馬曉周，劉麒麟，尹唯凰，王 越，于 陽，楊 剛，于子瑩

(吉林大學(xué)口腔醫(yī)院口腔頜面外科 吉林省牙發(fā)育及頜骨重塑與再生實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春130021)

腺樣囊性癌是唾液腺常見的惡性腫瘤之一，易沿神經(jīng)侵襲生長(zhǎng)，常導(dǎo)致患者在患病早期就出現(xiàn)疼痛、面癱和麻木等癥狀[1]，近年來唾液腺腺樣囊性癌沿神經(jīng)侵襲機(jī)制的研究已成為學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)。CC趨化因子受體6(CC chemokine receptor 6,CCR6)是CC趨化因子配體20(CC chemokine ligand 20， CCL20)的受體，是高度保守的G蛋白偶聯(lián)七次跨膜受體。CCR6/CCL20生物軸在胰腺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌和血液系統(tǒng)惡性腫瘤的器官特異性轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的驅(qū)動(dòng)、導(dǎo)向和定位作用。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于CCR6/CCL20生物軸在唾液腺腺樣囊性癌嗜神經(jīng)侵襲中的作用機(jī)制研究尚未見報(bào)道。本研究通過檢測(cè)CCR6在人唾液腺腺樣囊性癌組織中的表達(dá)，分析其與涎腺腺樣囊性癌病理分型的關(guān)系，并探討其在涎腺腺樣囊性癌神經(jīng)侵襲中可能的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選取2013—2016年在吉林大學(xué)口腔醫(yī)院診斷的唾液腺腺樣囊性癌患者30例，其中男性5例，女性25例，年齡25～74歲，平均年齡53歲。30例患者均經(jīng)病理證實(shí)，其中頜下腺來源7例，腮腺來源7例，舌下腺來源16例；病理標(biāo)本均連續(xù)切片，HE染色，每例標(biāo)本選取不同部位切片5張，鏡下觀察若發(fā)現(xiàn)1處或1處以上癌細(xì)胞沿神經(jīng)束周圍或神經(jīng)束間浸潤(rùn)性生長(zhǎng)則為有神經(jīng)侵襲，其中神經(jīng)侵襲組18例，非神經(jīng)侵襲組12例；按照2005年WHO關(guān)于腺樣囊性癌的病理分類標(biāo)準(zhǔn)，30例唾液腺腺樣囊性癌病理標(biāo)本中篩狀型12例，管狀型10例，實(shí)性型8例。收集2016—2017年在吉林大學(xué)口腔醫(yī)院手術(shù)獲取的22例正常人唾液腺標(biāo)本作為正常對(duì)照組，其中腮腺10例，頜下腺8例，舌下腺4例；所有標(biāo)本均經(jīng)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋后連續(xù)切片，HE染色。

1.2 主要試劑兔抗人CCR6購(gòu)自北京博奧森公司，工作濃度1∶100；兔源性超敏二步法免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋公司，該試劑盒中包含試劑：3%H2O2，試劑1(聚合物輔助劑)，試劑2(辣根酶標(biāo)記抗兔IgG聚合物)；濃縮型DAB試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋公司，該試劑盒中包含試劑：濃縮DAB溶液(20×)，DAB底物液；EDTA抗原修復(fù)液(50×)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所。

1.3 免疫組織化學(xué)染色脫蠟、水化組織切片；用EDTA熱修復(fù)10 min(具體步驟參照說明書)；3%H2O2去離子水孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；PBS沖洗，2 min×3次；滴加一抗，4℃孵育過夜，PBS沖洗，2 min×3次；滴加試劑1，37℃孵育10 min，PBS沖洗，2 min×3次；滴加試劑2，37℃孵育10 min，PBS沖洗，2 min×3次；應(yīng)用DAB溶液顯色；自來水充分沖洗、復(fù)染、脫水、透明、封片。實(shí)驗(yàn)中以PBS代替一抗作陰性對(duì)照組。采用Olympus BX51T顯微鏡進(jìn)行觀察、拍照。

1.4 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)陽性細(xì)胞數(shù)量積分：無陽性細(xì)胞為0分, 陽性細(xì)胞≤25% 為1 分,26% ～50% 為2 分,51% ～75% 為3 分,>75% 為4分；著色強(qiáng)度積分：無色為0分, 淡黃色為1 分,棕黃色為2 分, 棕褐色為3 分。著色強(qiáng)度積分與數(shù)量積分相加: 0分為(-), 2和3 分為(±), 4和5分為(+), 6和7 分為(++), 其中(+) 和(++) 為陽性，(-)和(±)為陰性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。CCR6陽性表達(dá)率以百分率(%)表示，不同組間及不同臨床變量(性別、年齡、病理分級(jí)和嗜神經(jīng)現(xiàn)象)患者唾液腺腺樣囊性癌組織中CCR6陽性表達(dá)率比較采用Fisher確切概率法。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 唾液腺腺樣囊性癌患者癌組織和正常人涎腺組織中CCR6表達(dá)免疫組織化學(xué)染色顯示：CCR6在唾液腺腺樣囊性癌細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中呈彌漫性黃棕色表達(dá)(圖1A，見插頁(yè)四)，在正常人唾液腺組織中呈陰性表達(dá)(圖1B，見插頁(yè)四)。30例唾液腺腺樣囊性癌患者癌組織中有22例CCR6呈陽性表達(dá)，陽性表達(dá)率為73.33% ；22例正常人涎腺組織中CCR6均呈陰性表達(dá)，陽性表達(dá)率為0%；2組不同組織中CCR6陽性表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 不同臨床病理特征唾液腺腺樣囊性癌患者癌組織中CCR6陽性表達(dá)率18例神經(jīng)侵襲組患者癌組織CCR6呈陽性表達(dá)17例(圖1C，見插頁(yè)四)，1例呈陰性表達(dá)，CCR6陽性表達(dá)率為94.44%；12例非神經(jīng)侵襲組患者癌組織CCR6陽性表達(dá)5例(圖1D，見插頁(yè)四)，陰性表達(dá)7例，CCR6陽性表達(dá)率為41.67%；神經(jīng)侵襲組患者癌組織中CCR6陽性表達(dá)率高于非神經(jīng)侵襲組(P<0.05)。篩狀型和管狀型唾液腺腺樣囊性癌組織中CCR6主要表達(dá)于篩狀結(jié)構(gòu)和管狀結(jié)構(gòu)中，陽性表達(dá)率分別為75.00%和90.00%，實(shí)性型唾液腺腺樣囊性癌組織中CCR6主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞團(tuán)中，陽性表達(dá)率為50%，三者間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。不同年齡和性別唾液腺腺樣囊性癌患者癌組織中CCR6陽性表達(dá)率比較差異均統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同臨床病理特征唾液腺腺樣囊性癌患者癌組織中CCR6陽性表達(dá)率

