方麗君，林穎彬，黃 恩，黃天文,4

(1. 福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院眼科，福建 福州 350001；2. 福建省老年醫(yī)學(xué)研究所，福建 福州 350001；3. 加拿大渥太華大學(xué)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞分子醫(yī)學(xué)系，渥太華 K1H 8M5；4. 福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，福建 福州 350001)

視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa, RP)是最常見的嚴(yán)重威脅視功能的疾病之一，以視網(wǎng)膜視桿細(xì)胞死亡/凋亡引起的夜盲和視野縮窄、最終累及視錐細(xì)胞而發(fā)生中心視力嚴(yán)重受損為特征。然而，視錐細(xì)胞繼發(fā)損傷的病理機(jī)制仍然不是很清楚。丟失大量視桿細(xì)胞后，組織內(nèi)氧水平的大大增高對(duì)視錐細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷，這一學(xué)說(shuō)為大部分學(xué)者所接受[1]。因此，運(yùn)用過(guò)氧化氫(H2O2)來(lái)干預(yù)視錐細(xì)胞系661W細(xì)胞可以模擬RP的病理生理改變，這為RP的研究提供了可靠的細(xì)胞模型。

大量研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)抗氧化治療可保護(hù)神經(jīng)元，但是其中機(jī)制并未完全闡明。N-乙?；腚装彼?N-acetyl-L-cysteine, NAC) 是一種常見的抗氧化劑，具有神經(jīng)保護(hù)功效[2-3]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，NAC可減輕神經(jīng)元內(nèi)細(xì)胞周期素依賴蛋白激酶5(cyclin-dependent kinase 5，CDK5)毒性作用，減輕神經(jīng)元內(nèi)Tau蛋白的過(guò)度磷酸化[3]。鈣蛋白酶Calpain是CDK5 的上游調(diào)節(jié)蛋白，其異常激活是導(dǎo)致細(xì)胞損害的重要因素之一[4-5]。那么，在RP中，氧化應(yīng)激損傷的視錐細(xì)胞中是否也可能存在Calpain的變化。661W光感細(xì)胞是一種可靠的體外研究視錐細(xì)胞的替代物，本實(shí)驗(yàn)以Calpain為研究對(duì)象，探討H2O2對(duì)661W光感受器細(xì)胞活性的影響，然后檢測(cè)661W光感受器細(xì)胞內(nèi)Calpain 1和Calpain 2蛋白水平的變化，最后以Calpain抑制劑ALLN(N-acetyl-leu-leu-norleucinal)來(lái)干預(yù)，探討ALLN對(duì)661W細(xì)胞活性的影響，以期為RP的治療提供新思路。

1 材料

1.1細(xì)胞661W光感受器細(xì)胞購(gòu)自上海奧陸生物有限公司 (細(xì)胞來(lái)源于美國(guó)俄克拉何馬州大學(xué))。

1.2試劑DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素G(0.1 IU·L-1)、鏈霉素(0.1 IU·L-1)、胰蛋白酶均購(gòu)自Gibco公司；ALLN購(gòu)自Calbiochem-Behring公司；Cell Proliferation Kit I (MTT)試劑盒購(gòu)自Roche公司；Calpain 1(N-19)抗體和Calpain 2(N-19)抗體，購(gòu)自Santa Cruz公司；β-actin鼠單克隆抗體購(gòu)自NeoMarkers公司。

1.3儀器二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)FormaScientific公司)；CK40型倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek公司)；電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1661W細(xì)胞培養(yǎng)[6]661W細(xì)胞在含有10%胎牛血清、青霉素G(0.1 IU·L-1)和鏈霉素(0.1 IU·L-1)的高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37 ℃、含有95%空氣和5% CO2的培養(yǎng)箱中，每3～4 d用胰蛋白酶消化傳代1次。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)到70%～80%，進(jìn)行各種干預(yù)處理。

2.2實(shí)驗(yàn)分組①空白對(duì)照組：未給予干預(yù)處理。②H2O2處理組：僅給予不同濃度的H2O2處理，濃度為0、1、5、10、50、100、500、1 000 μmol·L-1，給予特定時(shí)間的H2O2孵育。③Calpain抑制劑ALLN組：先加入ALLN(25、50、100、200 μmol·L-1)，再與H2O2共同孵育不同時(shí)間。④單純的ALLN組：ALLN(25、50、100、200 μmol·L-1)孵育組。

