死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白對(duì)卵巢癌細(xì)胞周期及化療影響的研究

倫巍巍,王俊耐

(鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 450015)

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，化療耐藥一直是卵巢癌治療中的一大難題[1]，研究其耐藥機(jī)制是解決這一難題的關(guān)鍵。死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白(death domain associate protein，Daxx)于1997年在Cell雜志上首次以Fas死亡相關(guān)蛋白發(fā)表[2]，但其對(duì)細(xì)胞凋亡的影響一直備受爭(zhēng)議[3-4]。有學(xué)者提出Daxx參與Fas凋亡通路的調(diào)控而發(fā)揮促細(xì)胞凋亡的作用；而有大量研究證明，在人的正常細(xì)胞或者結(jié)腸癌細(xì)胞中，Daxx通過抑制凋亡基因的轉(zhuǎn)錄而最終發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡的作用[5]。已有研究表明Daxx基因在卵巢癌中普遍高表達(dá)[6]。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟诿鞔_Daxx對(duì)卵巢癌化療的影響，從而進(jìn)一步明確其耐藥機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 化療藥多柔比星購(gòu)自美國(guó)Sigma公司(貨號(hào)CAS25316-40-9)，實(shí)驗(yàn)所用卵巢癌細(xì)胞株C13k購(gòu)自ATCC細(xì)胞庫(kù)。抗體cyclinB1及抗體cleaved-parp夠自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司(貨號(hào)分別為55004-1-AP、13371-1-AP)，抗體Daxx及抗體actin購(gòu)自博士德生物工程有限公司(貨號(hào)分別為PB0580、BM0005)。流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司(型號(hào)ABI17500)。

1.2方法

1.2.1分組 卵巢癌耐藥細(xì)胞C13k轉(zhuǎn)染后分為陰性對(duì)照組(NC組)和下調(diào)Daxx組(siDaxx組)。

1.2.2流式儀對(duì)細(xì)胞周期的檢測(cè) C13k細(xì)胞用胰酶消化后接種于12孔板，接種第2天加化療藥多柔比星處理細(xì)胞。上述兩組細(xì)胞藥物濃度梯度均為0、0.15、0.30、0.60 μmol/L。培養(yǎng)基均為1.5 mL。藥物作用24 h后，胰酶消化細(xì)胞，1 200 r/min離心5 min，細(xì)胞用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗1遍，用70%冰乙醇固定細(xì)胞，于-20 ℃過夜。第2天從-20 ℃取出細(xì)胞，1 200 r/min離心5 min，再用預(yù)冷的PBS洗1遍，用10倍濃度的碘化丙啶(PI)及100倍濃度的RNA酶(RNAase)各300 μL避光染色細(xì)胞30 min，轉(zhuǎn)流式管上機(jī)分析細(xì)胞周期變化。

1.2.3流式儀對(duì)細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 0、0.30 μmol/L的多柔比星處理上述兩組細(xì)胞24 h后，胰酶消化兩組細(xì)胞，800 r/min離心5 min，PBS輕柔漂洗1次，800 r/min離心5 min收集細(xì)胞；向收集管中加入 500 μL 結(jié)合緩沖液(Binding Buffer)，輕輕搖晃，使細(xì)胞懸?。幌蛎總€(gè)收集管中加入5 μL的異硫氰酸熒光素標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V(Annexin V-FITC)，輕輕混勻，然后再加入5 μL PI，搖晃，使其充分混勻；于室溫下避光放置，使細(xì)胞和上述試劑充分反應(yīng) 5～15 min；避光，置于4 ℃，于1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.4Western blot C13k細(xì)胞接種于12孔板，第2天用0.30 μmol/L藥物梯度處理細(xì)胞48 h后。胰酶消化細(xì)胞，1 500 r/min離心5 min，再用PBS洗滌細(xì)胞1次。用RIPA裂解細(xì)胞提取蛋白，30 μg上樣量行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)電泳。牛奶封閉1 h，封一抗cyclinB1、cleaved-parp及內(nèi)參蛋白GAPDH，4 ℃過夜；第2天封抗兔及抗鼠二抗，TBST洗滌2 h后，曝光儀曝光。

2 結(jié) 果

2.1檢測(cè)siRNA的干擾效應(yīng) 向C13k細(xì)胞中轉(zhuǎn)入siRNA后，在未經(jīng)化療藥處理和經(jīng)化療藥處理后的Daxx表達(dá)水平均明顯降低，見圖1。

2.2流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩組細(xì)胞周期的變化 兩組細(xì)胞的周期對(duì)比，在多柔比星0.30 μmol/L時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，NC組和siDaxx組在不加藥時(shí)，均阻滯于G1期；加多柔比星化療藥后，相比與NC組，siDaxx組的G2/M期細(xì)胞百分比明顯增高，見表1。

