王麗輝 申亞暉 郭艷青 孫治霞 邵煥璋

(河南省中醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科,鄭州 450002)

膿毒癥是由于病原微生物所致的全身炎性反應(yīng)綜合征，涉及體內(nèi)多個(gè)器官和系統(tǒng)，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，若早期得不到有效治療，會(huì)發(fā)展為膿毒性休克、多器官功能障礙綜合征(Multiple organ dysfunction syndrome,MODS)，病死率高達(dá)70%[1]。研究表明，免疫功能紊亂、腸屏障損傷導(dǎo)致的腸源性感染是MODS發(fā)生的重要原因之一，在膿毒癥發(fā)病機(jī)制中起重要作用[2- 4]。烏司他丁通過穩(wěn)定溶酶體膜、抑制水解酶活性，發(fā)揮抗炎、抗休克作用，臨床上常用于緩解膿毒癥患者器官功能衰竭，增強(qiáng)免疫功能[5]。另有研究表明，烏司他丁能通過保護(hù)組織器官和內(nèi)皮細(xì)胞，抑制多形核白細(xì)胞彈性蛋白酶、腫瘤壞死因子(TNF- α)、促炎細(xì)胞因子和白細(xì)胞介素(IL- 1、IL- 6、IL- 8)水平，減輕膿毒癥損傷[6,7]。雙歧桿菌為專性厭氧菌，是腸道內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌群，可在腸道內(nèi)產(chǎn)生乳酸、醋酸等有機(jī)酸及細(xì)菌素等抑菌物質(zhì)，有助于提高機(jī)體的免疫能力[8- 10]。研究表明，雙歧桿菌能夠減輕膿毒癥引起的肺損傷和炎癥反應(yīng)[11]。長(zhǎng)雙歧桿菌是雙歧桿菌的一種，可以直接補(bǔ)充腸道有益菌，調(diào)整腸道菌群失調(diào)。本研究通過建立膿毒癥大鼠模型，觀察腹腔注射雙歧桿菌聯(lián)合烏司他丁后動(dòng)物模型生存率、TNF- α、IL- 6含量、腸道菌群、血漿內(nèi)毒素和T淋巴細(xì)胞亞群的變化，以探索雙歧桿菌聯(lián)合和烏司他丁對(duì)膿毒癥的治療效果，為臨床上對(duì)膿毒癥的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物 潔凈級(jí)成年SD大鼠100只，雄性，體重200～250 g，購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。

1.1.2試劑 長(zhǎng)雙歧桿菌B.adolescentis(由中科院微生物研究所提供)；烏司他丁(廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司)；TNF- α、IL- 6 ELISA試劑盒(Biolegend公司)；鱟試劑(TAL,廈門市鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司)；氯胺酮(廣東嘉博制藥有限公司)；乙二胺四乙酸(EDTA,石家莊杰克化工有限公司)；水為超純水。

1.2方法

1.2.1膿毒癥動(dòng)物模型的建立 采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(Cecal ligation and puncture,CLP)[12]，大鼠禁食12 h后，腹腔注射氯胺酮(100 mg/kg)麻醉，放置于操作臺(tái)上，于腹正中作約1.5 cm切口，分離盲腸組織，用手術(shù)縫線從根部結(jié)扎末端1/2盲腸，用針頭于盲腸上穿通2次形成盲腸漏，留置一條7號(hào)絲線防止針孔閉合，1號(hào)絲線關(guān)閉腹腔，術(shù)后立即皮下注射生理鹽水(10 ml/kg)抗休克。

1.2.2動(dòng)物分組與給藥 把100只雄性SD大鼠，按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、雙歧桿菌治療組、烏司他丁治療組、聯(lián)合治療組，每組20只。假手術(shù)組開腹找到盲腸后立即關(guān)腹，不結(jié)扎，不穿孔盲腸；模型組按照“1.2.1”中方法處理，使大鼠發(fā)生腹腔感染繼而出現(xiàn)膿毒癥；雙歧桿菌治療組在模型組的基礎(chǔ)上，每12 h腹腔注射雙歧桿菌(250 mg/kg)；烏司他丁治療組在模型組的基礎(chǔ)上，每12 h腹腔注射烏司他丁(1 000 U/100 g)；聯(lián)合治療組在模型組的基礎(chǔ)上，每12 h腹腔注射雙歧桿菌后給予烏司他丁治療。

1.2.3觀察記錄生存數(shù) 觀察各組大鼠的生存情況，記錄小鼠生存數(shù)量。

1.2.4檢測(cè)腸道菌群 造模48 h后無菌收集大鼠糞便約0.1 g，加0.9 ml稀釋液于無菌青霉素瓶中混勻，稀釋后分別接種于各個(gè)培養(yǎng)基中，經(jīng)張秀榮[13]菌落特征、革蘭氏染色、鏡檢等初步鑒定后計(jì)數(shù)，計(jì)算出每克糞便中大腸桿菌、乳酸菌、雙歧桿菌的數(shù)量。

