張 通，張家新

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古自治區(qū)動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

幼畜體外胚胎移植（Juvenile In Vitro Embryo Transfer，JIVET）技術(shù)是一項重要的繁殖生物技術(shù)，其利用幼畜卵巢上儲備的大量卵母細(xì)胞生產(chǎn)體外胚胎，具有發(fā)揮優(yōu)秀母畜的繁殖潛能、縮短繁育世代間隔，提高畜群遺傳進(jìn)展的優(yōu)勢。目前，許多研究機(jī)構(gòu)和企業(yè)利用JIVET技術(shù)繁育獲得了健康后代，但羔羊誘導(dǎo)卵泡發(fā)育效果不穩(wěn)定、卵母細(xì)胞體外發(fā)育能力差、胚胎產(chǎn)出效率低等問題限制了羊JIVET技術(shù)在生產(chǎn)實踐中的利用效率。因此，本文對羊JIVET技術(shù)的原理、研究進(jìn)展以及影響JIVET技術(shù)效率的因素加以綜述，以期提高JIVET技術(shù)的利用效率，促進(jìn)其應(yīng)用。

1 JIVET技術(shù)的原理與最新研究進(jìn)展

自然情況下，每只成年母羊不經(jīng)激素誘導(dǎo)處理僅可獲得2～8枚卵母細(xì)胞，經(jīng)激素誘導(dǎo)處理后的每只成年羊可獲得10～20枚卵母細(xì)胞。然而，幼齡羔羊卵巢上有腔卵泡數(shù)量儲備多，下丘腦-垂體-卵巢調(diào)控軸機(jī)能尚未發(fā)育健全，不具備調(diào)控卵泡發(fā)育成熟排卵功能，一般在4～8周齡誘導(dǎo)羔羊卵泡超數(shù)發(fā)育。Kennedy等[1]觀察發(fā)現(xiàn)，自然情況下在母羊妊娠135 d左右，綿羊胎兒卵巢上開始出現(xiàn)有腔卵泡，出生后有腔卵泡的數(shù)目隨羔羊日齡的增長而逐漸增多，在出生后4～8周齡卵泡數(shù)達(dá)到高峰。隨著初情期的到來，卵泡數(shù)量隨之減少并維持相對穩(wěn)定。Tassell等[2]研究發(fā)現(xiàn)，2周齡時綿羊卵巢上生長卵泡數(shù)量最多，4周齡時總卵泡數(shù)達(dá)到峰值，而且大多數(shù)卵泡的直徑小于1.4 mm；4周齡羔羊卵巢上開始發(fā)生卵泡閉鎖的跡象，8～10周齡羔羊卵巢上卵泡閉鎖的數(shù)量逐漸增多。由上可知，出生后2～8周齡是羔羊卵泡生長發(fā)育的旺盛階段。

卵泡對促性腺激素反應(yīng)能力的強(qiáng)弱決定了卵泡是繼續(xù)生長發(fā)育還是閉鎖退化[3]。卵泡生長發(fā)育過程一般要經(jīng)歷促性腺激素不依賴期和依賴期2個時期。腔前卵泡的生長發(fā)育即原始卵泡生長的啟動和初始卵泡的生長并不完全依賴于促性腺激素，主要靠生長因子的調(diào)節(jié)。有腔卵泡的生長發(fā)育則完全依賴于促卵泡素（FSH）和促黃體素（LH）的協(xié)同作用，并且主要受促性腺激素內(nèi)分泌的調(diào)控[4-5]。因為幼齡羔羊卵巢內(nèi)分泌機(jī)制并未發(fā)育健全，且對促性腺激素刺激敏感。目前，利用外源促性腺素誘導(dǎo)4～8周齡羔羊卵泡超數(shù)發(fā)育，平均每只供體羔羊可獲得80～100枚卵母細(xì)胞[6-8]。盡管外源激素誘導(dǎo)羔羊卵泡超數(shù)發(fā)育獲得了豐富的卵源，但羔羊卵母細(xì)胞體外發(fā)育能力差、受胎率低仍然是普遍問題。

迄今為止，很多研究者致力于研究成年動物與幼齡動物卵母細(xì)胞在細(xì)胞形態(tài)[9-10]、基因表達(dá)代謝[11-12]和發(fā)育能力[13-14]方面的差異以及整個胚胎體外生產(chǎn)培養(yǎng)體系[15-16]。因此，提高供體羔羊選擇效率，優(yōu)化外源激素誘導(dǎo)卵泡超數(shù)發(fā)育的方案，增加供體羔羊卵母細(xì)胞的數(shù)量，同時提高羔羊卵母細(xì)胞質(zhì)量和體外發(fā)育能力，才能將羊JIVET技術(shù)更好地服務(wù)于羊產(chǎn)業(yè)。

