.037 3），均明顯高于正常腦組織的（0.404 2±0.084 9）、（0.467 9±0.013 8）、（0.479 8±0.045 1）以及（0.349 2±0.090 7），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），也進(jìn)一步證實(shí)了目前的研究觀點(diǎn)。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，p-AKT對(duì)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞均起到一定的影響作用，主要表現(xiàn)在細(xì)胞的增值，分化遷徙以及細(xì)胞的存活；在FCD相關(guān)的難治性癲癇發(fā)作期間，存在有皮層神經(jīng)元缺血缺氧，這種病灶微環(huán)境能夠通過激活PI3K/AKT信號(hào)通路，誘導(dǎo)AKT磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)HIF-1蛋白表達(dá)；而HIF-1在胞漿中表達(dá)增高趨勢(shì)，逐漸轉(zhuǎn)移至核內(nèi)；進(jìn)而推測(cè)在FCD中存在有p-AKT介導(dǎo)HIF/VEGF信號(hào)通路的激活。然而誘導(dǎo)VEGF表達(dá)的分子機(jī)制可能是HIF-1[7]，在缺氧環(huán)境下，作為一種核轉(zhuǎn)錄因子，能夠上調(diào)VEGF的轉(zhuǎn)錄翻譯；尤其是在癲癇長(zhǎng)時(shí)間發(fā)作比如癲癇持續(xù)狀態(tài)，缺氧對(duì)于誘導(dǎo)VEGF表達(dá)是一個(gè)重要的扳機(jī)點(diǎn)[8]。其他的轉(zhuǎn)錄因子如AP-1、NF-κB以及炎癥因子IL-1β證明也存在有上調(diào)VEGF表達(dá)的作用。endprint

該研究發(fā)現(xiàn)在FCD中AKT/HIF/VEGF信號(hào)通路異常激活，且誘導(dǎo)表達(dá)的VEGF和p-NMDAR2B上調(diào)與FCD相關(guān)性難治性癲癇有關(guān)，若以兩者為切入點(diǎn)，可能為癲癇的臨床治療提供更為廣闊的應(yīng)用前景，為抗癲癇尋求新的治療靶點(diǎn)，對(duì)抗癲癇新藥的研制提供新的思路。

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（收稿日期：2017-07-22）endprint