張振山 李萍萍 樂淵 劉春華

摘 要 建立了分散固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測砂仁中15種有機(jī)磷類農(nóng)藥殘留量的方法，并對16個(gè)不同產(chǎn)地的砂仁藥材進(jìn)行農(nóng)藥殘留測定。砂仁樣品經(jīng)乙腈（含1%甲酸）提取和鹽析劑鹽析后加入N-丙基乙二胺（PSA）、十八烷基鍵合硅膠吸附劑（C18）和無水硫酸鎂進(jìn)行基質(zhì)固相分散萃取、凈化，采用超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜在多反應(yīng)檢測模式（MRM）下測定，外標(biāo)法定量。15種農(nóng)藥成分在0.005～0.100 mg/L有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)在0.999～1.000；15種農(nóng)藥成分在3個(gè)添加水平下（100、200和400 μg/kg），加標(biāo)回收率范圍為70.0%～120.0%，RSD%（n=3）為0.5%～9.5%；各農(nóng)藥成分的檢出限在0.1～2.0 μg/kg。該方法可應(yīng)用于多產(chǎn)地的砂仁藥材中15種有機(jī)磷類農(nóng)藥殘留的檢測。

關(guān)鍵詞 砂仁 ；有機(jī)磷類農(nóng)藥 ；分散固相萃取技術(shù) ；農(nóng)藥殘留監(jiān)測

中圖分類號(hào) O657.63 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.09.016

Abstract A determination method for 15 phosphate pesticides in Amomum villosum Lour. was established by using ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS） with offline disperse solid phase extraction. The pesticide residues in the samples of A. villosum Lour collected from 16 areas were determined. The A. villosum samples were extracted with acetonitrile （containing 0.1% formic acid）， followed by salting-out， and the extracts were further purified by N-（n-propyl）ethylenediamine （PSA）， C18 and anhydrous magnesium sulfate. The prepared samples were analyzed by the UPLC-MS under Multi Reaction Monitor （MRM）， and the external standard method was applied to quantify the pesticides. These 15 pesticides showed a good linearity in the range of 0.005 mg/L～0.100 mg/L（r=0.999-1.000）. The average recoveries of all the pesticides were in the range of 70.0%～120.0% at the three spiked levels （100 μg/kg， 200 μg/kg and 400 μg/kg）， and the RSD （n=3） was in the range of 0.5%～9.5%. The limit of detection （LOD） was 0.1 μg/kg～2.0 μg/kg. This determination method was suitable for the analysis of 15 phosphate pesticides in A. villosum Lour.

Keywords Amomum villosum Lour. ； phosphate pesticide ； disperse solid phase extraction ； pesticide residues monitoring

砂仁是一味常用的中草藥和菜肴調(diào)味品，為四大南藥之一，具有化濕開胃，溫脾止瀉，理氣安胎的功效，用于治療濕濁中阻脘痞不饑，脾胃虛寒，嘔吐泄瀉，妊娠惡阻，胎動(dòng)不安等癥[1]。隨著現(xiàn)代科學(xué)的發(fā)展，砂仁在治療消化系統(tǒng)方面問題的功效越來越受到人們的關(guān)注，砂仁的人工種植規(guī)模在逐步擴(kuò)大[2]。

有機(jī)磷農(nóng)藥是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用最廣泛的農(nóng)藥之一，具有廉價(jià)、高效、廣譜以及低生物累積性的特點(diǎn)[3]。但有機(jī)磷農(nóng)藥對人體健康具有極大的危害，即使暴露于小劑量的有機(jī)磷化合物也會(huì)致命，中毒者常常由于橫膈膜和肋間肌麻痹以及氣道過多的分泌物引起呼吸衰竭而導(dǎo)致死亡，每年導(dǎo)致約20萬人死亡，因此要嚴(yán)格控制有機(jī)磷的殘留量[4]。目前，《中國藥典》2015年版對中藥材中有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測方法為氣相色譜法，本文選取了倍硫磷等15種有機(jī)磷農(nóng)藥，建立了中藥砂仁的超高效液相-質(zhì)譜法的多殘留檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用16批砂仁樣品來自廣東、云南、海南、廣西的藥材基地和藥材市場（表1）。經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，過3號(hào)篩（藥典篩，50目），裝于密封袋中，置于干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 儀器

Triple Quad 4500液相色譜三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國SCIEX公司；ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（50.0 mm×2.1 mm；1.7 μm），美國Waters公司；IKAT 18高速均質(zhì)器，德國IKA公司；高速冷凍離心機(jī)，美國VISION公司；渦旋混合儀，上海青浦滬西儀器廠。