2.3MTT檢測(cè)661W細(xì)胞活性參考試劑盒說(shuō)明書，d 1在96孔板中接種661W細(xì)胞，每孔2×103個(gè)，然后置于37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中；d 2加入不同濃度的ALLN和(或)H2O2，作用不同時(shí)間。經(jīng)過(guò)不同處理后，加入MTT試劑(終濃度為0.5 g·L-1)，在37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中避光孵育4 h；然后每孔加入試劑盒中的溶解液100 μL，在培養(yǎng)箱孵育過(guò)夜；最后在甲臜結(jié)晶完全溶解后，用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組。

2.4Westernblot檢測(cè)[7]接種在6孔板的661W細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同處理后，吸棄培養(yǎng)液，用冷的PBS清洗，加入細(xì)胞裂解液，冰上裂解20 min，4℃、14 000×g離心10 min，獲取上清液，進(jìn)行蛋白定量。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，轉(zhuǎn)膜，封閉液在室溫下封閉，一抗4℃孵育過(guò)夜，抗兔或鼠IgG二抗(1 ∶1 000稀釋)作用2 h，化學(xué)發(fā)光法顯色，曝光。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3 結(jié)果

3.1H2O2對(duì)661W光感受器細(xì)胞活性的影響分別用空白對(duì)照組(0 μmol·L-1)、H2O2(1、5、10、50、100、500、1 000 μmol·L-1)孵育661W細(xì)胞24 h，MTT試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活性。如Fig 1所示，661W細(xì)胞活性隨著H2O2濃度的增加而呈下降趨勢(shì)。0～10 μmol·L-1的H2O2孵育661W細(xì)胞24 h，細(xì)胞的活性無(wú)變化(P>0.05)，當(dāng)H2O2濃度升高至50 μmol·L-1，細(xì)胞的活性開始下降(P<0.01)；當(dāng)H2O2濃度升高至500 μmol·L-1，661W細(xì)胞基本死亡。其中，當(dāng)H2O2濃度為100 μmol·L-1，細(xì)胞的活性降至50%左右(P<0.01)。

3.2H2O2對(duì)661W細(xì)胞中Calpain蛋白表達(dá)的影響根據(jù)H2O2對(duì)661W細(xì)胞活性的研究結(jié)果，我們選擇100 μmol·L-1的H2O2作用于661W細(xì)胞，觀察Calpain 1和Calpain 2蛋白在不同時(shí)間的表達(dá)變化。如Fig 2所示，Calpain 1和Calpain 2蛋白水平在12 h時(shí)，均有不同程度的增加，但是差異沒有顯著性(P>0.05)；隨著時(shí)間延長(zhǎng)到18 h，Calpain 1和Calpain 2的蛋白水平繼續(xù)升高，其中Calpain 2蛋白水平與空白對(duì)照組比較，差異有顯著性(P<0.05)；隨著時(shí)間進(jìn)一步推移到24 h，Calpain 1和Calpain 2的蛋白均升高到對(duì)照組的2～3倍，差別均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3.3Calpain抑制劑ALLN對(duì)H2O2誘導(dǎo)的661W細(xì)胞活性損害的影響ALLN是Calpain的抑制劑，我們分別用0、25、50、100、200 μmol·L-1的ALLN作用于661W細(xì)胞，然后加入100 μmol·L-1的H2O2共同孵育24 h，MTT法檢測(cè)661W細(xì)胞的活性。如Fig 3所示，與空白對(duì)照組相比，100 μmol·L-1的H2O2組中細(xì)胞活性明顯下降(P<0.01)，與Fig 1結(jié)果一致；與H2O2處理組比較，不同濃度的ALLN與H2O2共同孵育組中661W細(xì)胞的活性明顯升高，且該升高趨勢(shì)呈現(xiàn)ALLN劑量相關(guān)性。

Fig 1 H2O2 decreased survival rate of 661W cells(±s，n=6)

661W cells were treated for 24 h with different concentrations of H2O2. Then cell viability was detected by MTT assay. It dose-dependently decreased the viability of 661W cells.**P<0.01vscontrol group (0 μmol·L-1group).

Fig 2 H2O2 increased protein levels of Calpain 1 andCalpain 2 in 661W cells(±s，n=3)

Upon H2O2, 661W cells showed a time-dependent increase in the proteins of Calpain 1 and Calpain 2 as compared to cells treated without H2O2.*P<0.05vscontrol group without H2O2treatment.

Fig 3 ALLN attenuated damage induced by

The cells were treated with H2O2alone, or ALLN (25, 50, 100, 200 μmol·L-1) and H2O2(100 μmol·L-1). After 24 h of incubation, the viability of 661W cells was measured. Under the effect of ALLN, there was a dose-dependent increase in cell viability.**P<0.01vsgroup with H2O2treatment alone.

