徐曉宏 高守寶 王 玥 胡文靜

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院,齊齊哈爾 161000)

原發(fā)性肝癌(Primary hepatocellular carcinoma ，PHC)是一種進(jìn)展迅速，預(yù)后很差的惡性腫瘤，是全球第五大常見腫瘤，占世界癌癥相關(guān)死亡的第三位,每年新發(fā)病例約有70萬人，其中中國(guó)患者占50%以上[1]。由于PHC早期診斷困難，大多數(shù)患者臨床確診時(shí)已達(dá)晚期，導(dǎo)致其5年生存率僅為10%～15%。此外，PHC治療中的耐藥性、腫瘤的復(fù)發(fā)、發(fā)展和遷移等瓶頸都亟待新的敏感特異的早期預(yù)測(cè)和早期檢測(cè)，并制定更有效的治療策略，能夠改善肝癌的臨床結(jié)果。腫瘤發(fā)生過程中的肝硬化、硬化結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)變?yōu)榘┣安∽儽粡V泛證實(shí)及接受,絕大多數(shù)肝癌患者有肝炎及肝硬化背景。因此炎癥因素及免疫因素在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用應(yīng)該得到重視。目前Micro RNA(miRNAs)與肝癌相關(guān)性的研究已經(jīng)闡明了一些miRNAs的重要意義[2]。miRNAs是一類約含20～25個(gè)核苷酸的非編碼RNA，它可以通過與靶基因3′端非翻譯區(qū)結(jié)合從而影響基因的翻譯和穩(wěn)定性。一個(gè)microRNA可調(diào)節(jié)多個(gè)至數(shù)百個(gè)靶基因，幾種microRNA也可以聯(lián)合調(diào)控單一基因的表達(dá)，microRNA和靶基因間形成了復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、炎癥和癌變等多種生理和病理過程。目前已有大量的證據(jù)證明miRNA在PHC的發(fā)生發(fā)展中起到了十分重要的作用，包括肝細(xì)胞生長(zhǎng)、應(yīng)激反應(yīng)、代謝、病毒感染與擴(kuò)增、基因表達(dá)、肝表型的維持等。研究發(fā)現(xiàn)多種miRNAs在人類PHC細(xì)胞中異常表達(dá)[2]。這也就提示我們 miRNAs也許能夠作為PHC診斷的一種新方法。同時(shí)有研究表明miRNA能抵抗RNA內(nèi)源性酶的降解從而在血漿中穩(wěn)定存在。miRNAs的異常表達(dá)是否與循環(huán)及組織免疫因子相關(guān)，循環(huán) miRNAs是否可以作為理想的血源性新型生物標(biāo)志物用于腫瘤的早期檢測(cè)[3]，可能為原發(fā)性肝癌診斷的生物標(biāo)記物和預(yù)后干預(yù)的靶點(diǎn)提供了新的研究方向。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象 本研究經(jīng)齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有入組人員均簽署知情同意書。56例原發(fā)性肝癌患者選取2015年1月～2017年1月間我院腫瘤科手術(shù)或活檢診斷病例，所有患者均經(jīng)病理診斷確診。男34例，女22例。年齡36～58歲，平均(47.26±5.67)歲。臨床TNM分期：Ⅱ期8例，Ⅲa期19例，Ⅲb期21例，Ⅳ期6例，Ⅴ期2例。其中36例有乙肝病史、酒精性肝硬化及20例其他非炎性病因者。所有患者經(jīng)手術(shù)或活檢診斷分別切取3塊直徑約為0.5 cm的腫瘤組織和3塊癌旁組織(距離癌灶邊緣5 cm)。組織樣本離體后，迅速置入液氮中保存?zhèn)溆?。另收?0例肝硬化患者，其中20例為肝炎后肝硬化，其余20例為酒精性或其他慢性肝病肝硬化。收集40例肝炎患者，以及68例健康對(duì)照，所有入組患者均抽取空腹靜脈血5 ml。血液樣本收集后分離血清，血清于2 h內(nèi)進(jìn)行相關(guān)因子檢測(cè)，血漿立即放置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2方法

