發(fā)明人：胡惠仁 趙晶 劉廷志 張正健

專利權(quán)人：天津科技大學(xué)

申請(qǐng)?zhí)枺?00810153643.4

授權(quán)公布號(hào)：CN 101418287 B

授權(quán)公告日：2010-12-08

權(quán)利要求書

1.一種黑曲霉液態(tài)發(fā)酵果膠酶制備方法，其特征在于：使用的生產(chǎn)菌株為黑曲霉(Aspergillus niger)，保藏單位為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址是北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏日期2008年11月25日，保藏號(hào)CGMCC No.2784，通過(guò)黑曲霉液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)果膠酶，發(fā)酵步驟包括：

發(fā)酵方法：

（1）培養(yǎng)基的制備

搖瓶種子培養(yǎng)基：麩皮10～30 g/L；葡萄糖20～30 g/L；(NH4)2SO410～20 g/L；KH2PO41～3 g/L；Mg-SO4·7H2O 0.5～1 g/L，pH 4.0～6.0；

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：麩皮40～50 g/L；(NH4)2SO410～30 g/L；NaCl 1～4 g/L；MgSO4·7H2O 0.5～3 g/L；pH 4.0～6.0；

（2）發(fā)酵培養(yǎng)

將黑曲霉試管斜面菌種接入液體種子發(fā)酵罐中，在溫度30℃、攪拌速度120 r/min、通風(fēng)量0.2 m3/h的條件下發(fā)酵36～72 h，得到所需要的液體種子；然后按照3%～5%的接種量將種子接入黑曲霉發(fā)酵罐，在溫度30～50℃、攪拌速度120 r/min、通風(fēng)量0.2 m3/h的條件下發(fā)酵36～72 h，然后經(jīng)過(guò)離心分離制得所需果膠酶液，并將其儲(chǔ)存在果膠酶存儲(chǔ)罐中以備用；

（3）果膠酶液提純

用截留分子量10000的超濾膜對(duì)發(fā)酵液樣品進(jìn)行超濾濃縮至原體積的1/10～1/2后，收集濃縮粗酶液備用，進(jìn)行硫酸銨分級(jí)沉淀預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定硫酸銨分級(jí)沉淀的濃度為40%～100%，將粗酶液離心去除菌體，向上清液中加入硫酸銨至40%飽和度，4℃放置24 h，經(jīng)4℃、8000 r/min離心10 min后，上清液繼續(xù)加入硫酸銨至100%飽和度，4℃放置24 h，經(jīng)4℃、8000 r/min離心30 min后，收集沉淀，將其溶于pH 6.0的乙酸-乙酸鈉緩沖液中，用透析袋透析，得到提純后的果膠酶液，果膠酶液的酶學(xué)性質(zhì)為，最適反應(yīng)溫度30～60℃， 最適pH值4～6，30～60℃下保溫2 h后剩余酶活高于90%。

2.一種采用權(quán)利要求1制備的果膠酶應(yīng)用于處理造紙白水中溶解和膠體物質(zhì)，其特征在于：加入果膠酶液至白水中，處理溫度為30～60℃，處理時(shí)間20～60 min，所述白水為以機(jī)械漿和化學(xué)機(jī)械漿為主要漿料的造紙機(jī)白水，用于處理白水的果膠酶酶液的用量為15～50 U/100 mL白水。

3.一種采用權(quán)利要求1制備的果膠酶應(yīng)用于控制紙漿中的溶解和膠體物質(zhì)的方法，其特征在于：果膠酶添加入紙漿中，添加用量為3～10 U/g絕干漿，所述紙漿漿種為機(jī)械漿和化學(xué)機(jī)械漿。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種黑曲霉液態(tài)發(fā)酵果膠酶，尤其涉及應(yīng)用于造紙白水和紙漿的黑曲霉液態(tài)發(fā)酵果膠酶。

背景技術(shù)

