陳家明，馬詩經(jīng)，焦春偉，張命龍，陳天洪，謝意珍，2**，李崇，2，李良秋，2，楊偉君

（1.廣東粵微食用菌技術(shù)有限公司，廣東廣州510663；2.廣東省微生物研究所，廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點實驗室，省部共建華南應(yīng)用微生物國家重點實驗室，廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實驗室，廣東廣州510070）

冬蟲夏草[Ophiocordyceps sinensis(Berk.)G.H.Sung et al.]是珍貴的蟲生真菌[1]，具有良好的補肺益腎、抗氧化[2]、抗腫瘤[3]、調(diào)節(jié)免疫[4]、抗衰老、降血糖等功效[5]。但存在野生資源匱乏，人工培育尚存技術(shù)困難等問題。加之過度采挖，目前野生的冬蟲夏草已處于瀕危狀態(tài)[6]。中國被毛孢（Hirsutella sinensis）已被證實為冬蟲夏草的無性型[7-8]，含有核苷、多糖和甾醇等與冬蟲夏草類似的有效成分，具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤等作用[9]，成為冬蟲夏草最佳的替代品。目前，國內(nèi)中國被毛孢以液體發(fā)酵為主，但液體發(fā)酵對設(shè)備要求高、工藝較復(fù)雜、成本高以及發(fā)酵過程易污染。而固體發(fā)酵具有原料低廉，設(shè)備和工藝簡單等優(yōu)點，部分研究者對中國被毛孢進(jìn)行固體發(fā)酵研究，并取得一定的成果。

研究表明，添加不同類型的碳源、氮源對中國被毛孢發(fā)酵過程的生物量和生長情況影響較大[10-11]，其中以葡萄糖、蔗糖為碳源，蠶蛹粉、酵母粉、蛋白胨等較有利于中國被毛孢的生長[12]。目前，文獻(xiàn)報道以菌絲體生物量為指標(biāo)，對中國被毛孢固體、液體發(fā)酵工藝、參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化研究為主[13]，以功能成分如麥角甾醇[14]、核苷類物質(zhì)[15]等作為指標(biāo)的研究相對較少。此外，由于核酸在細(xì)胞內(nèi)的含量較穩(wěn)定，也成為測定生物量的評價指標(biāo)之一，魏培蓮等[16]發(fā)現(xiàn)以細(xì)胞中的核酸成分較麥角固醇、氨基葡萄糖量更適合作為土曲霉固態(tài)發(fā)酵物中生物量測定指標(biāo)。余昌霞等[17]亦證明了以核酸（DNA）含量測定金針菇菌絲體生物量的方法可行。

本文在水解乳蛋白為適宜氮源、葡萄糖為適宜碳源的基礎(chǔ)上，添加大米、小麥作為碳源，玉米粉、黃豆粉作為氮源，并以菌絲體核酸含量作為間接指標(biāo)測定菌絲體生物量，確定固體發(fā)酵的最佳配方并測定發(fā)酵產(chǎn)物的腺苷含量，優(yōu)化中國被毛孢固體發(fā)酵工藝，以期為中國被毛胞固體發(fā)酵的產(chǎn)業(yè)化提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

中國被毛孢菌株（編號：3.14243），由中國科學(xué)院微生物研究所鑒定并提供。

1.1.2 主要儀器與試劑

HPG-280HX人工氣候培養(yǎng)箱，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；HZQ-QG旋轉(zhuǎn)式空氣恒溫振蕩器，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；GUJS 10 L小型發(fā)酵罐，鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)有限責(zé)任公司；UV1750紫外分光光度計，日本島津公司；Agilent 1200高效液相色譜儀，美國安捷倫科技公司等。

腺苷標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%），中國食品藥品檢定研究所；中國被毛孢純菌絲體粉購于浙江萬豐企業(yè)集團(tuán)制藥有限公司。

1.2 方法

1.2.1 斜面培養(yǎng)

斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮）200 g、葡萄糖20 g、胰蛋白胨2 g、水解乳蛋白2 g，KH2PO41 g、MgSO41 g、瓊脂20 g，水1 000 mL，pH 6.5，121℃滅菌30 min。

制備方法：取中國被毛孢保藏菌種，18℃活化培養(yǎng)后轉(zhuǎn)接至試管斜面上，長成菌落直徑約2 cm的斜面種后置4℃冰箱保存，備用。

1.2.2 液體發(fā)酵培養(yǎng)

