王麗輝 申亞暉 郭艷青 孫治霞 邵煥璋
(河南省中醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科,鄭州 450002)
膿毒癥是由于病原微生物所致的全身炎性反應(yīng)綜合征,涉及體內(nèi)多個(gè)器官和系統(tǒng),發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,若早期得不到有效治療,會(huì)發(fā)展為膿毒性休克、多器官功能障礙綜合征(Multiple organ dysfunction syndrome,MODS),病死率高達(dá)70%[1]。研究表明,免疫功能紊亂、腸屏障損傷導(dǎo)致的腸源性感染是MODS發(fā)生的重要原因之一,在膿毒癥發(fā)病機(jī)制中起重要作用[2- 4]。烏司他丁通過穩(wěn)定溶酶體膜、抑制水解酶活性,發(fā)揮抗炎、抗休克作用,臨床上常用于緩解膿毒癥患者器官功能衰竭,增強(qiáng)免疫功能[5]。另有研究表明,烏司他丁能通過保護(hù)組織器官和內(nèi)皮細(xì)胞,抑制多形核白細(xì)胞彈性蛋白酶、腫瘤壞死因子(TNF- α)、促炎細(xì)胞因子和白細(xì)胞介素(IL- 1、IL- 6、IL- 8)水平,減輕膿毒癥損傷[6,7]。雙歧桿菌為專性厭氧菌,是腸道內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌群,可在腸道內(nèi)產(chǎn)生乳酸、醋酸等有機(jī)酸及細(xì)菌素等抑菌物質(zhì),有助于提高機(jī)體的免疫能力[8- 10]。研究表明,雙歧桿菌能夠減輕膿毒癥引起的肺損傷和炎癥反應(yīng)[11]。長(zhǎng)雙歧桿菌是雙歧桿菌的一種,可以直接補(bǔ)充腸道有益菌,調(diào)整腸道菌群失調(diào)。本研究通過建立膿毒癥大鼠模型,觀察腹腔注射雙歧桿菌聯(lián)合烏司他丁后動(dòng)物模型生存率、TNF- α、IL- 6含量、腸道菌群、血漿內(nèi)毒素和T淋巴細(xì)胞亞群的變化,以探索雙歧桿菌聯(lián)合和烏司他丁對(duì)膿毒癥的治療效果,為臨床上對(duì)膿毒癥的治療提供參考。
1.1材料
1.1.1動(dòng)物 潔凈級(jí)成年SD大鼠100只,雄性,體重200~250 g,購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。
1.1.2試劑 長(zhǎng)雙歧桿菌B.adolescentis(由中科院微生物研究所提供);烏司他丁(廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司);TNF- α、IL- 6 ELISA試劑盒(Biolegend公司);鱟試劑(TAL,廈門市鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司);氯胺酮(廣東嘉博制藥有限公司);乙二胺四乙酸(EDTA,石家莊杰克化工有限公司);水為超純水。
1.2方法
1.2.1膿毒癥動(dòng)物模型的建立 采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(Cecal ligation and puncture,CLP)[12],大鼠禁食12 h后,腹腔注射氯胺酮(100 mg/kg)麻醉,放置于操作臺(tái)上,于腹正中作約1.5 cm切口,分離盲腸組織,用手術(shù)縫線從根部結(jié)扎末端1/2盲腸,用針頭于盲腸上穿通2次形成盲腸漏,留置一條7號(hào)絲線防止針孔閉合,1號(hào)絲線關(guān)閉腹腔,術(shù)后立即皮下注射生理鹽水(10 ml/kg)抗休克。