1.2.5血樣的采集與檢測(cè) 于術(shù)后48 h收集血液，加入EDTA抗凝血管中，靜置15 min，置于4℃下3 000 r/min離心機(jī)離心15 min，取上清液于-80℃冰箱保存。采用ELISA法測(cè)定TNF- α、IL- 6水平，操作方法嚴(yán)格按照試劑盒所附說明書進(jìn)行。鱟試劑法測(cè)定血漿內(nèi)毒素水平。用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血漿T細(xì)胞亞群。

2 結(jié)果

2.1生存率的計(jì)算 模型組的生存率顯著低于假手術(shù)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，雙歧桿菌治療組、烏司他丁治療組、聯(lián)合治療組大鼠的生存率顯著升高(P<0.05)，聯(lián)合治療組大鼠的生存率顯著優(yōu)于雙歧桿菌治療組、烏司他丁治療組 (P<0.05)。見表1。

2.2腸道菌群 模型組中大腸桿菌的含量顯著高于假手術(shù)組，雙歧桿菌和乳酸桿菌的數(shù)量顯著低于假手術(shù)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，雙歧桿菌治療組、烏司他丁治療組、聯(lián)合治療組的大腸桿菌的含量顯著降低(P<0.05)，聯(lián)合治療組的療效顯著優(yōu)于雙歧桿菌治療組；與模型組比較，雙歧桿菌和乳酸桿菌的含量顯著增高(P<0.05)，聯(lián)合治療組的療效顯著優(yōu)于烏司他丁治療組(P<0.05)。見表2。

表1各組大鼠48h生存率比較

Tab.1Comparisonof48hsurvivalrateinratsofvariousgroups

GroupsnnsurvivalSurvivalrate(%)Shamoperatedgroup2020 100Modelgroup206 301)Bifidobacteriumtreatmentgroup2010 502)3)Ulinastatintreatmentgroup2011 552)3)Combiningtreatmentgroup2015 752)

Note：Compared with sham operated group,1)P<0.05; compared with model group,2)P<0.05; compared with combining treatment group,3)P<0.05.

2.3TNF- α、IL- 6水平 模型組大鼠TNF- α、IL- 6水平顯著高于假手術(shù)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，雙歧桿菌治療組、烏司他丁治療組、聯(lián)合治療組的TNF- α、IL- 6水平顯著降低(P<0.05)，聯(lián)合治療組的療效顯著優(yōu)于雙歧桿菌治療組和烏司他丁治療組(P<0.05)。見表3。

2.4血漿內(nèi)毒素水平 模型組大鼠內(nèi)毒素水平顯著升高，與假手術(shù)組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，雙歧桿菌治療組、烏司他丁治療組、聯(lián)合治療組的血漿內(nèi)毒素水平顯著降低(P<0.05)，聯(lián)合治療組的療效顯著優(yōu)于雙歧桿菌治療組和烏司他丁治療組(P<0.05)。見表4。

2.5T淋巴細(xì)胞亞群 模型組大鼠CD3+、CD4+T細(xì)胞、CD4+/CD8+T細(xì)胞比值顯著下降，CD8+T顯著上升，與假手術(shù)組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，雙歧桿菌治療組、烏司他丁治療組、聯(lián)合治療組的CD3+、CD4+T細(xì)胞、CD4+/CD8+T細(xì)胞比值顯著升高，CD8+T顯著下降(P<0.05)。聯(lián)合治療組的療效顯著優(yōu)于雙歧桿菌治療組和烏司他丁治療組(P<0.05)。見表5。

表2各組大鼠腸道菌群數(shù)量比較

Tab.2Comparisonofintestinalflorasinratsofvariousgroups

GroupsnEscherichiaColi(IgN/g)Lactobacillus(IgN/g)Bifidobacterium(IgN/g)Shamoperatedgroup206.56±0.448.7±0.6510.01±0.41Modelgroup613.54±0.391)1.32±0.211)2.52±0.281)Bifidobacteriumtreatmentgroup107.48±0.292)5.45±0.312)3)8.61±0.462)Ulinastatintreatmentgroup119.61±0.892)3)4.80±0.392)3)6.34±0.292)3)Combiningtreatmentgroup157.31±0.422)7.71±0.602)9.27±0.432)

Note：Compared with sham operated group,1)P<0.05; compared with model group,2)P<0.05; compared with combining treatment group,3)P<0.05.

表3CLP大鼠TNF-α、IL-6含量比較

Tab.3ComparisonofTNF-αandIL-6inratsofvariousgroups

GroupsnTNF-α(ng/ml)IL-6(pg/ml)Shamoperatedgroup208.26±0.7614.09±1.41Modelgroup635.70±2.011)41.10±2.151)Bifidobacteriumtreatmentgroup1017.72±1.502)24.17±1.912)3)Ulinastatintreatmentgroup1113.76±1.632)20.28±0.982)3)Combiningtreatmentgroup159.94±1.212)16.99±1.422)

Note：Compared with sham operated group,1)P<0.05; compared with model group,2)P<0.05; compared with combining treatment group,3)P<0.05.