3 討 論

腺樣囊性癌是唾液腺最常見的惡性腫瘤之一，具有神經(jīng)侵襲性的特征。由于唾液腺腺樣囊性癌常沿神經(jīng)浸潤(rùn)生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，常規(guī)手術(shù)、放療和化療等治療效果不能令人滿意，30%～40%的患者在術(shù)后2年復(fù)發(fā)，因此尋找腺樣囊性癌基因治療有效靶點(diǎn)對(duì)腺樣囊性癌的診治具有極其重要的意義[2]。

趨化因子是一組可溶性的相對(duì)分子質(zhì)量為8 000～14 000的小分子蛋白，與其同源性G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合后可引發(fā)一系列細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)，從而促使細(xì)胞發(fā)生有向性遷移或趨化行為[3]。趨化因子受體可分為4類[4]：CXC趨化因子受體(CXCR)、CC趨化因子受體(CCR)、CX3C趨化因子受體(CX3CR)和XC趨化因子受體(XCR)。趨化因子及其受體在多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)，尤其是具有高轉(zhuǎn)移潛能的細(xì)胞中，因與腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移關(guān)系密切而成為目前研究熱點(diǎn)，也為抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的基因靶向治療提供了全新的研究方向。王堃等[5]研究發(fā)現(xiàn)：CXCR4在卵巢癌細(xì)胞中高表達(dá)，其表達(dá)的上調(diào)促進(jìn)上皮性卵巢癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲；在唾液腺腺樣囊性癌嗜神經(jīng)侵襲機(jī)制的研究中，有研究[6-7]證實(shí)：CCR5在唾液腺腺樣囊性癌標(biāo)本中呈陽性表達(dá)，且CCR5/CCL5生物軸在涎腺腺樣囊性癌嗜神經(jīng)侵襲中發(fā)揮著重要作用；杜貴霞[8]研究發(fā)現(xiàn)：CXCL12和CXCR4蛋白在具有神經(jīng)侵襲現(xiàn)象的人唾液腺腺樣囊性癌組織中的陽性表達(dá)率高于不具有神經(jīng)侵襲現(xiàn)象者，提示該生物軸可能在腺樣囊性癌嗜神經(jīng)侵襲中發(fā)揮著重要作用。目前研究[9]顯示：CCL20是CCR6的唯一配體。Andre等[10]研究發(fā)現(xiàn)：乳腺癌組織中有CCR6的表達(dá)，且CCR6高表達(dá)與乳腺癌的胸膜轉(zhuǎn)移有關(guān)聯(lián)；也有學(xué)者[11-12]對(duì)乳腺癌組織中趨化因子受體的表達(dá)情況進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)：乳腺癌組織中有CCR5和CCR6等的表達(dá)，且其表達(dá)情況與癌細(xì)胞是否轉(zhuǎn)移有關(guān)。Lu 等[13]證實(shí)：CCR6高表達(dá)于喉癌細(xì)胞中，CCL20可以明顯促進(jìn)人喉癌細(xì)胞株的增殖和遷移。研究[14-20]顯示：CCR6對(duì)肝癌、胃癌、大腸癌和結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移和增殖具有促進(jìn)作用 。

本研究結(jié)果顯示：30例唾液腺腺樣囊性癌患者癌組織中CCR6的陽性表達(dá)率明顯高于正常唾液腺組織，在不同病理分型、年齡和性別患者癌組織中CCR6的陽性表達(dá)率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，神經(jīng)侵襲組唾液腺腺樣囊性癌患者癌組織中CCR6陽性表達(dá)率高于非神經(jīng)侵襲組。本文作者推測(cè)：可能是周圍神經(jīng)釋放CCR6的配體CCL20，與腺樣囊性癌細(xì)胞的CCR6結(jié)合后，啟動(dòng)癌細(xì)胞內(nèi)運(yùn)動(dòng)和侵襲的信號(hào)通路，促進(jìn)其向周圍神經(jīng)遷移和侵襲。本研究為后續(xù)人唾液腺腺樣囊性癌的體外研究提供了理論依據(jù)。

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