1.2.2動(dòng)物分組與給藥 把100只雄性SD大鼠,按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、雙歧桿菌治療組、烏司他丁治療組、聯(lián)合治療組,每組20只。假手術(shù)組開腹找到盲腸后立即關(guān)腹,不結(jié)扎,不穿孔盲腸;模型組按照“1.2.1”中方法處理,使大鼠發(fā)生腹腔感染繼而出現(xiàn)膿毒癥;雙歧桿菌治療組在模型組的基礎(chǔ)上,每12 h腹腔注射雙歧桿菌(250 mg/kg);烏司他丁治療組在模型組的基礎(chǔ)上,每12 h腹腔注射烏司他丁(1 000 U/100 g);聯(lián)合治療組在模型組的基礎(chǔ)上,每12 h腹腔注射雙歧桿菌后給予烏司他丁治療。
1.2.3觀察記錄生存數(shù) 觀察各組大鼠的生存情況,記錄小鼠生存數(shù)量。
1.2.4檢測(cè)腸道菌群 造模48 h后無菌收集大鼠糞便約0.1 g,加0.9 ml稀釋液于無菌青霉素瓶中混勻,稀釋后分別接種于各個(gè)培養(yǎng)基中,經(jīng)張秀榮[13]菌落特征、革蘭氏染色、鏡檢等初步鑒定后計(jì)數(shù),計(jì)算出每克糞便中大腸桿菌、乳酸菌、雙歧桿菌的數(shù)量。
1.2.5血樣的采集與檢測(cè) 于術(shù)后48 h收集血液,加入EDTA抗凝血管中,靜置15 min,置于4℃下3 000 r/min離心機(jī)離心15 min,取上清液于-80℃冰箱保存。采用ELISA法測(cè)定TNF- α、IL- 6水平,操作方法嚴(yán)格按照試劑盒所附說明書進(jìn)行。鱟試劑法測(cè)定血漿內(nèi)毒素水平。用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血漿T細(xì)胞亞群。
2.1生存率的計(jì)算 模型組的生存率顯著低于假手術(shù)組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較,雙歧桿菌治療組、烏司他丁治療組、聯(lián)合治療組大鼠的生存率顯著升高(P<0.05),聯(lián)合治療組大鼠的生存率顯著優(yōu)于雙歧桿菌治療組、烏司他丁治療組 (P<0.05)。見表1。
2.2腸道菌群 模型組中大腸桿菌的含量顯著高于假手術(shù)組,雙歧桿菌和乳酸桿菌的數(shù)量顯著低于假手術(shù)組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較,雙歧桿菌治療組、烏司他丁治療組、聯(lián)合治療組的大腸桿菌的含量顯著降低(P<0.05),聯(lián)合治療組的療效顯著優(yōu)于雙歧桿菌治療組;與模型組比較,雙歧桿菌和乳酸桿菌的含量顯著增高(P<0.05),聯(lián)合治療組的療效顯著優(yōu)于烏司他丁治療組(P<0.05)。見表2。
表1各組大鼠48h生存率比較
Tab.1Comparisonof48hsurvivalrateinratsofvariousgroups
GroupsnnsurvivalSurvivalrate(%)Shamoperatedgroup2020 100Modelgroup206 301)Bifidobacteriumtreatmentgroup2010 502)3)Ulinastatintreatmentgroup2011 552)3)Combiningtreatmentgroup2015 752)
Note:Compared with sham operated group,1)P<0.05; compared with model group,2)P<0.05; compared with combining treatment group,3)P<0.05.