3.4ALLN對(duì)661W細(xì)胞活性的影響用不同濃度(0、25、50、100、200 μmol·L-1)的ALLN作用于661W細(xì)胞24 h，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性。如Fig 4所示，與空白對(duì)照組相比，不同濃度的ALLN處理組中，細(xì)胞的活性并未發(fā)生改變(P>0.05)。提示ALLN在25～200 μmol·L-1濃度范圍內(nèi)對(duì)661W細(xì)胞沒有毒性。

4 討論

眾所周知，視信息在視網(wǎng)膜內(nèi)形成視覺神經(jīng)沖動(dòng)，由3個(gè)神經(jīng)元傳遞，即光感受器細(xì)胞-雙極細(xì)胞-神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。光感受器細(xì)胞是視網(wǎng)膜的第一級(jí)神經(jīng)元，分為視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞。在RP中，光感受器細(xì)胞受到損害。盡管RP病人喪失了大部分視桿細(xì)胞，只要視錐細(xì)胞不損傷，RP病人在明亮的環(huán)境下，仍然可以維持相對(duì)正常的生活。因而，對(duì)繼發(fā)的視錐細(xì)胞的損傷研究成為RP研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。目前普遍認(rèn)為，視錐細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷參與了RP的病理生理改變[8]。所以本研究選用H2O2作為致?lián)p害的因素。另外，因?yàn)?61W細(xì)胞是從SV40 T-抗原轉(zhuǎn)基因鼠視網(wǎng)膜上分離得到的，既能在體外增殖，又能表達(dá)感光細(xì)胞特異性蛋白，是一種可靠的體外研究視錐細(xì)胞的替代物。所以，我們以H2O2作用于視錐系661W光感受器細(xì)胞制備視錐細(xì)胞氧化損傷細(xì)胞模型[9-10]，然后探討RP可能的病理生理改變。

Fig 4 ALLN at concentration of 0～200 μmol·L-1 for24 h was safe for 661W cells(±s ，n=6)

661W cells were treated with ALLN at the concentrations from 0 to 200 μmol·L-1for 24 h. Then the cell viability was detected with MTT method. No significant change was shown between any groups.

本研究發(fā)現(xiàn)，在661W細(xì)胞中加入不同濃度的H2O2孵育24 h，細(xì)胞的活性隨著H2O2濃度(尤其在10～500 μmol·L-1)的升高而明顯下降。提示H2O2對(duì)661W細(xì)胞具有毒性損害作用，也說(shuō)明成功制備了氧化損傷病理改變的細(xì)胞模型。根據(jù)661W細(xì)胞活性的變化，我們選擇細(xì)胞活性降至50%左右時(shí)的H2O2濃度做為進(jìn)一步研究的藥物濃度。在本研究中，100 μmol·L-1H2O2作用于661W細(xì)胞24 h后，細(xì)胞存活率降至50%左右。因此，我們選擇100 μmol·L-1H2O2作為后續(xù)研究的濃度。

另外，我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，鈣依賴的蛋白酶Calpain參與氧化損傷的病理過(guò)程。在細(xì)胞氧化損傷過(guò)程中，細(xì)胞的線粒體功能受到損害，導(dǎo)致ATP產(chǎn)生減少、細(xì)胞內(nèi)鈣超負(fù)荷等病理改變，最終導(dǎo)致Calpain活性的增加[2]。氧化應(yīng)激也可能通過(guò)其他途徑來(lái)提高Calpain活性，我們也正在進(jìn)行有關(guān)的探索性研究。Calpain是細(xì)胞質(zhì)中主要的鈣依賴的蛋白水解酶，參與多種病理生理過(guò)程。根據(jù)Calpain活化需要鈣濃度不同，把Calpain分為μ-Calpain(微摩爾級(jí))和m-Calpain(毫摩爾級(jí))，μ-Calpain也稱為Calpain 1，m-Calpain又稱為Calpain 2。為了進(jìn)一步研究Calpain是否參與H2O2對(duì)661W細(xì)胞毒性損害的作用，我們檢測(cè)了Calpain 1和Calpain 2的蛋白水平。研究發(fā)現(xiàn)，在100 μmol·L-1H2O2作用12、18、24 h，Calpain 1和Calpain 2表達(dá)呈時(shí)間依賴性增高，尤其在24 h時(shí)，與空白對(duì)照組比較，Calpain 1和Calpain 2水平皆明顯升高。說(shuō)明Calpain參與661W細(xì)胞的氧化損傷過(guò)程。因此，如能抑制Calpain的活性，就可以保護(hù)661W細(xì)胞，所以我們選擇Calpain的抑制劑ALLN來(lái)驗(yàn)證我們的假說(shuō)。