1.2.1miRNA 的提取與擴(kuò)增 在生物安全柜中，首先對(duì)肝癌患者肝組織、血漿以及肝硬化組、肝炎組及健康對(duì)照組血漿提總RNA,總RNA提取采用Trizol(Thermo Fisher Scientific)法提取，組織先在液氮中研磨成粉，后加入Trizol試劑，血漿直接根據(jù)體積加入Trizol試劑。通過異丙醇沉淀濃縮RNA。根據(jù)miScript Reverse Transcription Kit說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，-80℃保存。通過miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)查找miR- 146a、miR- 224、miR- 34c、miR- 200a、miR- 148b、miR- 375成熟序列，以GAPDH為內(nèi)參基因，采用熒光定量PCR方法(Real- time PCR，RT PCR)檢測(cè)miRNA表達(dá)量的變化[3]。RTPCR引物由北京華大基因設(shè)計(jì)并合成(表1)。根據(jù)QuantiTect SYBRGreen PCR Kit說明書配置PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性30 s；40 個(gè)PCR 循環(huán)(95℃，30 s；60℃，20 s；72℃，20 s)；以2-ΔΔCT法對(duì)miRNA表達(dá)程度進(jìn)行分析(其中ΔCT為CT靶基因與CT GAPDH的差值)，2-ΔΔCT>2為表達(dá)上調(diào)，2-ΔΔCT<0.5 為表達(dá)下調(diào)[4]。

表1實(shí)時(shí)定量PCR引物序列

Tab.1PrimersequenceofReal-timequantitativePCR

miRNAsSequencesofforwardprimers(5'-3')Sequencesofreverseprimers(5'-3')GAPDHGCTTCGGCAGCACATATACTAAAATGTGCAGGGTCCGAGGTmiR-34cCGCGCTAGCTTATCAGACTGAmiR-224CAAGTCACTAGTGGTTCCGTTTAmiR-135ACGGGGCGATATGGATTTTTmiR-200aGAGTGCATCTTACCGGACAGTmiR-148bGGCGCAAGTTCTGTTATACACmiR-375AGCCGTTTGTTCGTTCGGCT

1.2.2血清腫瘤標(biāo)志物檢測(cè) 選取臨床常用測(cè)血清腫瘤標(biāo)志物甲胎蛋白(α- fetoprotein，AFP)、癌胚抗原 (Carcinoembryonic antigen，CEA)、CA19- 9、CA125為檢測(cè)對(duì)象，采用ADVIA Centaur CP全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀對(duì)所有分離的血清進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)用試劑盒及質(zhì)控血清均購(gòu)自羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司，所有操作嚴(yán)格按照說明書指示進(jìn)行。正常參考值:AFP:0～8.1 μg/L, CEA 0～5.0 μg/L, CA19- 9:0～39 U/ml，CA125:0～35 U/ml[5]。

1.2.3血清炎性因子檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR探針法對(duì)血清乙肝病毒HBV DNA進(jìn)行檢測(cè)，操作嚴(yán)格按照羅氏有限公司COBASAmpli- Prep- COBAS TaqMan(CAP- CTM)檢測(cè)試劑盒進(jìn)行。乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝表面抗體(抗- HBs)、乙肝e抗原(HBeAg)、乙肝e抗體(抗- HBe)、乙肝核心抗體(抗- HBc)、血清中Th1類細(xì)胞因子(IL- 12、IFN- γ和TNF- α)水平及Th2類細(xì)胞因子(IL- 4、IL- 6和IL- 10)水平采用酶聯(lián)免疫ELISA法檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1miRNA在血清中及癌、癌旁組織中表達(dá)情況 分別對(duì)健康組、肝炎組、肝硬化組和PHC組血清miRNA表達(dá)的相對(duì)CT值統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于健康組miR- 34c(P=0.032)、miR- 224(P=0.046)、miR- 146a(P=0.027)在PHC組表達(dá)顯著上調(diào)(見圖1A)，miR- 200a(P=0.034)、miR- 148b(P=0.022)、miR- 375(P=0.030)在PHC組表達(dá)顯著下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但肝炎組和肝硬化組與健康組和PHC組相比較，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