2.3TNF- α、IL- 6水平 模型組大鼠TNF- α、IL- 6水平顯著高于假手術(shù)組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較,雙歧桿菌治療組、烏司他丁治療組、聯(lián)合治療組的TNF- α、IL- 6水平顯著降低(P<0.05),聯(lián)合治療組的療效顯著優(yōu)于雙歧桿菌治療組和烏司他丁治療組(P<0.05)。見表3。
2.4血漿內(nèi)毒素水平 模型組大鼠內(nèi)毒素水平顯著升高,與假手術(shù)組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較,雙歧桿菌治療組、烏司他丁治療組、聯(lián)合治療組的血漿內(nèi)毒素水平顯著降低(P<0.05),聯(lián)合治療組的療效顯著優(yōu)于雙歧桿菌治療組和烏司他丁治療組(P<0.05)。見表4。
2.5T淋巴細(xì)胞亞群 模型組大鼠CD3+、CD4+T細(xì)胞、CD4+/CD8+T細(xì)胞比值顯著下降,CD8+T顯著上升,與假手術(shù)組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較,雙歧桿菌治療組、烏司他丁治療組、聯(lián)合治療組的CD3+、CD4+T細(xì)胞、CD4+/CD8+T細(xì)胞比值顯著升高,CD8+T顯著下降(P<0.05)。聯(lián)合治療組的療效顯著優(yōu)于雙歧桿菌治療組和烏司他丁治療組(P<0.05)。見表5。
表2各組大鼠腸道菌群數(shù)量比較
Tab.2Comparisonofintestinalflorasinratsofvariousgroups
GroupsnEscherichiaColi(IgN/g)Lactobacillus(IgN/g)Bifidobacterium(IgN/g)Shamoperatedgroup206.56±0.448.7±0.6510.01±0.41Modelgroup613.54±0.391)1.32±0.211)2.52±0.281)Bifidobacteriumtreatmentgroup107.48±0.292)5.45±0.312)3)8.61±0.462)Ulinastatintreatmentgroup119.61±0.892)3)4.80±0.392)3)6.34±0.292)3)Combiningtreatmentgroup157.31±0.422)7.71±0.602)9.27±0.432)
Note:Compared with sham operated group,1)P<0.05; compared with model group,2)P<0.05; compared with combining treatment group,3)P<0.05.
表3CLP大鼠TNF-α、IL-6含量比較
Tab.3ComparisonofTNF-αandIL-6inratsofvariousgroups
GroupsnTNF-α(ng/ml)IL-6(pg/ml)Shamoperatedgroup208.26±0.7614.09±1.41Modelgroup635.70±2.011)41.10±2.151)Bifidobacteriumtreatmentgroup1017.72±1.502)24.17±1.912)3)Ulinastatintreatmentgroup1113.76±1.632)20.28±0.982)3)Combiningtreatmentgroup159.94±1.212)16.99±1.422)
Note:Compared with sham operated group,1)P<0.05; compared with model group,2)P<0.05; compared with combining treatment group,3)P<0.05.
表4各組大鼠血漿內(nèi)毒素水平比較
Tab.4Comparisonofserumendotoxininratsofvariousgroups
GroupsnPlasmaendotoxinlevel(EU/ml)Shamoperatedgroup200.169±0.068Modelgroup60.287±0.0191)Bifidobacteriumtreatmentgroup100.239±0.0152)3)Ulinastatintreatmentgroup110.211±0.0262)3)Combiningtreatmentgroup150.185±0.0212)
Note:Compared with sham operated group,1)P<0.05; compared with model group,2)P<0.05; compared with combining treatment group,3)P<0.05.
表5CLP大鼠T淋巴細(xì)胞亞群變化比較
Tab.5ComparisonofT-lymphocytesubsetsinratsofvariousgroups
GroupsnCD3+(%)CD4+(%)CD8+(%)CD4+/CD8+Shamoperatedgroup2066.66±1.4944.40±0.9324.50±0.501.81±0.04Modelgroup655.20±0.851)31.10±0.821)26.00±0.701)1.19±0.021)Bifidobacteriumtreatmentgroup1060.97±1.972)39.59±0.942)25.40±0.491.56±0.032)3)Ulinastatintreatmentgroup1164.01±1.102)41.35±0.822)24.50±0.282)1.69±0.042)3)Combiningtreatmentgroup1566.21±1.122)44.87±0.912)24.59±0.542)1.82±0.022)
Note:Compared with sham operated group,1)P<0.05; compared with model group,2)P<0.05; compared with combining treatment group,3)P<0.05.
