付金玲　曲志剛　左　玲　宋　丹　康治臣

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院眼科，吉林　長春　130041)

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年齡對斑馬魚視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞密度的影響

付金玲曲志剛1左玲宋丹康治臣2

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院眼科，吉林長春130041)

目的探討年齡對斑馬魚視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞密度的影響。方法利用JB-4福爾根組織學(xué)方法觀察和檢測3、15、27個月野生型斑馬魚視網(wǎng)膜不同區(qū)域、不同種類光感受器細(xì)胞的密度。結(jié)果隨斑馬魚年齡增長，在視網(wǎng)膜各個區(qū)域所有種類的光感受器細(xì)胞密度均逐漸下降。視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞密度總體區(qū)域性變化趨勢是：中央?yún)^(qū)細(xì)胞密度最大，從中央?yún)^(qū)到周邊區(qū)細(xì)胞密度逐漸下降。結(jié)論視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞密度在年齡和區(qū)域上均有一定的變化規(guī)律。在正常老齡化進(jìn)程中，光感受器細(xì)胞密度的下降貫穿于整個視網(wǎng)膜之中。

斑馬魚；視網(wǎng)膜；光感受器細(xì)胞

斑馬魚視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞占所有視網(wǎng)膜細(xì)胞總數(shù)的70%左右，在一些以光感受器細(xì)胞退變?yōu)橹鞯囊暰W(wǎng)膜疾病研究上具有獨(dú)特優(yōu)勢〔1〕。光感受器細(xì)胞主要分為視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞〔2〕。視錐細(xì)胞依據(jù)它們對光譜的最大敏感度可以進(jìn)一步分為四種類型，分別對紫外光(UV)及紅光、綠光、藍(lán)光(RGB) 敏感〔3〕。本文擬研究不同年齡野生型斑馬魚視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞密度的動態(tài)變化。

1　材料與方法

1.1動物飼養(yǎng)AB野生型斑馬魚在14 h光照/10 h黑暗交替循環(huán)的恒溫魚房內(nèi)進(jìn)行培育飼養(yǎng)。

1.2方法

1.2.1JB-4福爾根組織學(xué)檢查分別固定3、15、27個月野生型斑馬魚雙眼眼球于4%多聚甲醛溶液中，常溫過夜。將固定后的標(biāo)本進(jìn)行梯度酒精脫水，并將標(biāo)本及JB-4混合液放置于包埋模具(JB-4包埋試劑盒，Polysciences公司)內(nèi)。將包埋后的眼組織標(biāo)本用超薄切片機(jī)(Thermo Electron公司)經(jīng)過前-后以及腹-背兩個方向進(jìn)行切割。每個切片的厚度是3 μm。在常溫下將切片浸泡于3 N鹽酸中過夜，將染色后的切片在蒸餾水中浸泡10 min。在常溫下將切片在Schiff試劑(Santa Cruz公司)中浸泡2 h，用流水沖洗30 s，再在蒸餾水中浸泡5 min。經(jīng)過洗滌后的切片在常溫下進(jìn)行干燥，中性樹膠封片。

1.2.2光感受器細(xì)胞觀察及計數(shù)在奧林巴斯BX60顯微鏡UplanApo 20×/0,80油鏡下觀察結(jié)果，所有圖像均在同一暴露時間下應(yīng)用4.6版Spot軟件(Diagnostic Instruments公司)進(jìn)行拍攝。將經(jīng)過眼球前-后及腹-背兩個方向切割并經(jīng)福爾根染色后拍攝的完整視網(wǎng)膜圖像分為周邊區(qū)、旁中央?yún)^(qū)及中央?yún)^(qū)。依據(jù)此分區(qū)方法將視網(wǎng)膜共分為九個區(qū)域進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)：前周邊區(qū)、前旁中央?yún)^(qū)、中央?yún)^(qū)、后旁中央?yún)^(qū)、后周邊區(qū)、腹周邊區(qū)、腹旁中央?yún)^(qū)、背旁中央?yún)^(qū)及背周邊區(qū)。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法每個樣本選取平行于視網(wǎng)膜細(xì)胞層延伸200 μm長度范圍內(nèi)的區(qū)域計數(shù)三類細(xì)胞視桿細(xì)胞、UV視錐細(xì)胞以及RGB視錐細(xì)胞。每個樣本選取經(jīng)過連續(xù)切割的三張切片，分別對視網(wǎng)膜的各個區(qū)域各類細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)后取它們的算數(shù)平均值進(jìn)而獲得每個樣本的細(xì)胞密度。再計算所有相同年齡斑馬魚視網(wǎng)膜各個區(qū)域各類細(xì)胞密度的算數(shù)平均值，從而最終獲得各年齡斑馬魚視網(wǎng)膜不同區(qū)域不同種類細(xì)胞的細(xì)胞密度。應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行配對t檢驗(yàn)。