圖1 未加及加后，siRNA的干擾效應(yīng)

表1 不同濃度的多柔比星作用下NC組及siDaxx組各細(xì)胞周期所占比例分析

圖2 未加與加0.30 μmol/L化療藥處理后兩組的細(xì)胞凋亡率比較

2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩組細(xì)胞的凋亡比較 不加藥時(shí)兩組凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.122)，多柔比星(0.3 μmol/L)作用時(shí)NC組的凋亡率高于siDaxx組(P=0.031)，見圖2。

2.4Western blot檢測(cè)cyclinB1、cleaved-parp的表達(dá) siDaxx組細(xì)胞在化療藥多柔比星作用后，cyclinB1表達(dá)水平降低，細(xì)胞阻滯于G2/M期，受損的細(xì)胞DAN發(fā)生損傷修復(fù)，細(xì)胞凋亡率降低；NC組受損傷的DNA跳過G2/M期檢測(cè)位點(diǎn)，損傷沒有得到修復(fù)，細(xì)胞凋亡率高，見圖3。

圖3 化療藥處理后cyclineB1及cleaved-parp在兩組的表達(dá)

3 討 論

很多化療藥發(fā)生耐藥是由于腫瘤細(xì)胞DNA受損后，通過某些機(jī)制使細(xì)胞周期停滯，使受損的細(xì)胞DNA在停滯期得到有效的損傷修復(fù)[7]，從而使癌細(xì)胞逃過化療致DNA損傷的殺傷作用。

Daxx作為一種保守的多功能蛋白，通過蛋白與蛋白的相互作用或者轉(zhuǎn)錄調(diào)控下游基因的表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞凋亡關(guān)系密切[8-9]。有研究發(fā)現(xiàn)Daxx與p53結(jié)合后通過抑制p53對(duì)下游基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，使周期相關(guān)蛋白(如p21、CDKs等)表達(dá)下調(diào)，受損的DAN不能修復(fù)而使細(xì)胞發(fā)生凋亡[10]；在人結(jié)腸癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞中，Daxx通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控有絲分裂檢測(cè)位點(diǎn)的表達(dá)，參與癌細(xì)胞凋亡[11];在卵巢癌中，過表達(dá)Daxx能夠促進(jìn)卵巢癌的進(jìn)展，使癌細(xì)胞發(fā)生化療耐藥，這一機(jī)制可能與Daxx轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)周期蛋白表達(dá)，使細(xì)胞周期停滯、損傷的DNA得以修復(fù)，從而使癌細(xì)胞逃過化療的殺傷產(chǎn)生耐藥有關(guān)[12]。本實(shí)驗(yàn)中，在卵巢癌耐藥細(xì)胞株C13k中，利用siRNA降低Daxx蛋白的表達(dá)后，能使C13k細(xì)胞對(duì)多柔比星發(fā)生化療耐藥。進(jìn)一步對(duì)這一現(xiàn)象的機(jī)制進(jìn)行探討，筆者發(fā)現(xiàn)在0.30 μmol/L的多柔比星作用時(shí)，siDaxx組細(xì)胞中G2/M期調(diào)控蛋白cyclineB1表達(dá)水平下降，使C13k細(xì)胞在G2/M期發(fā)生周期阻滯，化療藥作用下?lián)p傷的DNA在這一時(shí)期得到有效的損傷修復(fù)，DNA損傷標(biāo)志性蛋白cleaved-parp表達(dá)水平下降，從而對(duì)多柔比星的耐藥性增加，而這一現(xiàn)象與之前的研究[12]相反。在本實(shí)驗(yàn)中，增加多柔比星的藥物濃度至0.60 μmol/L時(shí)，siDaxx組的G2/M期的阻滯作用消失，G1期細(xì)胞增加，細(xì)胞周期有繼續(xù)進(jìn)展的趨勢(shì)。

Daxx作為一種多功能蛋白參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控及Fas信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并作為細(xì)胞核蛋白參與染色體的穩(wěn)定作用等[13-15]。本實(shí)驗(yàn)中在卵巢癌耐藥細(xì)胞系C13k細(xì)胞中下調(diào)Daxx表達(dá)后，細(xì)胞對(duì)多柔比星的耐藥性增加。尋找使Daxx表達(dá)上調(diào)的方式，可能使耐藥細(xì)胞株C13k對(duì)多柔比星化療增敏，這為卵巢癌化療耐藥的機(jī)制研究及臨床治療提供了一個(gè)新的靶點(diǎn)。

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