2 影響JIVET 技術(shù)效率的內(nèi)因

2.1 供體羔羊的選擇 選擇合適的供體羔羊是羔羊誘導(dǎo)卵泡超數(shù)發(fā)育的重要環(huán)節(jié)之一[17]，激素敏感的供體羔羊在促性腺激素作用下會產(chǎn)生大量卵泡并產(chǎn)生具有較好發(fā)育能力的卵母細(xì)胞。年齡、體重、出生類型和對激素刺激的敏感性是影響JIVET技術(shù)穩(wěn)定性的內(nèi)在因素[18]。Ptak等[19-20]發(fā)現(xiàn)，羔羊卵巢對激素反應(yīng)的不穩(wěn)定性仍然是影響JIVET 技術(shù)效率的主要問題之一，大約20%的羔羊供體對激素處理沒有反應(yīng)或反應(yīng)差，而且卵母細(xì)胞發(fā)育到囊胚的發(fā)育率很大程度上依賴于供體羔羊，每只供體羔羊提供的胚胎數(shù)量在0～55枚[18]。Armstrong等[21]提出，理想的供體羔羊年齡在4～6周齡，該時期供體羔羊卵巢對激素的敏感性最好。O'Brien等[22]表明，激素誘導(dǎo)3～6周齡羔羊獲得卵母細(xì)胞的體外發(fā)育能力顯著高于16～24周齡未接受激素誘導(dǎo)的羔羊。此外，Morton等[23]觀察比較了激素刺激3～4周齡和6～7周齡的羔羊，發(fā)現(xiàn)羔羊子宮重量、卵巢重量、卵巢上卵泡數(shù)目以及卵母細(xì)胞數(shù)回收率在2組之間沒有顯著差異，而3～4周齡羔羊卵母細(xì)胞的囊胚發(fā)育率（20.4%）顯著低于6～7周齡羔羊（27.9%）。

供體羔羊激素處理前的體重常常作為選擇供體羔羊的指標(biāo)。Morton等[24]發(fā)現(xiàn)，供體羔羊激素處理前的生長速度和體重與羔羊卵巢增重和卵泡數(shù)目無關(guān)。然而，Valasi等[25]研究表明，如果誘導(dǎo)卵泡的激素刺激方案調(diào)整到適宜羔羊體重的劑量，那么羔羊獲取的卵母細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量都可以大大改善。

Kelly等[17]處理6～8周齡供體羔羊時發(fā)現(xiàn)，出生類型也會影響羔羊卵母細(xì)胞的發(fā)育能力。激素誘導(dǎo)雌性同胞羔羊獲得囊胚產(chǎn)出效率顯著高于雌雄同胞羔羊。然而，雌雄同胞羔羊的囊胚率（39.5%）與單胎羔羊（34.6%）或三胞胎羔羊（36.5%）沒有顯著差異。由此來看，雌性同胞作供體羔羊有助于提高JIVET的技術(shù)效率。

羔羊卵巢對于激素誘導(dǎo)卵泡超數(shù)發(fā)育刺激的反應(yīng)強(qiáng)弱存在個體差異。Morton 等[23]根據(jù)3～4周齡羔羊個體對激素刺激反應(yīng)的強(qiáng)弱分為低反應(yīng)（小于20個卵泡/卵巢）、中等反應(yīng)（20～50個卵泡/卵巢）以及高反應(yīng)（大于100個卵泡/卵巢）3個等級，且3～4周齡和6～7周齡羔羊中，對激素刺激反應(yīng)差的個體的卵母細(xì)胞利用率比中等反應(yīng)和高反應(yīng)個體高。但羔羊個體反應(yīng)能力差的個體囊胚率低[18-19]。此外，為了充分發(fā)揮優(yōu)秀供體羔羊的遺傳優(yōu)勢，采用重復(fù)的激素誘導(dǎo)刺激能夠提高單只羔羊提供的卵母細(xì)胞總數(shù)，然而供體羔羊超數(shù)誘導(dǎo)獲得卵母細(xì)胞的數(shù)量隨誘導(dǎo)處理次數(shù)的增加而逐漸減少。陳曉勇等[26]對6～8周齡羔羊首次激素誘導(dǎo)處理，時隔3周再次處理獲得羔羊卵母細(xì)胞的數(shù)量極顯著低于首次誘導(dǎo)。Valasi等[25]認(rèn)為，重復(fù)誘導(dǎo)卵泡超數(shù)發(fā)育獲得卵母細(xì)胞數(shù)量下降的主要原因是由于卵巢對激素刺激敏感性降低。