2　結(jié)　果

2.1視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞密度隨年齡增長逐漸下降隨斑馬魚年齡增長，在視網(wǎng)膜各個區(qū)域所有種類的光感受器細(xì)胞密度均逐漸下降。以中央?yún)^(qū)為例，27個月較3個月斑馬魚視網(wǎng)膜三類光感受器細(xì)胞密度均顯著下降(P<0.05)。其中，視桿細(xì)胞密度下降9%，UV視錐細(xì)胞密度下降30%，RGB視錐細(xì)胞密度下降34%。在視網(wǎng)膜其他8個區(qū)域，27個月較3個月斑馬魚視網(wǎng)膜三類光感受器細(xì)胞密度也均顯著下降(P<0.05)。見表1。

2.2視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞密度的區(qū)域性變化以15個月斑馬魚為例，按照中央-旁中央-周邊方向分別在前部、后部、腹部及背部四個區(qū)域進(jìn)行細(xì)胞密度比較。以背部區(qū)為例，旁中央?yún)^(qū)三類光感受器細(xì)胞密度比旁中央?yún)^(qū)增加51%～64%，旁中央?yún)^(qū)三類光感受器細(xì)胞密度比周邊區(qū)增加14%～19%。在其他三個區(qū)域內(nèi)細(xì)胞密度也存在相似的變化趨勢。3個月和27個月斑馬魚視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞密度在四個區(qū)域存在相似的變化趨勢。視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞密度總體區(qū)域性變化趨勢：中央?yún)^(qū)細(xì)胞密度最大，從中央?yún)^(qū)到周邊區(qū)細(xì)胞密度逐漸下降。見表1，圖1。

表1　3、15、27個月斑馬魚視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞密度±s,個)

圖1　15個月視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞密度的區(qū)域性變化

3　討　論

野生型斑馬魚視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞密度在各個區(qū)域隨年齡增長的變化趨勢說明：在正常老齡化進(jìn)程中，所有類型的視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞密度均逐漸下降，這種下降貫穿于整個視網(wǎng)膜之中。這種隨年齡增長細(xì)胞密度下降的變化趨勢考慮是由于野生型斑馬魚隨著眼球發(fā)育視網(wǎng)膜逐漸變長，視網(wǎng)膜延長使細(xì)胞分布變得稀疏，同樣區(qū)域內(nèi)細(xì)胞密度減少?？紤]到斑馬魚視網(wǎng)膜獨(dú)特的神經(jīng)再生特點(diǎn)〔4～6〕，細(xì)胞下降數(shù)目可能會更多。視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞的密度同時存在區(qū)域性變化規(guī)律。在生長早期，視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞發(fā)育從周邊部開始，逐漸向中央?yún)^(qū)及兩側(cè)延伸，最終形成特殊的正態(tài)分布規(guī)律：視網(wǎng)膜中央?yún)^(qū)細(xì)胞密度最大，從中央?yún)^(qū)到周邊區(qū)細(xì)胞密度逐漸下降。這種光感受器細(xì)胞密度在年齡和區(qū)域上變化規(guī)律的發(fā)現(xiàn)有助于進(jìn)一步研究視網(wǎng)膜的發(fā)育機(jī)制。斑馬魚的視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞以視錐細(xì)胞為主〔7～9〕，是研究以光感受器細(xì)胞退變?yōu)橹饕∽儥C(jī)制的視網(wǎng)膜退行性疾病的極佳模式動物〔1〕。掌握正常視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞密度隨年齡增長的變化規(guī)律可以為研究視網(wǎng)膜退變提供必要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。通過本文視網(wǎng)膜視錐細(xì)胞隨年齡增長逐漸死亡，特別是到晚期視錐細(xì)胞大量死亡的研究結(jié)果可以進(jìn)一步揭示人類年齡相關(guān)性黃斑變性、Leber先天性黑矇以及視網(wǎng)膜色素變性的發(fā)病機(jī)制。

1Szamier RB,Berson EL.Retinal ultrastructure in advanced retinitis pigmentosa〔J〕.Invest Ophthalmol Vis Sci,1977;16(10):947-62.

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〔2016-01-22修回〕

(編輯袁左鳴)

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81400433);吉林大學(xué)白求恩計劃資助項(xiàng)目(2015306);吉林大學(xué)優(yōu)秀青年教師培養(yǎng)計劃資助項(xiàng)目(419080500588)

康治臣(1978-)，男，主治醫(yī)師，主要從事神經(jīng)、骨骼系統(tǒng)疾病康復(fù)及神經(jīng)電生理研究。

付金玲(1981-)，女，主治醫(yī)師，主要從事退變性視網(wǎng)膜病變機(jī)制研究。

R774.1

A

1005-9202(2016)16-3893-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.16.010

1吉林大學(xué)第一醫(yī)院脊柱外科2吉林大學(xué)第二醫(yī)院康復(fù)科