miRNA在組織中表達(dá)如圖1B所示，相對(duì)于癌旁組織，miR- 34c(P=0.022)、miR- 224(P=0.018)、miR- 146a(P=0.016)在PHC組表達(dá)顯著上調(diào)，miR- 200a(P=0.015)、miR- 148b(P=0.024)、miR- 375(P=0.029)在PHC組表達(dá)顯著下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2血清miRNAs與細(xì)胞因子表達(dá)相關(guān)性 在眾多miRNA分子中，發(fā)現(xiàn)miR- 375與miR- 146a表達(dá)水平與細(xì)胞因子相關(guān)，將HBsAg 、抗- HBs、抗- HBe、抗- HBc、IL- 12、IFN- γ、TNF- α、IL- 4、IL- 6和IL- 10作為自變量，血清 miR- 375 和miR- 146a的表達(dá)水平作為因變量，納入線性回歸模型進(jìn)行多因素分析，結(jié)果顯示 ,HBsAg與血清miR- 375 和miR- 146a存在回歸關(guān)系，miR- 375隨HBsAg表達(dá)水平升高而降低，而miR- 146a隨HBsAg達(dá)升高而升高。 IFN- γ與miR- 146a存在回歸關(guān)系， miR- 146a隨IFN- γ表達(dá)水平降低而升高(表2、3)。

2.3血清 miR- 375 和miR- 146a的表達(dá)水平對(duì)原發(fā)性肝癌的診斷意義 利用ROC曲線，評(píng)價(jià)血清miR- 375和miR- 146a在204例研究對(duì)象中檢測(cè)出56例原發(fā)性肝癌的能力，結(jié)果顯示，miR- 375在204例研究對(duì)象中檢測(cè)出56例原發(fā)性肝癌患者的靈敏度為73.9%，特異度為93.0%，AUC為 0.838(95%CI：0.780～0.897)，miR- 146a在204例研究對(duì)象中檢測(cè)出56例原發(fā)性肝癌患者的靈敏度為74.2%，特異度為92.6%，AUC為 0.838(95%CI：0.780～0.897)，而CA19- 9和AFP 在同樣的人群中診斷出原發(fā)性肝癌患者靈敏度分別為63.0%和59.6%，特異性分別為84.2%和81.8%，AUC 分別為0.722(95%CI：0.584～0.802)和0.694(95%CI：0.602～0.784)，miR- 375 和miR- 146a診斷能力大于CA19- 9和AFP(圖2)。

2.4miRNA與細(xì)胞因子表達(dá)相關(guān)性與原發(fā)性肝癌預(yù)后相關(guān)性 未發(fā)現(xiàn)6例癌癥患者各miRNA分子與細(xì)胞因子表達(dá)水平與腫瘤大小、臨床分期及轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)情況具有明顯相關(guān)性，提示不能明確miRNA與細(xì)胞因子表達(dá)與預(yù)后的相關(guān)性。

圖1 各mi- RNA在血清中及癌、癌旁組織中表達(dá)情況Fig.1 Relative expression levels of miRNAs in serum and tissuesNote: A.Relative expression levels of miRNAs in different groups;B.Relative expression levels of miRNAs in tumor tissues and paracancerous tissues，*.P<0.05.