目前仍然沒有確切地選擇供體羔羊的特效辦法，但大多數(shù)研究者仍然認(rèn)為4～8周齡羔羊是誘導(dǎo)卵泡超數(shù)發(fā)育、獲得較好發(fā)育能力卵母細(xì)胞的理想供體。

2.2 羔羊卵母細(xì)胞的發(fā)育能力 卵母細(xì)胞生長發(fā)育的卵泡內(nèi)環(huán)境對卵母細(xì)胞獲得發(fā)育能力具有重要的影響，卵母細(xì)胞一旦脫離卵泡內(nèi)環(huán)境，其固有的發(fā)育潛能也隨之確定。

從表觀形態(tài)學(xué)角度看，與成年羊相比，羔羊誘導(dǎo)卵泡超數(shù)發(fā)育獲得的卵母細(xì)胞直徑小、顆粒細(xì)胞層少、脂滴多。從卵母細(xì)胞發(fā)育潛力角度看，卵母細(xì)胞直徑與卵母細(xì)胞發(fā)育能力息息相關(guān)。Anguita等[27]將羔羊卵母細(xì)胞按直徑分類（小于 110、110～125、125～135 μm 和大于135 μm），結(jié)果表明不同直徑卵母細(xì)胞的體外成熟率分別為0、20.7%、58%和78%，第8天的囊胚率分別為0、0、1.95%和12.5%。Leoni等[13]觀察比較了羔羊和成年羊體外成熟24 h的卵母細(xì)胞發(fā)育能力 ，結(jié)果發(fā)現(xiàn)羔羊卵母細(xì)胞的體外成熟率和受精率（分別為95.1%、66.73%）與成年羊（分別為96.7%、70.62%）沒有顯著差異，但與成年羊相比，羔羊卵母細(xì)胞的異常受精率高、卵裂率和囊胚率較低，但羔羊囊胚的形態(tài)、囊胚細(xì)胞總數(shù)和內(nèi)細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)比例與成年羊囊胚沒有顯著差異[12,30]。卵母細(xì)胞體外成熟歷經(jīng)一個多階段、復(fù)雜的調(diào)控過程，涉及細(xì)胞核成熟、細(xì)胞質(zhì)成熟以及顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞的相互作用。羔羊卵母細(xì)胞發(fā)育能力差很大程度上與卵母細(xì)胞細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)成熟不同步有關(guān)。Palmerini等[10]觀察發(fā)現(xiàn)，雖然大多數(shù)羔羊卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)24 h也能達(dá)到成年羊卵母細(xì)胞形態(tài)上的成熟狀態(tài)，但羔羊卵母細(xì)胞核成熟滯后以及細(xì)胞質(zhì)質(zhì)量差。Kochhar等[9]提出羔羊卵母細(xì)胞需要額外2 h體外成熟才能達(dá)到成年羊卵母細(xì)胞常規(guī)體外成熟24 h的成熟狀態(tài)。此外，羔羊體外胚胎也表現(xiàn)出發(fā)育遲緩的現(xiàn)象，如2-細(xì)胞[28]、4-細(xì)胞[18]、囊胚[28]。相反，Morton等[23]認(rèn)為，羔羊胚胎發(fā)育的速度與成年羊沒有差異，造成發(fā)育速度差異的原因可能是高劑量FSH處理、不同的培養(yǎng)系統(tǒng)或氧濃度的高低。因此，羔羊卵母細(xì)胞發(fā)育能力差在很大程度上與其超微結(jié)構(gòu)異常、胞質(zhì)缺陷、代謝紊亂等導(dǎo)致的核質(zhì)成熟不同步有關(guān)。目前，大多數(shù)研究者采用延長羔羊卵母細(xì)胞體外成熟時間，進(jìn)而提高卵母細(xì)胞的成熟質(zhì)量。從基因蛋白水平來看，羔羊卵母細(xì)胞全基因組甲基化水平和mRNA儲存量都顯著低于成年羊，甲基化水平的降低會影響某些印記基因的表達(dá)，mRNA儲存的貯存不足會影響核質(zhì)成熟[29-30]。卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞之間的聯(lián)接對于卵母細(xì)胞成熟期間營養(yǎng)物質(zhì)的輸送以及蛋白合成至關(guān)重要。Ledda等[31]研究發(fā)現(xiàn)，羔羊與成年羊卵母細(xì)胞成熟促進(jìn)因子（Mature Promoting Factor，MPF）的形式與活動水平相似，但羔羊卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)后的MPF合成量顯著低于成年羊，這可能與羔羊卵丘細(xì)胞和卵母細(xì)胞聯(lián)接發(fā)育不完善有關(guān)。此外，Leoni等[13]研究證明，與成年羊相比，羔羊卵母細(xì)胞具有較少的線粒體以及特殊的線粒體分布模式。因此，卵母細(xì)胞內(nèi)mRNA和蛋白質(zhì)的儲存以及線粒體活性和分布作為哺乳動物卵母細(xì)胞發(fā)育能力的決定因素，最終將影響胚胎的品質(zhì)。運用現(xiàn)代生物信息學(xué)技術(shù)分析預(yù)測調(diào)控卵母細(xì)胞發(fā)育能力的相關(guān)基因和關(guān)鍵通路結(jié)合體外生產(chǎn)試驗，對于正確理解羔羊卵母細(xì)胞體外核質(zhì)成熟機(jī)制以及解釋羔羊卵母細(xì)胞發(fā)育能力下降的原因具有重要意義。

