代玉芳 向詩非 何三山 盛嬌娥 張巍瓊 趙小丹 武清超 向 陽 蘇林沖

(湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院風(fēng)濕科風(fēng)濕性疾病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，恩施 445000)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE)是慢性自身免疫性疾病，病情進(jìn)展迅速，多臟器受累，生活質(zhì)量差，病死率高，嚴(yán)重危害患者健康[1]。目前還沒有治愈方法，多為激素聯(lián)用免疫抑制劑。羥氯喹(Hydroxychloroquine，HCQ)目前是臨床治療SLE的一線用藥，應(yīng)用廣泛，作用于免疫系統(tǒng)能夠抑制巨噬細(xì)胞抗原呈遞，抑制淋巴細(xì)胞增殖、免疫復(fù)合物的形成、炎性因子分泌、機(jī)體的免疫應(yīng)答，對(duì)SLE臨床療效較好，但其具體治療機(jī)制仍不確切[2]。

研究報(bào)道顯示，SLE患者存在自身淋巴細(xì)胞失衡，T淋巴細(xì)胞過度活化，引起多克隆B細(xì)胞激活分化增加，且機(jī)體對(duì)過多的免疫細(xì)胞清除能力下降，機(jī)體免疫系統(tǒng)失去平衡，大量自身抗體產(chǎn)生，多器官受累，引起一系列臨床癥狀[3，4]。研究發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血淋巴細(xì)胞凋亡率增高，并且與患者疾病的活動(dòng)程度呈現(xiàn)為正相關(guān)關(guān)系[5,6]。因此，在此項(xiàng)研究中，我們以SLE患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)為研究對(duì)象，觀察HCQ對(duì)SLE患者PBMCs凋亡的作用，并研究其相關(guān)機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對(duì)象 選取2014年1月至2016年12月我院診斷SLE患者共30例，平均年齡(32±8)歲，女性26例，男性4例。所有患者符合ACR1997的SLE分類標(biāo)準(zhǔn)，所有患者均處于活動(dòng)期，均為初發(fā)SLE，未使用免疫抑制劑治療。另外選取我院體檢中心健康患者15例，女性13例，男性2例，近期未出現(xiàn)感染及無免疫相關(guān)病史。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并簽署知情同意書。

1.1.2主要試劑和儀器 硫酸羥氯喹片購自賽諾菲公司；MTT、LY294002購自美國Sigma公司；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶購于美國Gibco公司；Annexin V- FITC/PI雙染流式細(xì)胞檢測(cè)試劑盒購于美國Invitrogen公司；Gallios流式細(xì)胞儀(美國 Beckman公司);SDS- 聚丙烯酰胺、PBST溶液、垂直電泳儀及GIS- 2020D凝膠圖像分析系統(tǒng)購于Sigma公司；bcl- 2、bax、PI3K、pAKt及mTOR抗體購于美國Abcam公司；二抗購自中杉金橋公司。

1.2方法

1.2.1PBMCs的分離培養(yǎng) 晨起空腹采SLE患者和對(duì)照組的靜脈血10 ml，肝素抗凝，加入淋巴細(xì)胞分離液，2 000 r/min離心20 min，收集中間層細(xì)胞，分離PBMCs，5倍體積生理鹽水洗滌， 2 000 r/min離心10 min×2次。獲取PBMCs后加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞濃度為1×106ml-1。

1.2.2MTT法檢測(cè)HCQ對(duì)SLE患者PBMCs細(xì)胞生長抑制的影響 取SLE患者PBMCs細(xì)胞100 μl/孔接種于96孔板，培養(yǎng)過夜后加入不同濃度的羥氯喹進(jìn)行處理。SLE組PBMCs細(xì)胞中HCQ終濃度分別為0、5、25 mg/L，作用于細(xì)胞24、48、72 h，另設(shè)置正常對(duì)照組，加入5 mg/ml MTT每孔20 μl，4 h后棄上清，加入150 μl的DMSO，振蕩后570 nm測(cè)吸光度值。每組6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3Annexin V- FITC/PI流式細(xì)胞儀檢測(cè)HCQ對(duì)SLE患者PBMCs細(xì)胞凋亡率的影響 PBMCs細(xì)胞接種于6孔板，SLE組加入HCQ，終濃度為0 mmol/L及25 mg/L，另取正常對(duì)照組，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，按1×106ml-1密度加入結(jié)合緩沖液重懸，按照Annexin V- FITC/PI雙染試劑盒說明進(jìn)行操作，加入5 μl Annexin V- FITC，避光10 min后離心，棄上清再次加入緩沖液重懸，加入10 μl PI染色液，混勻后4℃避光染色15 min，30 min內(nèi)進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。每組3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4Western blot方法檢測(cè)HCQ對(duì)SLE患者PBMCs細(xì)胞BAX、BCL- 2、PI3K、pAKt及mTOR等相關(guān)蛋白的表達(dá)影響 PBMCs細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶，SLE組加入HCQ，終濃度為0 mmol/L及25 mg/L，另取正常對(duì)照組，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，取相同量的樣品,進(jìn)行12%凝膠電泳(SDS- PAGE)，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，然后用5%脫脂奶粉過夜，封閉阻斷抗體，一抗稀釋溶液為0.5%BSA溶液，和印跡膜在室溫下孵育2 h，取出用TBST洗膜10 min重復(fù)3次，二抗稀釋溶液為0.5%BSA溶液，印跡膜在室溫下孵育2 h后洗滌液TBST 15 min重復(fù)3次，加入ECL試劑，凝膠成像儀觀測(cè)和統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.5PI3K/AKT通路抑制劑 LY294002對(duì)PBMCs生長抑制和凋亡率的影響 為觀察PI3K/AKT通路抑制劑對(duì)HCQ作用的影響，采用SLE組、HCQ 25 mg/L，HCQ 25 mg/L+LY294002 20 μmol/L，加入藥物作用細(xì)胞48 h，再次進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)及Annexin V- FITC/PI流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)PBMCs生長抑制和凋亡率。實(shí)驗(yàn)方法同前。

