噬菌體對(duì)細(xì)菌感染的治療作用及應(yīng)用研究

唐 陶,陳冰冰,龍航宇,林瑞慶

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,廣東 廣州 510642)

細(xì)菌性感染是最常見(jiàn)的感染性疾病,若未及時(shí)進(jìn)行有效的治療,很有可能造成機(jī)體死亡。目前,抗生素是人醫(yī)與獸醫(yī)臨床上最重要和使用最為廣泛的抗感染藥物,解決了很多人類疾病和畜牧業(yè)生產(chǎn)中存在的問(wèn)題。然而,抗生素在使用中存在著較多濫用的情況,帶來(lái)了一系列的問(wèn)題,如細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性、動(dòng)物抗病力下降、免疫抑制、畜產(chǎn)品藥物殘留、環(huán)境污染等,從而影響人類安全、危害養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展以及破壞生態(tài)環(huán)境等。因此,科學(xué)家們一直在尋找新的抗菌制劑,而噬菌體以其特異性強(qiáng)、毒副作用小等特點(diǎn)成為新的研究熱點(diǎn)。

1　噬菌體的溶菌機(jī)制

噬菌體是感染細(xì)菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒總稱,廣泛分布于自然界,因其中一部分能引起宿主菌裂解,故被稱之為噬菌體。能使宿主細(xì)菌裂解死亡的噬菌體稱為烈性噬菌體;還有一些噬菌體感染細(xì)菌后,并不使細(xì)菌死亡,這種為溫和噬菌體。烈性噬菌體溶菌機(jī)制主要有兩種,一種主要是缺乏溶壁酶的小基因組噬菌體使用的方式,它會(huì)利用多肽在不同階段抑制宿主菌的胞壁質(zhì)合成酶從而抑制宿主菌細(xì)胞壁的合成;另一種主要利用的是穿孔素-內(nèi)溶素系統(tǒng),穿孔素在細(xì)胞膜上打孔,使得內(nèi)溶素可跨過(guò)孔徑接觸細(xì)胞壁從而發(fā)揮溶解作用,這兩種機(jī)制均能通過(guò)破壞宿主菌的細(xì)胞壁達(dá)到溶菌的目的[1]。烈性噬菌體在感染敏感菌后,可以在菌內(nèi)進(jìn)行指數(shù)型增殖,之后裂解宿主菌并釋放子代噬菌體,繼而再侵染其他細(xì)菌,因此烈性噬菌體又被稱為毒性噬菌體。

2　噬菌體治療細(xì)菌性疾病的優(yōu)勢(shì)和局限性

2.1優(yōu)勢(shì) 噬菌體最為突出的優(yōu)點(diǎn)是它具有明確的抑菌譜,大多數(shù)噬菌體只會(huì)對(duì)特定種屬病原菌起到殺傷作用,對(duì)其他細(xì)菌及生物細(xì)胞不會(huì)有傷害;噬菌體的作用機(jī)制與抗生素不同,對(duì)很多具有抗生素抗性的細(xì)菌仍能起到裂解作用[2];噬菌體具有指數(shù)增殖能力,理論上使用噬菌體治療只需要一次給藥;還有重要一點(diǎn),噬菌體是宿主依賴性的,只在細(xì)菌感染部位發(fā)生作用,它會(huì)隨著宿主菌的清除而死亡,不會(huì)殘留在體內(nèi)[3]。

2.2局限性 噬菌體的裂解譜窄,通常只作用于細(xì)菌的某個(gè)屬、種,有的甚至只作用于某種下的幾株菌[4];不同噬菌體制劑使用的最佳條件不相同,需要較長(zhǎng)的時(shí)間對(duì)使用方案進(jìn)行探索研究,而目前缺乏科學(xué)有效的方法評(píng)價(jià)噬菌體的治療效果[5];噬菌體對(duì)于機(jī)體而言屬于外來(lái)異物,具有抗原性,會(huì)刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng),不利于噬菌體在體內(nèi)擴(kuò)增從而發(fā)揮更好的治療作用[6];噬菌體雖作用于細(xì)菌,理論上對(duì)機(jī)體無(wú)害,但它本質(zhì)上是一種病毒,可能會(huì)釋放一些毒力因子[6],還可能會(huì)出現(xiàn)突變對(duì)機(jī)體造成危害。

