肖 黎 張水蓉 胡 萍 陳 燕 張思思

(荊州市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北 荊州 434020)

全球每年新增宮頸癌病例約47萬(wàn)，每年近23萬(wàn)患者死于宮頸癌〔1〕，嚴(yán)重威脅女性健康。微小RNA(miR)是一類長(zhǎng)度在20～23個(gè)核苷酸編碼的內(nèi)源性小RNA，廣泛存在于各種生命體。miR參與人類全部細(xì)胞周期過程，并調(diào)控人類約60%蛋白編碼基因〔2〕，而miR異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生，在腫瘤中miR通過對(duì)下游靶基因的調(diào)控，發(fā)揮癌基因或抑癌基因的功能〔3〕，已在肺癌〔4〕，胃癌〔5〕，乳腺癌〔6〕等多種腫瘤中得到證實(shí)。 miR-31被認(rèn)為是一種抑癌基因，參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，本文觀察上調(diào)miR-31后檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-3相關(guān)指標(biāo)及侵襲的變化，進(jìn)一步了解miR-31在宮頸鱗癌細(xì)胞系中的生物學(xué)功能。

1 材料與方法

1.1材料 組織標(biāo)本來(lái)自于荊州市中心醫(yī)院2014年5月至2015年7月，收集新鮮宮頸鱗癌16例，正常宮頸組織16例，均為病理確診，所有標(biāo)本來(lái)源患者無(wú)其他腫瘤疾病，未進(jìn)行過放射或化學(xué)治療。siHa細(xì)胞系(上海通派生物公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將解凍復(fù)蘇的siHa細(xì)胞放置于5%CO2，37℃恒溫箱中培養(yǎng)，并進(jìn)行傳代，轉(zhuǎn)染前將細(xì)胞接種于6孔板中，設(shè)置實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組，消化后當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)60%左右時(shí)，取2 μl/孔lipo2000，稀釋于200 μl無(wú)血清含各種氨基酸和葡萄糖的培養(yǎng)基(DMEM)，輕混搖勻室溫孵育5 min，與含有4 μl miR-31 mimic的無(wú)血清DMEM稀釋液200 μl混合搖勻，室溫靜置15 min；取該混合物加入siHa細(xì)胞孔板中，溫箱培養(yǎng)4 h后更換為含血清DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后提取總RNA或蛋白。

1.3逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè) 收集組織或細(xì)胞，勻漿后，Trizol提取液按(1 ml/100 mg組織；1 ml/107個(gè)細(xì)胞)進(jìn)行總RNA的提取，并對(duì)總RNA進(jìn)行質(zhì)量控制。以提取的總RNA，室溫溶解，于冰上配置RT體系25 μl：5×RT緩沖液1 μl，總RNA 2 μl，Poly A聚合酶1 μl，RTase 1 μl，ddH2O 20 μl，搖勻后，37℃孵育45 min，85℃滅活反應(yīng)酶5 min。PCR體系20 μl：2×成熟體(All-in-oneTM) q-PCR混合物10 μl，All-in-oneTMmiRNA qPCR引物2 μl，50×凹槽氧化參比染料0.4 μl，cDNA (稀釋1∶5～1∶10)2 μl，ddH2O 7.6 μl。95℃ 10 min，預(yù)變性；95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 10 s，40個(gè)循環(huán)。以U6RNA作為內(nèi)參照，按2-△△Ct法計(jì)算miR相對(duì)表達(dá)量。引物序列：miR-31 mimic正向鏈5′-UGCCAAGATGCTGGCATACAU-3′。同法以提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄，以GAPDH作為內(nèi)參照，計(jì)算MMP-3 mRNA的表達(dá)量(引物序列MMP-3：5′-CCTGCTTTGTCCTTTGATGC-3′)。

1.4采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)宮頸癌siHa細(xì)胞株侵襲性 常規(guī)制備Transwell小室，收集消化后的各組細(xì)胞，懸浮后，按2.5×104個(gè)細(xì)胞/孔加入上室，下室加入含血清培養(yǎng)基，放于溫箱培養(yǎng)48 h后，去除上室Matrigel膠和細(xì)胞，下室甲醇固定，結(jié)晶紫染色，高倍光鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.5Western印跡檢測(cè)MMP-3的蛋白表達(dá) 收集轉(zhuǎn)染后48 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2遍，加蛋白提取液，冰上裂解10 min，勻漿后，取上清超聲2次，再10 000 r/min 10 min，再取上清，進(jìn)行蛋白定量。取等量蛋白(40 μg)于12%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，把蛋白轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，封閉1 h，分別用GAPDH和MMP-3一抗4℃孵育過夜,二抗孵育1 h后Tween-20 Tris鹽酸緩沖液(TBST)漂洗3次。然后用電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑暗室顯影。