3 影響JIVET 技術(shù)效率的外因

3.1 供體羔羊的營養(yǎng) 營養(yǎng)不良會影響成年母羊超數(shù)排卵的數(shù)量和質(zhì)量[32]。幼齡羔羊的營養(yǎng)依賴于母體。Kelly等[33]研究發(fā)現(xiàn)，妊娠期間母羊營養(yǎng)水平的差異直接影響出生后羔羊誘導(dǎo)卵泡超數(shù)發(fā)育的效果、卵母細(xì)胞質(zhì)量以及囊胚發(fā)育率。妊娠期間營養(yǎng)水平高，羔羊誘導(dǎo)卵泡超數(shù)發(fā)育效果好，胚胎產(chǎn)出率相對也高。Abecia等[34]報道，孕早期營養(yǎng)不良不僅會引起母羊繁殖力和多產(chǎn)性能下降，而且可導(dǎo)致JIVET羔羊誘導(dǎo)卵泡超數(shù)發(fā)育獲得卵母細(xì)胞數(shù)目的下降。因此，供體羔羊的營養(yǎng)水平與健康狀態(tài)一定程度上會影響JIVET技術(shù)效率。

3.2 超數(shù)誘導(dǎo)卵泡發(fā)育的季節(jié) 成年母羊的超數(shù)排卵受繁殖季節(jié)的影響，非繁殖季節(jié)超排效率較低，繁殖季節(jié)超排效率較高。羔羊由于體內(nèi)的生殖軸并未發(fā)育健全，但對激素刺激反應(yīng)較為敏感，誘導(dǎo)卵泡超數(shù)發(fā)育不受季節(jié)限制。但Gou等[7]用激素誘導(dǎo)處理4～8周齡羔羊，發(fā)現(xiàn)夏季和秋季的卵泡生長發(fā)育顯著優(yōu)于冬季，而且卵母細(xì)胞的發(fā)育能力在這3個季節(jié)之間存在極顯著差異。季節(jié)對于JIVET技術(shù)效率的影響仍需進(jìn)一步研究驗證。

3.3 激素誘導(dǎo)處理方案的優(yōu)化 激素處理誘導(dǎo)卵泡超數(shù)發(fā)育，不僅誘導(dǎo)增加卵泡的生長，引起卵泡細(xì)胞和卵泡內(nèi)環(huán)境的生化變化，而且激活了卵母細(xì)胞內(nèi)的生物合成過程。另外，激素還可以刺激顆粒細(xì)胞中促性腺素受體的增加[35]。