膿毒癥的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制十分復(fù)雜,目前臨床上采用烏司他丁等藥物提高機(jī)體的免疫能力是膿毒癥治療的主要治療手段。正常情況下,大鼠腸道菌群之間保持著平衡的比例關(guān)系,且厭氧菌(乳酸桿菌、雙歧桿菌)數(shù)量高于需氧菌(大腸桿菌)數(shù)量。本研究利用雙歧桿菌對(duì)腸道菌群的調(diào)節(jié)提高免疫的作用,聯(lián)合烏司他丁探究其對(duì)膿毒癥動(dòng)物模型免疫功能的影響。結(jié)果表明,膿毒癥大鼠模型中厭氧菌雙歧桿菌及乳酸桿菌數(shù)量明顯減少,需氧菌大腸桿菌數(shù)量增加,腸道菌群發(fā)生紊亂,腸道菌群的數(shù)量和比例菌發(fā)生了改變。治療組中,雙歧桿菌治療對(duì)腸道菌群的調(diào)節(jié)能力明顯高于烏司他丁組,說明雙歧桿菌能夠調(diào)節(jié)腸道菌群平衡,防止腸道菌群紊亂,促進(jìn)構(gòu)成腸黏膜的微生物屏障,阻止致病菌的入侵,與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相符[14]。
TNF- α、IL- 6是早期促炎細(xì)胞因子,參與早期膿毒癥并發(fā)多器官損傷,能通過促進(jìn)自由基、緩激肽、組胺等物質(zhì)的產(chǎn)生,激活補(bǔ)體等,加重組織損傷[15]。腸道益生菌可誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞因子表達(dá),下調(diào)炎性因子,促進(jìn)上皮細(xì)胞肌動(dòng)蛋白和咬合蛋白磷酸化,加強(qiáng)上皮間的緊密連接,從而抑制病原對(duì)黏膜的損害,保持黏膜的完整性[16]。模型組中TNF- α、IL- 6水平大幅度增加,說明膿毒癥引起了機(jī)體的炎癥反應(yīng),此反應(yīng)能通過雙歧桿菌、烏司他丁治療有效緩解,烏司他丁比雙歧桿菌抗炎作用更明顯,二者聯(lián)合使用可以更好地提高療效。
T淋巴細(xì)胞亞群可以反映出機(jī)體的免疫功能,模型組中CD3+、CD4+T細(xì)胞顯著減少,說明膿毒癥對(duì)機(jī)體產(chǎn)生了免疫抑制作用,治療組中CD3+、CD4+T細(xì)胞顯著升高,說明雙歧桿菌與烏司他丁對(duì)膿毒癥模型大鼠的免疫功能起促進(jìn)作用。本研究通過建立膿毒癥動(dòng)物模型,確定了雙歧桿菌聯(lián)合烏司他丁較單用烏司他丁可更有效地降低膿毒癥大鼠的死亡率,抑制膿毒癥大鼠的炎癥因子,調(diào)節(jié)腸道菌群,降低血漿內(nèi)毒素,提高機(jī)體免疫能力。雙歧桿菌通過調(diào)節(jié)腸道菌群平衡,對(duì)烏司他丁的療效起促進(jìn)作用。
[1] Cawcutt KA,Peters SG.Severe sepsis and septic shock:clinical overview and update on management[J].Mayo Clin Proc,2014,89(11):1572- 1578.
[2] 李成榮.膿毒癥免疫功能紊亂機(jī)制研究概況[J].中國實(shí)用兒科雜志,2011,26(12):885- 887.
Li CR.An overview of the mechanism of immune dysfunction of sepsis[J].Chin J Pract Pediatr,2011,26(12):885- 887.
[3] Jiang L,Yang L,Zhang M,etal.Beneficial effects of ulinastatin on gut barrier function in sepsis[J].Indian J Med Res,2013,138(6):904.
[4] 史振偉,許 焱,李曉璐,等.銀耳多糖改善膿毒癥小鼠調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的免疫活性[J].中國免疫學(xué)雜志,2016,32(3):313- 317.