1.1.3 試劑

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：倍硫磷，丙溴磷，三唑磷，伏殺硫磷，甲胺磷，二嗪磷，馬拉硫磷，殺螟硫磷，滅線磷、治螟磷，地蟲硫磷，苯線磷，內(nèi)吸磷，久效磷，保棉磷；農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品均為體積分?jǐn)?shù)1 000 μg/mL，購自天津農(nóng)業(yè)部環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心。液相色譜（HPLC）級(jí)乙腈、甲醇和二氯甲烷購自美國Fisher Sci-entific公司；醋酸銨、無水硫酸鎂、氯化鈉均為國產(chǎn)分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司；超純水以美國Millipore公司Milli-Q超純水系統(tǒng)制備獲得；0.22 μm微孔濾膜購自安譜實(shí)驗(yàn)科技（上海）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.2.1.1 農(nóng)藥單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液

各取1 mL（1000 μg/mL）農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L的單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，儲(chǔ)存于-18℃冰箱中備用。

1.2.1.2 混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液

各取0.10 mL上述單個(gè)農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為1.00 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。再取1.00 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液1.00 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為0.10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.1.3 系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液

分別移取混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液0.05，0.1、0.2、0.5、1.0 mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液于5.00 mL的容量瓶中，用甲醇水溶液（50%）溶解并定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度分別為0.01、0.02、0.04、0.10和0.20 μg/mL的系列濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.1.4 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液

精確稱取5.00 g空白砂仁樣品各5份，按1.2.2方法進(jìn)行樣品處理后，分別移取1.00 mL的上清液和系列標(biāo)準(zhǔn)濃度工作液按照體積比1∶1混合均勻，配制成濃度分別為0.005、0.01、0.02、0.05和0.10 μg/mL的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照1.2.3儀器工作條件，以待測物定量離子的峰面積對質(zhì)量濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到15種有機(jī)磷類農(nóng)藥的線性方程及相關(guān)系數(shù)。

1.2.2 樣品的前處理

取16批藥材粉末，精密稱定5.00 g，置于100 mL離心管，加10 mL水浸泡15 min，加入4 g氯化鈉和2 g無水硫酸鈉，再精密加入20 mL乙腈（含1%甲酸），3 000 r/min渦旋震動(dòng)60 s，再以5 000 r/min離心5 min。再取上層溶液5.0 mL于預(yù)先加200 mg PSA、200 mg C18及1 000 mg MgSO4的離心管中，渦旋60 s，再以5 000 r/min離心5 min 。取1 mL上清液與1.0 mL甲醇水溶液（50%）1∶1混合，過0.22 μm微孔濾膜，待UPLC-MS/MS分析。

1.2.3 儀器工作條件

1.2.3.1 UPLC工作條件

ACQUITY_UPLCTM BEH C18 1.7 μm 2.1×50 mm Column色譜柱，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量：5 μL，流動(dòng)相A為1.0 mmol/L乙酸銨溶液（pH=4.5），流動(dòng)相B為甲醇；梯度洗脫程序：0～2.0 min，90%～30%A；2 ～2.5 min，30% A；2.5～7.0 min，30%～5%A；7.0～9.0 min，5%A；9.0～9.1 min，5%A～90%A；9.1 ～10.0 min，90%A。流速為0.25 mL/min。

1.2.3.2 ESI-MS/MS 工作條件

正離子電離模式：毛細(xì)管電壓，5 500V；離子源溫度，550℃；霧化氣壓力，344.7 kPa；去溶劑氣壓力，413.7 kPa；氣簾氣壓力，172.4 kPa；碰撞氣壓力，55.2 kPa。多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）下的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 譜圖分析

在電噴霧離子源電離模式下，分別對15種有機(jī)磷類農(nóng)藥的單標(biāo)溶液進(jìn)行母離子全掃描，再對各自的子離子進(jìn)行全掃描，每個(gè)化合物選擇2對響應(yīng)值較高的特征離子作為定量離子和定性離子，并優(yōu)化得到相應(yīng)的去簇電壓、碰撞能量等參數(shù)，結(jié)果見表2。

取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜，獲得15種農(nóng)藥成分的總離子流圖（圖1）和MRM色譜圖（圖2），各農(nóng)藥對應(yīng)的保留時(shí)間見表2。

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證和樣品測定

2.2.1 線性范圍的考察

取1.2.1中的系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行液質(zhì)分析，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，在5.0～100.0 μg/L，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2均≥0.999，結(jié)果見表3。

2.2.2 定量限

取編號(hào)1的藥材（經(jīng)檢測不含15種有機(jī)磷農(nóng)藥），加入標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行樣品添加實(shí)驗(yàn)，按照1.2.2提取方法進(jìn)行前處理試驗(yàn)并上機(jī)，以3倍信噪比（S/N）計(jì)算砂仁中15種農(nóng)藥的檢測限，各農(nóng)藥的方法檢測限在0.36 ～1.32 μg/kg 。根據(jù)10倍信噪比計(jì)算理論定量限在1.2 ～4.4 μg/kg。為配合實(shí)際樣品和定量準(zhǔn)確， 本試驗(yàn)從添加水平 0.2 μg/kg 一直添加到5.0 μg/kg ，通過添加回收率試驗(yàn)的要求，發(fā)現(xiàn)添加濃度到 4.0 μg/kg 時(shí)，回收率均符合定量限的要求（表4）。因此，砂仁中15 種有機(jī)磷農(nóng)藥的定量限通過實(shí)際添加回收試驗(yàn)最終確定為 0.004 mg/kg。