迄今，關(guān)于優(yōu)化羔羊誘導(dǎo)卵泡超數(shù)發(fā)育的方案已經(jīng)進(jìn)行了大量的研究?；诔赡昴秆虺欧桨?，研究者開展了羔羊誘導(dǎo)卵泡超數(shù)發(fā)育方案的探究。Ledda等[36]采用孕酮結(jié)合促性腺激素，選擇30～40日齡的羔羊進(jìn)行激素誘導(dǎo)處理，給羔羊陰道埋植海綿栓（體積是成年羊埋栓體積的1/6）6 d，撤栓前36 h一次性分別注射120 IU促性腺激素釋放激素（GnRH）和400 IU孕馬血清促性腺激素（PMSG），撤栓24 h后采卵，平均每只羔羊獲得86.2枚卵母細(xì)胞，成熟率為77.9%。Ptak等[18]采用類似的處理方法給1月齡羔羊陰道埋植孕酮栓8 d，從第5、6、7天每天早、晚各注射27 mg FSH，第8天撤栓，平均每只羔羊獲得約29枚卵母細(xì)胞，成熟率為49.8%，囊胚率為22.9%。Kelly等[6]采用促性腺素法，一次性肌肉注射l60 mg FSH和間隔12 h等量注射4×40 mg FSH，最后一次FSH注射的同時注射400 IU馬絨毛膜促性腺激素（eCG），發(fā)現(xiàn)分4次等量注射FSH效果優(yōu)于一次性注射，平均每只供體羔羊獲得88枚卵母細(xì)胞，卵裂率為77.5%。也有研究發(fā)現(xiàn)，羔羊卵母細(xì)胞收集之前用GnRH處理，可促進(jìn)卵母細(xì)胞在體內(nèi)的成熟發(fā)育，但不影響卵母細(xì)胞的收集數(shù)量、形態(tài)以及囊胚發(fā)育率[37]。目前，大多數(shù)研究者采用等量4×40 mg FSH或者6×40 mg FSH處理方案。

總之，激素刺激增加收集卵母細(xì)胞的數(shù)量以及提高卵母細(xì)胞發(fā)育能力，但激素誘導(dǎo)羔羊卵泡超數(shù)發(fā)育的最佳方案以及激素誘導(dǎo)處理對卵母細(xì)胞發(fā)育能力的機(jī)制尚未明確。

3.4 羔羊體外胚胎的培養(yǎng)體系 目前，羔羊胚胎體外生產(chǎn)所涉及的卵母細(xì)胞體外成熟、體外受精、受精卵體外培養(yǎng)等過程的培養(yǎng)體系均基于成年羊體外胚胎生產(chǎn)的培養(yǎng)體系。為提高羔羊卵母細(xì)胞和胚胎的體外發(fā)育能力，許多研究者致力于改善優(yōu)化體外胚胎培養(yǎng)體系。Bai等[15]在體外成熟液中添加2-巰基乙醇和半胱氨酸并沒有提高核成熟或微管構(gòu)型，但改善了精子解聚并提高了囊胚率。L-左旋肉堿及其衍生物乙?；?L-肉堿可以將長鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運到線粒體中，通過β-氧化產(chǎn)生ATP向細(xì)胞供應(yīng)能量[38]。Reader等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在體外成熟液中添加乙?；?L-肉堿可以用于增加羔羊卵母細(xì)胞體外胚胎的囊胚率，但對線粒體的體積、數(shù)量以及線粒體DNA的拷貝數(shù)沒有影響。此外，Catalá等[39]發(fā)現(xiàn)，亮甲酚藍(lán)陽性羔羊卵母細(xì)胞的發(fā)育能力顯著高于亮甲酚藍(lán)陰性羔羊卵母細(xì)胞；Wang等[40]提出，在體外成熟之前，用13 μmol/L亮甲酚藍(lán)染色羔羊卵母細(xì)胞可用于選擇有發(fā)育能力的羔羊卵母細(xì)胞。此外，他們建議使用米力農(nóng)（Milrinone）可以促進(jìn)羔羊胚胎的體外發(fā)育能力。

目前，盡管在體外培養(yǎng)基中添加抗氧化劑、促生長因子以及抗凋亡劑均能有效提高受精率和胚胎發(fā)育效率，但優(yōu)化改善羔羊卵母細(xì)胞體外成熟和胚胎體外培養(yǎng)體系仍有待提高。

4 小 結(jié)

目前，國內(nèi)外JIVET技術(shù)領(lǐng)域雖然取得了初步進(jìn)展，也獲得了一定的推廣應(yīng)用，但涉及羔羊卵子發(fā)生調(diào)控和卵泡發(fā)育機(jī)理相關(guān)機(jī)制的研究進(jìn)展緩慢。隨著基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)和胚胎生物技術(shù)研究的迅猛發(fā)展，從各個角度深度解析羔羊卵母細(xì)胞與成年羊卵母細(xì)胞發(fā)育、成熟和代謝的差異，優(yōu)化JIVET技術(shù)激素處理方案和體外培養(yǎng)體系，才能更好地發(fā)揮JIVET技術(shù)在羊繁育體系中的作用。

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