隨著造紙白水循環(huán)回用技術(shù)的不斷發(fā)展，目前造紙用水量已經(jīng)有了很大程度的減少。但隨著白水封閉循環(huán)程度的提高和循環(huán)次數(shù)的不斷增加，白水中有害物質(zhì)也會(huì)逐漸積累。在這些有害物質(zhì)中，對(duì)抄紙和造紙濕部化學(xué)影響最大、最難處理的是白水中的稱為“陰離子垃圾”的溶解和膠體物質(zhì)（DCS）。膠體物質(zhì)的不斷富集，進(jìn)而改變了電導(dǎo)率平衡，并增加陽(yáng)離子需求。這些陰離子垃圾更易于與陽(yáng)離子型的造紙助劑發(fā)生中和、吸附等作用，從而降低助劑的效果或失效。進(jìn)而會(huì)導(dǎo)致濕紙頁(yè)強(qiáng)度和抗張強(qiáng)度降低，紙機(jī)斷頭增多，運(yùn)行性能降低。

傳統(tǒng)的白水處理方法主要集中在對(duì)懸浮固體物（SS）的處理上，通過(guò)機(jī)械作用如圓盤過(guò)濾機(jī)、浮選和沉淀澄清器等，或進(jìn)行生化處理，采用活性污泥或厭氧好氧生物反應(yīng)器，但這些方法對(duì)廢水中DCS的去除并不十分有效，只能作為一種初始處理措施。溶氣浮選（dissolved air flotation，DAF）是目前新聞紙廠常用的水凈化裝置。DAF對(duì)于懸浮固體物質(zhì)的去除是有效的，但對(duì)白水中DCS的去除效果并不好。

在現(xiàn)代造紙系統(tǒng)中，常采用化學(xué)方法對(duì)DCS進(jìn)行控制。其中，減少造紙?bào)w系中陰離子垃圾的影響最有效的方法是用陰離子垃圾捕捉劑（ATC）或定著劑（fixative）對(duì)漿料進(jìn)行預(yù)處理。但是，添加ATC時(shí)要嚴(yán)格控制用量，用量太少不能有效控制陰離子垃圾問(wèn)題，用量太大會(huì)引起過(guò)陽(yáng)離子化而影響后續(xù)紙頁(yè)成型，影響助留助濾劑的添加效果，添加量應(yīng)由溶解電荷和膠體表面電荷的滴定來(lái)確定。

對(duì)于未漂TMP漿，每噸漿中含有大約2 kg的溶解果膠。

有研究表明，漂白機(jī)械漿的溶解和膠體物質(zhì)（DCS）物質(zhì)主要產(chǎn)生在H2O2漂白過(guò)程中，果膠酸是漂白機(jī)械漿中DCS的陽(yáng)離子需要量的重要貢獻(xiàn)者。果膠是一種主要由半乳糖醛酸組成的多聚糖，脫甲基果膠一般稱為聚半乳糖醛酸或果膠酸。在機(jī)械制漿的磨漿過(guò)程中，由于高溫和高強(qiáng)度的機(jī)械作用，部分果膠質(zhì)從纖維中游離出來(lái)。

果膠酶是分解果膠質(zhì)的多種酶的總稱，在食品加工、飼料加工、紡織、環(huán)境保護(hù)、誘導(dǎo)植物抗病等方面都有重大應(yīng)用價(jià)值。微生物因具有生長(zhǎng)速度快、生長(zhǎng)條件簡(jiǎn)單、代謝過(guò)程特殊和分布廣等特點(diǎn)而成為果膠酶的重要來(lái)源。近年來(lái)，不少學(xué)者把果膠酶應(yīng)用于制漿造紙工業(yè)中。

美國(guó)專利5487172號(hào)披露了果膠酶處理可以降低熱磨機(jī)械漿（TMP）中40%的陽(yáng)離子需求。

Reid 等 在《Enzyme and Microbial Technology》2000年第26卷第2期115～123頁(yè)“Pectinase in papermaking：Solving retentionproblems in mechanical pulps bleached with hydrogen peroxide”一文中報(bào)道了在工廠實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過(guò)果膠酶處理的熱磨機(jī)械漿（TMP）循環(huán)水的陽(yáng)離子需求可降低28%～60%。