Shi ZW,Xu Y,Li XL,etal.The effect of tremella polysaccharide on the immune activity of regulatory T cells in mice[J].Chin J Immunol,2016,32(3):313- 317.
[5] 毛 剛,吳清安,劉 磊.烏司他丁的藥理作用機(jī)制及臨床應(yīng)用進(jìn)展[J].山東醫(yī)藥,2015,55(30):94- 96.
Mao G,Wu QA,Liu L.The pharmacological mechanism and clinical application of Ustatin[J].Shandong Med J,2015,55(30):94- 96.
[6] Atal SS,Atal S.Ulinastatin- a newer potential therapeutic option for multiple organ dysfunction syndrome[J].J Basic Clin Physiol Pharmacol,2016,27(2):91- 99.
[7] 施 榮,熊旭東,李淑芳.烏司他丁調(diào)控膿毒癥大鼠TNF- α與IL- 6及IL- 10水平的研究[J].抗感染藥學(xué),2009,6(1):16- 19.
Shi R,Xiong XD,Li SF.Study of Ulinastatin on level of TNF- α,IL- 6 and IL- 10 in rats with sepsis[J].Anti- Infection Pharmacy,2009,6(1):16- 19.
[8] 呂錫斌,何臘平,張汝嬌,等.雙歧桿菌生理功能研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技,2013,34(16):353- 358.
Lv XB,He LP,Zhang RJ,etal.Research progress in physiological functions of Bifidobacterium[J].Sci Technol Food Indust,2013,34(16):353- 358.
[9] 范金波,侯 宇,周素珍,等.雙歧桿菌增強(qiáng)小鼠機(jī)體的免疫功能[J].微生物學(xué)報(bào),2015,55(4):484- 491.
Fan JB,Hou Y,Zhou SZ,etal.Effect of Bifidobacterium on the immunity in BALB/c mice[J].Wei Sheng Wu Xue Bao,2015,55(4):484- 491.
[10] 黃 煌,鄭鵬遠(yuǎn),羅 予.雙歧桿菌對(duì)免疫功能低下小鼠腸道屏障功能的影響[J].臨床醫(yī)學(xué),2012,32(5):1- 3.
Huang H,Zheng PY,Luo Y.Effect of bifidobacterium on gut barrier function of mice with hypoimmunity[J].Clin Med,2012,32(5):1- 3.
[11] Khailova L,Petrie B,Baird CH,etal.Lactobacillus rhamnosus GG and Bifidobacterium longum attenuate lung injury and inflammatory response in experimental sepsis[J].PLoS One,2014,9(5):e97861.
[12] Wichterman KA,Baue AE,Chaudry IH,etal.Sepsis and septic shock- a review of laboratory models and a proposal[J].J Surg Res,1980,29(2):189.
[13] 張秀榮.腸道菌群糞便涂片檢查圖譜[M].北京:人民軍醫(yī)出版社,2000:1- 15.
Zhang XR.Intestinal flora fecal smear map[M].Beijing:People's military medical publishing house,2000:1- 15.
[14] Aroniadis OC,Brandt LJ.Fecal microbiota transplantation:past,present and future[J].Curr Opin Gastroenterol,2013,29(1):79- 84.
[15] 張 青,李 琦,毛寶齡,等.內(nèi)毒素致傷大鼠肺組織促炎與抗炎細(xì)胞因子 mRNA 表達(dá)的時(shí)相性研究[J].中國危重病急救醫(yī)學(xué),2004,16(10):585- 588.
Zhang Q,Li Q,Mao BL,etal.Study on the expression of mRNA of the lung tissue of rats with endotoxin and anti- inflammatory cytokines[J].Chin Critic Care Med,2004,16(10):585- 588.
[16] Pena JA,Versalovic J.Lactobacillus rhamnosus GG decreases TNF- α production in lipopolysaccharide- activated murine macrophages by a contact- independent mechanism[J].Cell Microbiol,2003,5(4):277- 285.