3　噬菌體治療細(xì)菌感染的應(yīng)用

3.1發(fā)現(xiàn) 噬菌體于20世紀(jì)20年代被發(fā)現(xiàn),雖然對(duì)其作用機(jī)理還不了解,但東歐和前蘇聯(lián)在那時(shí)便已開(kāi)始嘗試用噬菌體對(duì)細(xì)菌性疾病進(jìn)行治療,實(shí)踐結(jié)果初步證實(shí),噬菌體能夠有效治療細(xì)菌性疾病[7]。

3.3發(fā)展 隨著抗生素廣泛、大量的應(yīng)用,其弊端也日益顯露,最引人關(guān)注的是抗生素耐藥菌的產(chǎn)生,一些原來(lái)已經(jīng)控制的疾病再次成為難題。在畜牧養(yǎng)殖方面,一些抗生素會(huì)影響疫苗的免疫效果,造成免疫失敗,此外獸藥殘留問(wèn)題也威脅著人類的身體健康與生存環(huán)境[8]?，F(xiàn)如今人們?cè)桨l(fā)重視食品安全,在很多國(guó)家和地區(qū)已在養(yǎng)殖過(guò)程中禁用某些抗生素,國(guó)際上“綠色貿(mào)易壁壘”正在逐漸興起,這也極大影響了我國(guó)畜產(chǎn)品的出口創(chuàng)匯。

面對(duì)這樣的挑戰(zhàn),科學(xué)家們開(kāi)始嘗試開(kāi)發(fā)研制新型獸藥抗生素的替代品,而噬菌體以其特異性強(qiáng)、毒副作用小等特點(diǎn),在經(jīng)歷了半個(gè)世紀(jì)的淡忘后再一次引起人們的注意,這為防治畜牧生產(chǎn)中出現(xiàn)的耐藥菌感染提供了一個(gè)新思路,有望成為理想的抗菌藥和新型生物殺菌制劑[9]。

在1996年,傳染性疾病的權(quán)威及諾貝爾獎(jiǎng)獲得者Lederberg博士在PNAS的評(píng)論中指出:因耐藥菌出現(xiàn),抗生素治療不再像以前那樣有效,應(yīng)該重視噬菌體作為抗菌治療生物制劑的研究。于1998年召開(kāi)的兩年一度的Ever-green噬菌體國(guó)際會(huì)議,第一次吸引了數(shù)家生物技術(shù)大公司的注意并派員參加。大會(huì)主辦人Kutter博士指出:對(duì)于噬菌體用于治療,人們存在著根深蒂固的偏見(jiàn),然而現(xiàn)有大量的證據(jù)提示噬菌體確實(shí)是一個(gè)有效的治療途徑。在2004年美國(guó)的ASM會(huì)議也以“新的噬菌體生物學(xué)”為主題,這次大會(huì)又稱為“噬菌體峰會(huì)”。2011年,英國(guó)牛津大學(xué)則召開(kāi)了第一屆牛津國(guó)際噬菌體大會(huì)。在我國(guó),2014年江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院召開(kāi)了第一屆噬菌體國(guó)際學(xué)術(shù)研討會(huì),第二屆于2016年在武漢召開(kāi),而第三屆大會(huì)也正在籌備中。

前期的大量臨床實(shí)踐和實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明噬菌體療法安全有效。在畜牧業(yè)方面,科學(xué)家們也進(jìn)行了大量的研究,主要有以下兩個(gè)目的,一是降低細(xì)菌性傳染病對(duì)動(dòng)物健康和生產(chǎn)的影響;二是通過(guò)減少動(dòng)物疾病從而控制人獸共患病。