結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，我們選擇25～200 μmol·L-1的ALLN作用661W細(xì)胞，同時(shí)加入100 μmol·L-1的H2O2共同作用24 h。結(jié)果顯示，ALLN具有不同程度的保護(hù)作用，并且保護(hù)作用隨著ALLN濃度的增加有增強(qiáng)的趨勢(shì)。另外，通過(guò)檢測(cè)ALLN對(duì)661W細(xì)胞的影響，未發(fā)現(xiàn)ALLN有降低細(xì)胞活性的毒性作用。這些結(jié)果提示，在661W細(xì)胞的氧化損傷中，Calpain參與其中的損害過(guò)程，Calpain的抑制劑ALLN對(duì)損害具有保護(hù)作用。雖然這些研究是在661W細(xì)胞系中進(jìn)行，但這為我們進(jìn)一步在體內(nèi)研究RP等視網(wǎng)膜疾病的動(dòng)物模型奠定了必要的基礎(chǔ)。

綜上所述，H2O2可升高661W細(xì)胞的Calpain蛋白水平，對(duì)661W細(xì)胞具有毒性損害作用；而抑制Calpain的ALLN可以降低H2O2對(duì)661W細(xì)胞的毒性損害。提示Calpain蛋白參與H2O2對(duì)661W光感受器細(xì)胞的毒性損害，ALLN對(duì)氧化損傷的光感受器細(xì)胞具有保護(hù)作用，為研究RP等與光感受器細(xì)胞氧化損傷相關(guān)的視網(wǎng)膜疾病的發(fā)病機(jī)制及藥物調(diào)控提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院福建省老年醫(yī)學(xué)研究所完成，感謝陳曉春教授對(duì)本課題的指導(dǎo)和支持！)

[1] Hartong D T, Berson E L, Dryja T P. Retinitis pigmentosa[J]．Lancet, 2006,368(9549):1795-809.

[2] 黃天文, 林智穎, 陳曉春. N-乙?；腚装彼釋?duì)Aβ25-35活化calpain活性的影響及可能機(jī)制[J]．中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2015,31(11) :1505-9.

[2] Huang T W, Lin Z Y, Chen X C. Possible effect of N-acetyl-L-cysteine on Aβ25-35-induced increase of calpain activity[J]．ChinPharmacolBull, 2015,31(11): 1505-9.

[3] 黃天文, 何饒麗, 周 夢(mèng),等. N-乙酰半胱氨酸對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)tau蛋白過(guò)度磷酸化的影響[J]. 中華醫(yī)學(xué)雜志, 2015,95(33) :2701-4.

[3] Huang T W, He R L, Zhou M, et al. Possible effect of N-acetyl-L-cysteine on Aβ25-35-induced tau hyperphosphorylation[J]．NatlMedJChina, 2015,95(33):2701-4.

[4] Chen X C, Huang T W, Zhang J, et al. Involvement of calpain and p25 of CDK5 pathway in ginsenoside Rb1’s attenuation of beta-amyloid peptide 25-35-induced tau hyperphosphorylation in cortical neurons[J]．BrainRes, 2008,1200: 99-106.

[5] Zhou M, Huang T W, Collins N, et al. APOE4 induces site-specific tau phosphorylation through calpain-CDK5 signaling pathway in EFAD-Tg mice[J]．CurrAlzheimerRes, 2016,13(9):1048-55.

[6] Shelby S J, Angadi P S, Zheng Q D, et al. Hypoxia inducible factor 1α contributes to regulation of autophagy in retinal detachment[J]．ExpEyeRes, 2015,137:84-93.

[7] Huang T W, Fang L J, Lin Z Y, et al. Increase of p25 associated with cortical neuronal death induced by hypoxia[J]．BiochemBiophysResCommun, 2016,477(4):932-6.

[8] Tanito M, Kwon Y W, Kondo N, et al. Cytoprotective effects of geranylgeranylacetone against retinal photooxidative damage[J]．JNeurosci, 2005,25(9):2396-404.

[9] Mackey A M, Sanvicens N, Groeger G, et al. Redox survival signalling in retina-derived 661W cells[J]．CellDeathDiffer, 2008,15(8):1291-303.

[10] Chen H, Tran J T, Anderson R E, et al. Caffeic acid phenethyl ester protects 661W cells from H2O2-mediated cell death and enhances electroretinography response in dim-reared albino rats[J]．MolVis, 2012,18:1325-38.