表2血清miR-375與各細(xì)胞因子表達(dá)水平線性回歸分析

Tab.2LinearregressionanalysisofserummiR-375andcytokinelevels

FactorsB95%CItPHBsAg0.228(-0.416,-0.144)-2.4320.021anti-HBs0.184(-0.378,0.226)-1.4420.201anti-HBe-0.189(-0.342,0.160)-1.6410.238anti-HBc0.114(-0.082,2.385)1.3220.199IL-120.098(-0.262,0.431)1.4250.186IFN-γ0.106(-0.090,0.624)0.9860.372TNF-α0.022(-0.204,0.458)1.2120.225IL-40.078(-0.196,0.384)1.4550.169IL-60.021(-0.148,0.186)0.3680.824IL-100.057(-0.120,0.428)0.9020.522

表3血清miR-146a與各細(xì)胞因子表達(dá)水平線性回歸分析

Tab.3LinearregressionanalysisofserummiR-146aandcytokinelevels

FactorsB95%CItPHBsAg0.468(0.244,0.820)3.0260.015anti-HBs0.204(-0.087,0.456)1.4020.198anti-HBe0.154(-0.168,0.322)1.6620.204anti-HBc0.196(-0.204,0.455)1.4180.193IL-120.069(-0.182,0.316)1.0600.482IFN-γ-0.314(-0.727,-0.105)-2.2860.028TNF-α0.041(-0.196,0.262)1.1220.156IL-40.084(-0.102,0226)1.5450.149IL-60.049(-0.205,0.286)0.8740.628IL-100.132(-0.208,0.397)1.2160.178

圖2 血清 miR- 375、miR- 146a、AFP和CA19- 9在全部研究對(duì)象中診斷PHC的ROC曲線Fig.2 ROC curves of serum miR- 375,miR- 146a,AFP and CA19- 9 to diagnose PHC in all subjects

3 討論

原發(fā)性肝癌起病隱匿，預(yù)后不良，其發(fā)生發(fā)展過程與多種因素相關(guān)，而目前臨床主要依靠血清腫瘤標(biāo)志物、活檢及影像學(xué)來診斷PHC，但這些診斷手段靈敏度及特異性都有其局限性，導(dǎo)致診斷價(jià)值欠佳。近年來，隨著分子生物學(xué)診斷技術(shù)不斷發(fā)展，miRNA表達(dá)異常與腫瘤相關(guān)性越來越受到關(guān)注。因此，尋找新的更加敏感和特異的PHC診斷生物標(biāo)記物成為目前研究的熱點(diǎn)及難點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者不僅腫瘤組織中miRNA表達(dá)有明顯變化，而且在其血清中miRNA的表達(dá)也呈現(xiàn)明顯異常。說明血清miRNA以其方便及非侵入性的優(yōu)勢(shì)可用于腫瘤的早期檢測(cè)，可作為理想的診斷標(biāo)志物。