大腸桿菌和沙門菌等病原體引起的細(xì)菌性疾病一直困擾著養(yǎng)豬業(yè)。Easwa-ran等以大腸桿菌Sw1作為宿主,從豬糞中分離出裂解性噬菌體EcSw,試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該噬菌體在4℃到37℃、pH值5到pH值9時(shí)都可以穩(wěn)定存在,穩(wěn)定性在pH值3和pH值11時(shí)僅分別降低6%和33%。再將使用了EcSw處理的大腸桿菌Sw1與未處理的大腸桿菌Sw1的生長(zhǎng)曲線進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)EcSw可以顯著抑制大腸桿菌Sw1的生長(zhǎng)[10]。Albino等分離了屬于波多病毒科的沙門菌噬菌體,其在體外試驗(yàn)中,107PFU/mL的噬菌體即可顯著抑制(P＜0.05)沙門菌,在豬接種106CFU/mL的體內(nèi)試驗(yàn)中,糞便中沙門菌檢出率從93.3%(28/30)減少到56.6%(17/30)。這些結(jié)果表明,應(yīng)用的噬菌體能夠減少豬腸道內(nèi)沙門菌的定居[11]。還有研究發(fā)現(xiàn),雖然噬菌體和益生菌都能促進(jìn)豬的生長(zhǎng),但在試驗(yàn)中噬菌體顯示出更好的效果[12-13]。

隨著養(yǎng)雞業(yè)不斷地發(fā)展,尤其是集約化飼養(yǎng),雞的大腸桿菌病和沙門菌病也在一些雞場(chǎng)中不同程度發(fā)生。國(guó)外研究者Gohary等研究發(fā)現(xiàn),將大腸桿菌噬菌體噴灑在雞舍中可以降低雞群發(fā)生大腸桿菌病的幾率,肉雞死亡率顯著下降[14]。Kim等還將腸炎沙門菌噬菌體加入肉雞飼料,發(fā)現(xiàn)可以促進(jìn)肉雞生長(zhǎng)并降低宿主病原菌的數(shù)量從而降低腸炎沙門菌造成的死亡率,試驗(yàn)沒(méi)有觀察到消極影響[15]。與家畜相比,禽類具有短消化道以及肌胃特有的物理消化方式,這些特點(diǎn)可能使其體內(nèi)的噬菌體活性不易受到影響,因此在應(yīng)用方面更具優(yōu)勢(shì)[16]。

奶牛乳腺炎是現(xiàn)今奶牛養(yǎng)殖業(yè)中極易暴發(fā)的一種細(xì)菌感染性疾病,嚴(yán)重影響奶牛的產(chǎn)奶量和牛奶的品質(zhì)和安全,是降低奶牛業(yè)經(jīng)濟(jì)效益的主要因素之一。能夠引起奶牛乳腺炎的微生物種類眾多,金黃色葡萄球菌是主要的病原。巴西研究者從來(lái)自65個(gè)不同農(nóng)場(chǎng)的250個(gè)牛奶樣本中隨機(jī)選擇了20株分離到的金黃色葡萄球菌進(jìn)行試驗(yàn),分別有60%、65%的分離株表現(xiàn)出氨芐青霉素、青霉素抗性。研究者從污水中分離出了10株肌尾噬菌體科的金黃色葡萄球菌烈性噬菌體,發(fā)現(xiàn)有8株噬菌體可以裂解至少95%的金黃色葡萄球菌分離菌。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),其中7株噬菌體在90℃高溫時(shí)仍可保持105PFU/mL以上的病毒滴度[17]。韓國(guó)科學(xué)家也成功地從奶牛場(chǎng)附近的污水中分離出了一株針對(duì)金黃色葡萄球菌的裂性噬菌體,預(yù)期這株噬菌體將可以有效地用于預(yù)防和治療由金黃色葡萄球菌感染引起的乳腺炎[18]。格魯吉亞已經(jīng)將噬菌體制成藥劑用于臨床乳腺炎病畜的治療,而在我國(guó)還處于研發(fā)階段。

在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面,細(xì)菌性弧菌病嚴(yán)重危害多種淡水和海水養(yǎng)殖魚(yú)類,我國(guó)南方養(yǎng)殖的鰻鱺和北方養(yǎng)殖的虹鱒都深受其害,溶藻弧菌是導(dǎo)致弧菌病的主要原因之一。在印度進(jìn)行的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)了一種噬菌體的溶菌酶可以抑制溶藻弧菌生物膜的形成和細(xì)菌的增長(zhǎng),并可以有效地溶解其他30%的弧菌屬細(xì)菌。通過(guò)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),這種噬菌體在不同的pH值下具有廣泛宿主譜、較高的敏感性和熱穩(wěn)定性的特點(diǎn),可見(jiàn)利用噬菌體來(lái)控制溶藻弧菌很有前景[9]。