2 結(jié)果

2.1HCQ對(duì)體外SLE患者PBMCs細(xì)胞生長抑制作用 采用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組PBMCs細(xì)胞生長抑制的作用，SLE組比正常對(duì)照組生長抑制率升高，存活率下降(P<0.05)；與SLE組相比，HCQ 5和25 mg/L組的生長抑制率顯著增加，存活率明顯降低，具有濃度和時(shí)間依賴性趨勢(shì)，見表1、圖1(P<0.05)。

2.2HCQ對(duì)SLE患者的PBMCs細(xì)胞凋亡率的影響 如圖2所示,右上象限為晚期凋亡細(xì)胞，右下象限為早期凋亡細(xì)胞。在正常對(duì)照組外周血單個(gè)核細(xì)胞凋亡率為(2.7±0.4)%，SLE組患者PBMCs細(xì)胞凋亡率為(6.2±1.7)%，HCQ 5 mg/L時(shí)凋亡率為(18.2±1.8)%，HCQ 25 mg/L時(shí)凋亡率(23.5±2.1)%，SLE組、HCQ組與正常對(duì)照組相比PBMCs細(xì)胞凋亡率均有顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；HCQ組與SLE組相比PBMCs細(xì)胞凋亡率明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；HCQ 25 mg/L 時(shí)凋亡率顯著高于5 mg/L組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見圖2、3。

2.3HCQ對(duì)SLE患者PBMCs的 PI3K、pAKt、mTOR、BCL- 2、BAX、caspase- 3蛋白表達(dá)的影響 HCQ組、SLE組與正常對(duì)照組比較，PI3K、pAKt、mTOR、bcl- 2的表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，bax和caspase- 3的表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。HCQ組與SLE組比較，PI3K、pAKt、mTOR、bcl- 2的表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，bax和caspase- 3的表達(dá)明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且具有濃度依賴性，見圖4。

表1各組PBMCs細(xì)胞生長抑制率的比較

Tab.1ComparisonofgrowthinhibitionratesofPBMCscellsineachgroup

Groups24h48h72hControl000SLE10.4±1.721)11.3±1.591)12.7±2.291)HCQ5mg/L17.7±3.142)23.6±2.982)28.1±3.382)HCQ25mg/L27.6±3.852)34.9±4.242)40.3±4.762)

Note：Compared with the normal control,1)P<0.01；compared with SLE group,2)P<0.01.

圖1 各組PBMCs細(xì)胞存活率的比較Fig.1 Comparison of cell survival rate of each group

2.4PI3K/AKT通路抑制劑 LY294002對(duì)HCQ導(dǎo)致PBMCs凋亡作用的影響 由圖5、6可知，HCQ組與SLE組相比，PBMCs細(xì)胞存活率下降，凋亡率升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；同時(shí)加入HCQ 25 mg/L及PI3K/AKT通路抑制劑 LY294002 20 μmol/L 對(duì)SLE患者PBMCs細(xì)胞作用48 h后，PBMCs細(xì)胞凋亡率及存活率與SLE組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明PI3K/AKT通路抑制劑 LY294002對(duì)HCQ導(dǎo)致的SLE患者PBMCs細(xì)胞凋亡具有阻斷作用。

圖2 各組PBMCs細(xì)胞凋亡率的比較Fig.2 Comparison of apoptotic rate of PBMCs cells in each group detected by flow cytometry with Annexin V/PI double stainingNote: A.Control group；B.SLE group;C.HCQ 5 mg/L group;D.HCQ 25 mg/L group.

圖3 羥氯喹對(duì)SLE患者的PBMCs細(xì)胞凋亡率的影響Fig.3 Effects of HCQ on apoptotic rate in PBMCs of SLENote: Compared with HCQ group and SLE group,##.P<0.01;compared with the normal control,**.P<0.01.