李宗全等在《中國(guó)造紙》2006年第25卷第8期23～26頁(yè)“果膠酶處理BCTMP中DCS物質(zhì)及其對(duì)陽(yáng)離子助劑作用效果的影響”一文中的研究表明：果膠酶能夠降解溶解物和膠體物質(zhì)(DCS)中產(chǎn)生陰離子垃圾的主要物質(zhì)果膠酸。DCS經(jīng)果膠酶處理后，陽(yáng)電荷需要量明顯降低，與不用果膠酶處理相比，在相同陽(yáng)離子助留劑加入量下，細(xì)小纖維的留著率明顯提高。因此，使用果膠酶處理機(jī)械漿或造紙白水，可以減少其中的陰離子垃圾，降低陽(yáng)離子聚合物的加入量，提高細(xì)小纖維的留著率。

但是，由于之前的學(xué)者均采用商品果膠酶處理，導(dǎo)致用果膠酶處理DCS物質(zhì)成本偏高。因此，我國(guó)造紙界亟待開(kāi)發(fā)以取代商品果膠酶的成本低的果膠酶，用以處理造紙白水和控制紙漿中的溶解和膠體物質(zhì)（DCS）物質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種黑曲霉液態(tài)發(fā)酵果膠酶的發(fā)酵工藝，通過(guò)此工藝發(fā)酵的果膠酶具有酶活高和良好熱穩(wěn)定性。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種將上述果膠酶應(yīng)用于處理造紙白水和控制紙漿中的溶解和膠體物質(zhì)的工藝，該工藝有效地降解白水中溶解和膠體物質(zhì)和控制紙漿中的溶解和膠體物質(zhì)，減少對(duì)陽(yáng)離子的需求。

本發(fā)明為達(dá)到上述目的，所采用的技術(shù)方案：

一種黑曲霉液態(tài)發(fā)酵果膠酶，其特征在于使用的生產(chǎn)菌株為黑曲霉(Aspergillus niger)，保藏單位為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址是北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏日期2008年11月25日，保藏號(hào)CGMCC No.2784，通過(guò)黑曲霉液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)果膠酶，其發(fā)酵步驟包括：

（1）培養(yǎng)基的制備

搖瓶種子培養(yǎng)基：麩皮 10～30 g/L；葡萄糖 20～30 g/L；(NH4)2SO410～20 g/L；KH2PO41～3 g/L；Mg-SO4·7H2O 0.5～1 g/L，pH 4.0～6.0；

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：麩皮40～50 g/L；(NH4)2SO410～30 g/L；NaCl 1～4 g/L；MgSO4·7H2O 0.5～3 g/L；pH 4.0～6.0 ；

（2）發(fā)酵方法

將黑曲霉試管斜面菌種接入液體種子發(fā)酵罐中，在溫度30℃、攪拌速度120 r/min、通風(fēng)量0.2 m3/h的條件下發(fā)酵36～72 h，得到所需要的液體種子；然后按照3%～5%的接種量將種子接入黑曲霉發(fā)酵罐，在溫度30～50℃、攪拌速度120 r/min、通風(fēng)量0.2 m3/h的條件下發(fā)酵36～72 h，然后經(jīng)過(guò)離心分離制得所需果膠酶液，并將其儲(chǔ)存在果膠酶存儲(chǔ)罐中以備用；

（3）果膠酶液提純

用截留分子量10000的超濾膜對(duì)發(fā)酵液樣品進(jìn)行超濾濃縮至原體積的1/10～1/2后，收集濃縮粗酶液備用，進(jìn)行硫酸銨分級(jí)沉淀預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定硫酸銨分級(jí)沉淀的濃度為40%～100%，將粗酶液離心去除菌體，向上清液中加入硫酸銨至40%飽和度，4℃放置24 h，經(jīng)4℃、8000 r/min離心10 min后，上清液繼續(xù)加入硫酸銨至100%飽和度，4℃放置24 h，經(jīng)4℃、8000 r/min離心30 min后，收集沉淀，將其溶于pH 6.0的乙酸-乙酸鈉緩沖液中，用透析袋透析，得到提純后的果膠酶液，其酶學(xué)性質(zhì)：最適反應(yīng)溫度為 30～60 ℃，最適 pH 值為 4～6，30～60 ℃下保溫 2 h后剩余酶活高于90%。