此外,對(duì)一些公共衛(wèi)生領(lǐng)域危害較大的細(xì)菌性感染,試驗(yàn)證明,噬菌體療法也有著良好的治療效果。如噬菌體可以有效抑制霍亂弧菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌、彎曲菌、幽門螺桿菌等細(xì)菌[18-26]。

3.4應(yīng)用 近年來(lái),與噬菌體相關(guān)的研究領(lǐng)域越發(fā)廣泛,噬菌體在生物傳感器、醫(yī)藥、食品保鮮、廢水處理等方面都取得了一定的進(jìn)展[27]。目前國(guó)外已經(jīng)有噬菌體類殺菌劑獲得生產(chǎn)上市的許可,美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)2006年批準(zhǔn)ListShieldTM噬菌體產(chǎn)品可作為食品添加劑,應(yīng)用于即食食品和禽肉制品中控制單核細(xì)胞增生李斯特菌的污染,這是美國(guó)第一次批準(zhǔn)將噬菌體作為食品添加劑;2007年,FDA又批準(zhǔn)了另外1株李斯特菌的噬菌體可以作為添加劑添加到奶酪等其他食品中;2011年,FDA批準(zhǔn)了EcoShieldTM產(chǎn)品可應(yīng)用于肉制品中降低大腸桿菌O157:H7的污染。2013年由美國(guó)Intralytix公司研發(fā)的針對(duì)沙門菌的噬菌體制劑SalmoFreshTM被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)認(rèn)定為公認(rèn)安全級(jí)產(chǎn)品(Generally Regarded As Safe,GRAS),并獲批準(zhǔn)上市。在我國(guó),2007年1月由征宇公司推出了治療仔豬黃痢與白痢的“生物止痢王”,它的主要成分為蛭弧菌及混合噬菌體等,主要是通過(guò)消滅動(dòng)物體內(nèi)的大腸桿菌、沙門菌等有害菌達(dá)到防治仔豬黃白痢的目的。2017年3月中國(guó)南京菲吉樂(lè)科生物科技有限公司宣布,全球首款旨在防治蝦早死綜合征的噬菌體產(chǎn)品“樂(lè)蝦”上市。噬菌體療法治療多重耐藥的病原體很有前景,幾個(gè)噬菌體產(chǎn)品正在申請(qǐng)專利和開(kāi)發(fā)成商業(yè)生物防治劑[28-29]。隨著分子生物學(xué)及噬菌體技術(shù)的發(fā)展,今后會(huì)出現(xiàn)越來(lái)越多用于控制的各個(gè)領(lǐng)域病原菌的噬菌體商品。

4　展望

在尋找抗生素良好替代品的過(guò)程中,科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)噬菌體療法為我們治療細(xì)菌性疾病提供了新的思路。對(duì)于耐藥菌感染,可以篩選其噬菌體從而進(jìn)行治療,也可以嘗試將抗生素同噬菌體聯(lián)合使用,增強(qiáng)療效并部分減少抗生素的使用;利用噬菌體特異性強(qiáng)的特點(diǎn),應(yīng)用其攜帶藥物可對(duì)細(xì)菌進(jìn)行更精準(zhǔn)的殺傷;還可利用基因工程技術(shù)對(duì)天然噬菌體進(jìn)行基因改造,如時(shí)下熱門的CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)、單突變等,改變和增加宿主范圍;此外,依照噬菌體的作用機(jī)制及其釋放的裂解酶可以人工設(shè)計(jì)新的更加方便使用的藥物和疫苗,合成既有良好殺菌或預(yù)防效果又不易使細(xì)菌產(chǎn)生抗性的新型化合物,從而迎接全球耐藥菌感染不斷攀升對(duì)畜牧業(yè)以及人類健康的挑戰(zhàn)。

參考文獻(xiàn):