2.2.3 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

結(jié)合定量限和倍硫磷等農(nóng)藥的MRL值，選取0.004 0、0.006 4和0.050 mg/kg作為加樣回收試驗(yàn)的3個(gè)添加濃度，取編號(hào)1的藥材，按照1.2.2提取方法，計(jì)算15種農(nóng)藥回收率，每個(gè)水平平行測定3次 ，平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD見表5。結(jié)果表明， 15 種農(nóng)藥殘留的平均回收率范圍為 73.7%～118.1%；相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為 0.6%～9.6%，均滿足定量分析要求。

2.2.4 樣品測定

對市售的16批砂仁 ，按照上述的樣品前處理方法和儀器分析條件下進(jìn)行檢測 ，每份樣品平行測定2次，并未在樣品中檢測出15種有機(jī)磷類農(nóng)藥的存在。

3 結(jié)論與討論

3.1 前處理?xiàng)l件的選擇

中草藥成分復(fù)雜，干擾物多。砂仁是姜科植物果實(shí)，除富含乙酰龍腦酯、樟腦等揮發(fā)性成分外，也含有色素、脂肪酸、多糖、鞣質(zhì)等成分[5]，在對樣品檢測前，需要對樣品進(jìn)行一定的凈化處理，以防對于待測組分的干擾。目前，GPC、固相萃?。⊿PE）及各種吸附劑的基質(zhì)固相分散技術(shù)被廣泛用于復(fù)雜基質(zhì)樣品的凈化[6]。QuEChERS是近年來國內(nèi)外在食品檢測中應(yīng)用十分普遍的一項(xiàng)前處理技術(shù)，具有操作簡單、速度快、回收率高、可分析的農(nóng)藥范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，但凈化能力較差[7]。因此，許多研究者在其基礎(chǔ)上尋找更多的吸附凈化劑不斷地改進(jìn)方法，如加入十八烷基鍵合硅膠吸附劑（C18）、石墨化碳黑（GCB）、氨丙基粉等[8-9]。本試驗(yàn)采用含1%甲酸的乙腈提取砂仁樣品，再以PSA+C18作為吸附劑來凈化砂仁提取液，PSA可以有效地吸附砂仁藥材中的有機(jī)酸、鞣質(zhì)等極性成分，C18則可去除砂仁中的一些非極性成分，15種農(nóng)藥在5.0～100.0 μg/L范圍內(nèi)線性良好，R2均≥0.999，在0.004 0、0.0064和0.050 mg/kg 3個(gè)添加水平進(jìn)行回收試驗(yàn)，15種農(nóng)藥回收率在在70%～120%。

3.2 色譜條件的選擇

目前，檢測和分析食品中的有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的方法一般都采用氣相色譜法。中國藥典2015版收載方法也為采用氣相-氮磷檢測器或火焰光度計(jì)進(jìn)行檢測，但檢測甲胺磷、水胺硫磷等對熱不穩(wěn)定的農(nóng)藥時(shí)，氣相色譜法的抗干擾能力較弱，樣品前處理方法也較復(fù)雜[10-11]。砂仁為芳香性較強(qiáng)的中藥，采用氣相色譜測定時(shí)，受到的干擾成分較多，常引起襯管和色譜柱的污染，影響儀器的靈敏度。本文采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測砂仁，方法簡便快捷，靈敏度高，基質(zhì)效應(yīng)小，準(zhǔn)確度高，適用于砂仁中有機(jī)磷類農(nóng)藥的檢測。

3.3 樣品測定

砂仁目前主要產(chǎn)于廣東、廣西、云南、海南四省，以云南、廣東產(chǎn)量最高，云南栽培面積最廣[12]。隨著人民健康意識(shí)的提高，砂仁的經(jīng)濟(jì)價(jià)值在逐步提高，也刺激著藥農(nóng)的種植熱情。砂仁目前常見的病蟲害有炭疽病、苗疫病、立枯病，葉斑病，鉆心蟲，白粉病、螻蛄、金龜子等，由于目前國內(nèi)中藥的田間管理技術(shù)還比較薄弱，偶有民間噴施甲胺磷、五氯硝基苯等農(nóng)藥的現(xiàn)象。本文采集的16批藥材中，經(jīng)檢測，并未有倍硫磷等15種有機(jī)磷類農(nóng)藥的檢出，推測原因?yàn)槭占臉悠范鄟碓从诋?dāng)?shù)氐乃幉姆N植基地，收集的散戶藥材較少。但建立砂仁中有機(jī)磷農(nóng)藥的液質(zhì)檢測方法，對于砂仁中有機(jī)磷農(nóng)藥的防控監(jiān)測提供了一項(xiàng)重要技術(shù)手段，同時(shí)，也可以為姜科同屬的其他作物和藥材的檢測提供技術(shù)依據(jù)，具有一定的參考意義。

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