本研究通過循證醫(yī)學(xué)手段，根據(jù)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，篩選到miR- 146a、miR- 224、miR- 34c、miR- 200a、miR- 148b、miR- 375六個(gè)miRNA在PHC中表達(dá)異常。通過對(duì)健康組、肝炎組、肝硬化組及PHC不同疾病發(fā)展組別的血清中和組織中的miRNA表達(dá)水平的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)miR- 34c、miR- 224、miR- 146a在PHC組表達(dá)顯著上調(diào)，miR- 200a、miR- 148b、miR- 375在PHC組表達(dá)顯著下調(diào)。該結(jié)果與其他關(guān)于腫瘤組織中miRNA表達(dá)異常結(jié)果是相符的，如Chamani等[6]發(fā)現(xiàn)miR- 34家族表達(dá)沉默可使多種癌基因DNA甲基化，miR- 34c的異常升高上調(diào)多種癌基因表達(dá)。Shen等[7]研究發(fā)現(xiàn)，miR- 224在宮頸癌、胃癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌和肝癌等惡性腫瘤的細(xì)胞組織中明顯表達(dá)上調(diào)，且高表達(dá)的miR- 224與腫瘤的發(fā)展及預(yù)后相關(guān)。Lin等[8]發(fā)現(xiàn)miR- 146a在非小細(xì)胞癌、乳腺癌、肝癌中表達(dá)異常升高，它可通過異常升高表達(dá)抑制抑癌基因FOXO1 在肝癌中的表達(dá)從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期進(jìn)展。Dhayat等[9]發(fā)現(xiàn)miR- 200a在原發(fā)性肝癌中明顯表達(dá)下調(diào)，在動(dòng)物試驗(yàn)中通過沉默miR- 200a可促進(jìn)肝癌的發(fā)生。它可調(diào)節(jié)鈣黏蛋白和腫瘤β- 鏈蛋白(β- catenin)和腫瘤生長(zhǎng)因子(TGF- β)等多個(gè)靶基因。Ziari等[10]比較了101例肝癌患者及40例正常對(duì)照組的miR- 148b表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)miR- 148b表達(dá)在腫瘤組織中明顯下調(diào)，且與預(yù)后相關(guān)；Mirzaei等[11]發(fā)現(xiàn)miR- 375、miR- 206、miR- 223在肝癌患者癌組織和循環(huán)中都檢測(cè)到異常表達(dá)， miR- 375可能影響p53、p21、PTEN、PI3K- AKT、c- myc和STAT3等重要的生物學(xué)途徑。該六種microRNAs在PHC肝癌組織和癌旁組織中的表達(dá)差異，補(bǔ)充了原發(fā)性肝癌miRNA的差異表達(dá)譜，為原發(fā)性肝癌提供了診斷靶分子。但由于microRNAs參與了多種靶基因和生物學(xué)途徑的調(diào)控，欲研究某一miRNAs具體功能，需通過過表達(dá)或RNA抑制等多種手段驗(yàn)證其可能影響的靶基因，這將有待于進(jìn)一步研究。

腫瘤發(fā)生過程中肝硬化、硬化結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)變?yōu)榘┣安∽儽粡V泛證實(shí)及接受,絕大多數(shù)肝癌患者有肝炎及肝硬化背景。因此炎癥因素及免疫因素在肝癌發(fā)生進(jìn)展中的作用應(yīng)該得到重視。本研究發(fā)現(xiàn)，HBsAg與血清miR- 375 和miR- 146a存在回歸關(guān)系，miR- 375隨HBsAg表達(dá)水平升高而降低，而miR- 146a隨HBsAg達(dá)升高而升高。 IFN- γ與miR- 146a存在回歸關(guān)系，推測(cè)乙肝病毒感染后會(huì)引起miR- 375表達(dá)的下降 和miR- 146a表達(dá)的升高。說明病毒利用宿主自身miRNA間接調(diào)控一些蛋白和免疫因子的表達(dá)，影響機(jī)體的免疫能力，達(dá)到免疫逃逸的目的，從而為自身病毒復(fù)制與生存創(chuàng)造良好的條件。

眾所周知，肝癌的良好預(yù)后取決于早期診斷和治療，盡管目前臨床中活檢病理檢測(cè)是確定原發(fā)性肝癌診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于PHC發(fā)病隱匿，多數(shù)患者在確診PHC時(shí)疾病早已遷延。通過影像學(xué)和血清腫瘤標(biāo)志物等無創(chuàng)診斷仍是肝癌普查應(yīng)用較多的手段，但是難免還是有較高的漏診率和誤診率。本研究中，還發(fā)現(xiàn)血清 miR- 375 和miR- 146a診斷敏感性和特異性均優(yōu)于CA19- 9和AFP，提示miR- 375 和miR- 146a可作為原發(fā)性肝癌，尤其是有乙肝病毒感染史患者原發(fā)性肝癌的診斷標(biāo)志物。

總之，隨著對(duì)循環(huán)miRNAs的生成機(jī)制和生物學(xué)功能與原發(fā)性肝癌的關(guān)系不斷深入，通過進(jìn)一步的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和臨床研究相結(jié)合，我們可以相信，通過循環(huán)miRNAs表達(dá)異常來診斷和治療PHC將會(huì)有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

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