采用本發(fā)明的制備方法制得的果膠酶酶液應(yīng)用于處理造紙白水中溶解和膠體物質(zhì)的方法，果膠酶處理溶解和膠體物質(zhì)的工藝如下：

加入果膠酶液至白水中，處理溫度為30～60℃，處理時(shí)間 20～60 min。

所述白水為以機(jī)械漿和化學(xué)機(jī)械漿為主要漿料的造紙機(jī)白水。

所述果膠酶用量為15～50 U/100mL白水。

采用本發(fā)明的制備方法制得的果膠酶應(yīng)用于控制紙漿中溶解和膠體物質(zhì)，將果膠酶添加于紙漿內(nèi)，添加用量為3～10 U/g絕干漿，所述紙漿為機(jī)械漿和化學(xué)機(jī)械漿。

本發(fā)明的有益效果：

與傳統(tǒng)的機(jī)械法和化學(xué)法處理白水以及用未加果膠酶液的白水做空白對(duì)照比較，本發(fā)明能有效地降解DCS物質(zhì)中的果膠類物質(zhì)，白水陽(yáng)離子需求量(CD值)降低25%～30%，顆粒粒徑減小，電導(dǎo)率增大。

本發(fā)明果膠酶液添加于紙漿內(nèi)，對(duì)紙漿處理后，有效地降解了紙漿內(nèi)的膠體物質(zhì)。

具體實(shí)施方式

為了進(jìn)一步了解本發(fā)明的內(nèi)容、特點(diǎn)，下面用具體實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明。

實(shí)施例

（1）液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)果膠酶

將黑曲霉試管斜面菌種接入液體種子發(fā)酵罐中，種子發(fā)酵培養(yǎng)基采用：麩皮10 g/L，葡萄糖20 g/L，(NH4)2SO420 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，pH 4.0；在溫度 30 ℃、pH 4.0、攪拌速度 120 r/min、通風(fēng)量0.2 m3/h的條件下發(fā)酵48 h得到所需要的液體種子；然后按照3%的接種量將種子接入黑曲霉發(fā)酵罐，發(fā)酵培養(yǎng)基采用：麩皮 40 g/L；(NH4)2SO410 g/L；NaCl 1 g/L；MgSO4·7H2O 1 g/L；pH 4.0；在溫度 30 ℃、pH 5、攪拌速度120r/min、通風(fēng)量0.2 m3/h的條件下發(fā)酵72 h。過(guò)濾并離心發(fā)酵液，測(cè)量果膠酶酶活，吸光度達(dá)到0.725。

（2）果膠酶液的純化

將粗酶液過(guò)濾離心后用截留分子量10000的膜對(duì)其進(jìn)行超濾至原有體積的1/5。設(shè)定硫酸按濃度從0～100%，向酶液中加入硫酸銨粉末并進(jìn)行有規(guī)則的攪拌，4℃放置24 h，觀察并測(cè)定上清液中三種果膠酶的活力。結(jié)果表明粗果膠酶液中果膠酶的硫酸銨分級(jí)沉淀的濃度為50%～100%。

果膠酶液處理造紙白水中的溶解和膠體物質(zhì)工藝：加入20U果膠酶液于盛有100 mL白水中，在40℃下處理40 min。

用未加果膠酶液的白水做空白對(duì)照例。與空白對(duì)照例比較，經(jīng)過(guò)果膠酶液處理，白水處理后的陽(yáng)離子需求量減少25%～30%，顆粒粒徑減小，電導(dǎo)率增大果膠酶液應(yīng)用于控制紙漿中膠體物質(zhì)DCS的工藝：

將果膠酶液添加于紙漿內(nèi)，添加用量為3～10 U/g絕干漿。所述紙漿為機(jī)械漿和化學(xué)機(jī)械漿，通過(guò)果膠酶對(duì)紙漿的處理，降解了紙漿內(nèi)的膠體物質(zhì)。

本發(fā)明具有處理工藝操作簡(jiǎn)單，成本低和易于控制等優(yōu)點(diǎn)。