1.6統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1兩種組織標(biāo)本中miRNA-31的表達(dá) 與正常宮頸組織(0.659±0.03)對(duì)比，宮頸鱗癌組織miR-31(0.045±0.01)明顯下調(diào)(P<0.01)。

2.2miR-31在各組宮頸siHa細(xì)胞的表達(dá)情況 檢測(cè)轉(zhuǎn)染后24 h，實(shí)驗(yàn)組miR-31(0.751±0.04)明顯高于陰性對(duì)照組(0.032±0.03)及空白對(duì)照組(0.041±0.08)(P<0.01)，表明實(shí)驗(yàn)成功上調(diào)miRNA-31表達(dá)。

2.3轉(zhuǎn)染48 h后siHa細(xì)胞MMP-3 mRNA的表達(dá)情況 實(shí)驗(yàn)組MMP-3 mRNA(0.473±0.188)、陰性對(duì)照組(0.492±0.288)及空白對(duì)照組(0.388±0.150)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.514，P>0.05)。

2.4轉(zhuǎn)染后48 h MMP-3蛋白表達(dá)量 MMP-3蛋白的表達(dá)量分別為實(shí)驗(yàn)組(24 837.7±2 930.8)、陰性對(duì)照組(18 144.0±3 265.9)、空白對(duì)照組(16 111.2±2 416.7)，實(shí)驗(yàn)組MMP-3蛋白的表達(dá)量顯著高于陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組(P<0.01)；而陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.5上調(diào)miR-31對(duì)宮頸siHa細(xì)胞侵襲性的影響 在轉(zhuǎn)染后48 h，實(shí)驗(yàn)組平均侵襲數(shù)(36.6±3.21)，空白對(duì)照組(49.4±3.05)，陰性對(duì)照組(46.0±3.65)，實(shí)驗(yàn)組較空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組侵襲數(shù)明顯減少(P<0.01)，上調(diào)siHa細(xì)胞中miR-31的表達(dá)，可顯著抑制細(xì)胞的侵襲能力。

3 討 論

研究顯示miR可以通過調(diào)解下游靶基因表達(dá)的方式參與細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)移等生理病理過程〔7〕。Guo等〔8〕通過生物預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-15b及miR-16同時(shí)靶向bcl-2，并通過實(shí)驗(yàn)方法上調(diào)肝細(xì)胞中miR-15b及miR-16的表達(dá)降低bcl-2基因表達(dá)，增加含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspases)3、8、9表達(dá)，證實(shí)了miR-15b/bcl-2/caspases3、8、9及miR-16/bcl-2/caspases3、8、9凋亡調(diào)節(jié)通路的存在。本研究結(jié)果與黃晨等〔9〕研究相符，上調(diào)miR-31的相對(duì)表達(dá)可誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞的凋亡，并抑制癌細(xì)胞的淋巴轉(zhuǎn)移。通過對(duì)miR-31進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，MMP-3為其3′-非翻譯區(qū)(UTR)潛在靶基因。MMP家族參與組織重塑、血管形成，并是參與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)降解的內(nèi)肽酶〔10，11〕，最近研究還顯示MMPs在調(diào)控腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞凋亡、侵襲及免疫監(jiān)視中發(fā)揮重要作用〔11〕。MMP-3能激活其他幾種MMPs，包括MMP-1、MMP-9〔10〕，而研究顯示MMP-1、MMP-7，MMP-9，MMP-13在原發(fā)實(shí)體腫瘤及轉(zhuǎn)移瘤中高表達(dá)。

研究證實(shí)MMP-3在肺癌中的表達(dá)與癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移情況呈正相關(guān)，而且在轉(zhuǎn)移病灶中MMP-3的表達(dá)量顯著升高〔12〕。本實(shí)驗(yàn)提示miR-31與MMP-3基因3′-UTR結(jié)合后，導(dǎo)致MMP-3 mRNA翻譯受阻；miR-31可靶向調(diào)控MMP-3基因。Zheng等〔13〕證實(shí)miR-31作為原癌基因參與宮頸癌的發(fā)生及進(jìn)展，與本文一致。

一種miR可靶向調(diào)節(jié)多個(gè)基因的表達(dá)，而同一個(gè)靶基因又可接受多個(gè)miR的調(diào)控，所以有關(guān)miR與其靶基因的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系還有待明確，但miR-31有可能成為宮頸癌治療或預(yù)后評(píng)價(jià)的關(guān)鍵基因。

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