表4各組大鼠血漿內(nèi)毒素水平比較

Tab.4Comparisonofserumendotoxininratsofvariousgroups

GroupsnPlasmaendotoxinlevel(EU/ml)Shamoperatedgroup200.169±0.068Modelgroup60.287±0.0191)Bifidobacteriumtreatmentgroup100.239±0.0152)3)Ulinastatintreatmentgroup110.211±0.0262)3)Combiningtreatmentgroup150.185±0.0212)

Note：Compared with sham operated group,1)P<0.05; compared with model group,2)P<0.05; compared with combining treatment group,3)P<0.05.

表5CLP大鼠T淋巴細(xì)胞亞群變化比較

Tab.5ComparisonofT-lymphocytesubsetsinratsofvariousgroups

GroupsnCD3+(%)CD4+(%)CD8+(%)CD4+/CD8+Shamoperatedgroup2066.66±1.4944.40±0.9324.50±0.501.81±0.04Modelgroup655.20±0.851)31.10±0.821)26.00±0.701)1.19±0.021)Bifidobacteriumtreatmentgroup1060.97±1.972)39.59±0.942)25.40±0.491.56±0.032)3)Ulinastatintreatmentgroup1164.01±1.102)41.35±0.822)24.50±0.282)1.69±0.042)3)Combiningtreatmentgroup1566.21±1.122)44.87±0.912)24.59±0.542)1.82±0.022)

Note：Compared with sham operated group,1)P<0.05; compared with model group,2)P<0.05; compared with combining treatment group,3)P<0.05.

3 討論

膿毒癥的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制十分復(fù)雜，目前臨床上采用烏司他丁等藥物提高機(jī)體的免疫能力是膿毒癥治療的主要治療手段。正常情況下，大鼠腸道菌群之間保持著平衡的比例關(guān)系，且厭氧菌(乳酸桿菌、雙歧桿菌)數(shù)量高于需氧菌(大腸桿菌)數(shù)量。本研究利用雙歧桿菌對(duì)腸道菌群的調(diào)節(jié)提高免疫的作用，聯(lián)合烏司他丁探究其對(duì)膿毒癥動(dòng)物模型免疫功能的影響。結(jié)果表明，膿毒癥大鼠模型中厭氧菌雙歧桿菌及乳酸桿菌數(shù)量明顯減少，需氧菌大腸桿菌數(shù)量增加，腸道菌群發(fā)生紊亂，腸道菌群的數(shù)量和比例菌發(fā)生了改變。治療組中，雙歧桿菌治療對(duì)腸道菌群的調(diào)節(jié)能力明顯高于烏司他丁組，說明雙歧桿菌能夠調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，防止腸道菌群紊亂，促進(jìn)構(gòu)成腸黏膜的微生物屏障，阻止致病菌的入侵，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相符[14]。

TNF- α、IL- 6是早期促炎細(xì)胞因子，參與早期膿毒癥并發(fā)多器官損傷，能通過促進(jìn)自由基、緩激肽、組胺等物質(zhì)的產(chǎn)生，激活補(bǔ)體等，加重組織損傷[15]。腸道益生菌可誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞因子表達(dá)，下調(diào)炎性因子，促進(jìn)上皮細(xì)胞肌動(dòng)蛋白和咬合蛋白磷酸化，加強(qiáng)上皮間的緊密連接，從而抑制病原對(duì)黏膜的損害，保持黏膜的完整性[16]。模型組中TNF- α、IL- 6水平大幅度增加，說明膿毒癥引起了機(jī)體的炎癥反應(yīng)，此反應(yīng)能通過雙歧桿菌、烏司他丁治療有效緩解，烏司他丁比雙歧桿菌抗炎作用更明顯，二者聯(lián)合使用可以更好地提高療效。

T淋巴細(xì)胞亞群可以反映出機(jī)體的免疫功能，模型組中CD3+、CD4+T細(xì)胞顯著減少，說明膿毒癥對(duì)機(jī)體產(chǎn)生了免疫抑制作用，治療組中CD3+、CD4+T細(xì)胞顯著升高，說明雙歧桿菌與烏司他丁對(duì)膿毒癥模型大鼠的免疫功能起促進(jìn)作用。本研究通過建立膿毒癥動(dòng)物模型，確定了雙歧桿菌聯(lián)合烏司他丁較單用烏司他丁可更有效地降低膿毒癥大鼠的死亡率，抑制膿毒癥大鼠的炎癥因子，調(diào)節(jié)腸道菌群，降低血漿內(nèi)毒素，提高機(jī)體免疫能力。雙歧桿菌通過調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，對(duì)烏司他丁的療效起促進(jìn)作用。

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