圖4 羥氯喹對(duì)SLE患者的PBMCs細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effects of HCQ on PI3K,pAKt,mTOR,Bcl- 2 protein expressions in PBMCs of SLE

圖5 MTT測(cè)LY294002及羥氯喹對(duì)SLE患者PBMCs細(xì)胞存活率的影響Fig.5 Effects of HCQ alone and HCQ combined with LY294002 on survival rate of PBMCs in SLE patiets detected by MTTNote: Compared with SLE group,**.P<0.01.

圖6 流式細(xì)胞儀測(cè)單用羥氯喹和羥氯喹聯(lián)用LY294002對(duì)SLE患者PBMCs細(xì)胞凋亡率的影響Fig.6 Effects of HCQ and HCQ combined with LY294002 on apoptotic rate of PBMCs in SLE detected by methods of flow cytometryNote: Compared with SLE group,**.P<0.01.

3 討論

SLE是一種彌漫性結(jié)締組織病，以免疫性炎癥為特異表現(xiàn)，累及多臟器多器官，病程遷延，預(yù)后較差，發(fā)病機(jī)制仍不明確，可能是在各種環(huán)境、性激素、藥物、感染或其他因素的作用下，引發(fā)機(jī)體異常免疫反應(yīng)，產(chǎn)生大量抗體及免疫復(fù)合物，引起機(jī)體組織受損[7,8]。研究發(fā)現(xiàn)，SLE出現(xiàn)T淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答異常，導(dǎo)致B淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫出現(xiàn)過度活化，免疫系統(tǒng)失去平衡，產(chǎn)生大量抗原抗體復(fù)合物，引起多臟器受累[9,10]。多項(xiàng)研究報(bào)道，SLE患者體內(nèi)免疫細(xì)胞凋亡調(diào)控異常，淋巴細(xì)胞凋亡率升高，尤其以T淋巴細(xì)胞更為顯著，并且與SLE的活動(dòng)程度正相關(guān)[11- 15]；本研究發(fā)現(xiàn)，SLE患者PBMC細(xì)胞凋亡率較正常對(duì)照組明顯升高(P<0.05)，與其他報(bào)道結(jié)果一致。

HCQ目前是自身免疫性疾病的一線用藥，廣泛用于SLE的治療，臨床效果較好[16]。HCQ可以在細(xì)胞溶酶體內(nèi)涵體高濃度積累，使酸性囊泡的pH值增加，抑制酸性蛋白酶的功能，抑制內(nèi)吞作用，阻止抗原抗體復(fù)合物的形成和轉(zhuǎn)運(yùn)；抑制NK細(xì)胞活性，抑制外周血單個(gè)核細(xì)胞的活性和功能，阻斷抗原呈遞，減少細(xì)胞因子產(chǎn)生；降低免疫反應(yīng)[17,18]。本研究顯示，HCQ可以誘導(dǎo)SLE患者外周血單個(gè)核細(xì)胞的凋亡，且凋亡率隨著HCQ的濃度增加而增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

PI3K/Akt信號(hào)通路參與多種生理過程，在細(xì)胞生長、發(fā)育、分化和凋亡中起重要作用。活化的P13K激活A(yù)kt，信號(hào)進(jìn)一步轉(zhuǎn)導(dǎo)，Akt激酶能調(diào)控下游的mTOR、caspase、BAX/Bcl- 2等多條信號(hào)通路的活性，引起級(jí)聯(lián)反應(yīng)，參與細(xì)胞的生理代謝過程[19]。BAX和BCL- 2是常見的促凋亡蛋白和抑制凋亡蛋白[12]， caspase- 3是細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)的關(guān)鍵酶,是細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)的核心，caspase- 3酶的水解活性超細(xì)蛋白作用可直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并能損傷DNA加速凋亡[3,20]。本研究顯示，HCQ組、SLE組與正常對(duì)照組比較，PI3K、pAKt、mTOR、bcl- 2的表達(dá)明顯下降(P<0.05)，bax和caspase- 3的表達(dá)明顯增加(P<0.05)。HCQ組與SLE組比較，PI3K、pAKt、mTOR、bcl- 2的表達(dá)明顯下降(P<0.05)，bax和caspase- 3的表達(dá)明顯上升(P<0.05)，提示HCQ能夠通過PI3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)SLE患者PBMCs細(xì)胞的凋亡。同時(shí)加入HCQ和PI3K/AKT通路抑制劑 LY294002，發(fā)現(xiàn)PBMCs細(xì)胞凋亡率及存活率與SLE組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明LY294002能夠阻斷HCQ對(duì)SLE患者PBMCs的凋亡作用。這提示HCQ是通過PI3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)SLE患者PBMCs的凋亡。

綜上所述，HCQ能夠通過PI3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)SLE患者體外PBMCs的凋亡。

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