（1）液體發(fā)酵培養(yǎng)基

根據(jù)中國被毛孢液體發(fā)酵經(jīng)驗配方，設(shè)置4個液體發(fā)酵培養(yǎng)基，Y1培養(yǎng)基：葡萄糖30 g·L-1、蛋白胨10 g·L-1、MgSO4·7H2O 1 g·L-1、KH2PO41 g·L-1、維生素B10.1 g·L-1，pH6.5；Y2培養(yǎng)基：葡萄糖30 g·L-1、水解乳蛋白10 g·L-1、MgSO4·7H2O 1 g·L-1、KH2PO41 g·L-1、維生素B10.1 g·L-1，pH6.5；Y3培養(yǎng)基：蔗糖30 g·L-1、酵母粉10 g·L-1、MgSO4·7H2O 1 g·L-1、KH2PO41 g·L-1、維生素B10.1 g·L-1，pH6.5；Y4培養(yǎng)基：淀粉30 g·L-1、蛋白胨10 g·L-1、MgSO4·7H2O 1 g·L-1、KH2PO41 g·L-1、維生素B10.1 g·L-1，pH 6.5。

（2）制備方法

在500 mL三角瓶中裝入150 mL液體培養(yǎng)基，121℃滅菌30 min后，從斜面種上挑取5塊等大的菌塊接入液體種培養(yǎng)基中，于18℃、150 r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)30 d。Y1、Y2、Y3、Y4各配方重復(fù)3次。收集每種配方的純菌絲體，烘干備用。

1.2.3 中國被毛孢純菌絲體培養(yǎng)基

（1）中國被毛孢純菌絲體培養(yǎng)基

葡萄糖30 g·L-1、蛋白胨10 g·L-1、MgSO4·7H2O 1 g·L-1、KH2PO41 g·L-1、維生素B10.1 g·L-1，pH 6.5。

（2）制備方法

在10 L發(fā)酵罐裝入7 L液體培養(yǎng)基，滅菌冷卻后以接種量8%接入培養(yǎng)好的種子液，設(shè)置發(fā)酵溫度為18℃，攪拌速度100 r·min-1，發(fā)酵罐通氣量為4 L·min-1。在此條件下發(fā)酵9 d后，將發(fā)酵液離心（10 025 g，10 min），棄去發(fā)酵液，收集菌絲體，純水洗滌2遍后，低溫烘干至恒重，作為標(biāo)準(zhǔn)菌絲體，繪制菌絲體生物量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 固體發(fā)酵培養(yǎng)

（1）固體發(fā)酵種子液培養(yǎng)

種子液培養(yǎng)基按1.2.3（1）；用接種鏟刮取試管斜面菌塊接種到盛有液體培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中（裝液量為150 mL/500 mL三角瓶），于18℃、150 r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)30 d。

（2）固體發(fā)酵培養(yǎng)基

根據(jù)其它蟲草無性型菌株的經(jīng)驗配方，以大米、小麥為碳源，以玉米粉、黃豆粉為氮源，對固體發(fā)酵的碳源、氮源進(jìn)行篩選試驗。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖20 g·L-1、水解乳蛋白5 g·L-1、MgSO4·7H2O 1 g·L-1、KH2PO41 g·L-1、維生素B10.1 g·L-1。除基礎(chǔ)培養(yǎng)基外，添加其它碳源與氮源的總量為20 g，設(shè)置8個固態(tài)發(fā)酵的培養(yǎng)基配方，每個配方重復(fù)4次，并添加各配方組的空白對照（不接入種子液），如表1所示。

表1 固體發(fā)酵培養(yǎng)基配方Tab.1 Composition of solid fermentation medium

稱取20 g培養(yǎng)料于250 mL罐頭瓶中，加入30 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基，攪拌均勻，采用通氣封瓶膜封口，常溫浸泡12 h。次日于121℃滅菌30 min，然后冷卻降至室溫。挑選菌球密度大、大小均一、不易沉降的種子液，搖勻后精確吸取4 mL，均勻接種于固體培養(yǎng)基表面，在溫度18℃，相對濕度80%～85%的人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)50 d?？瞻讓φ战M不接入種子液，其余操作相同。

1.2.5 菌絲體核酸的測定

（1）純菌絲體中核酸的提取測定

參照參考文獻(xiàn)[16]方法，分別準(zhǔn)確稱取10 L發(fā)酵罐培養(yǎng)所得的中國被毛孢菌絲體干粉0.05 g、0.1 g、0.15 g、0.2 g、0.3 g、0.4 g，置于10 mL具塞試管內(nèi)，加入8 mL的5%三氯乙酸溶液，搖勻后80℃水浴提取40 min。取出后冰浴冷卻，離心（8 000 r·min-1，4℃，15 min），取上清液，用5%三氯乙酸溶液定容至10 mL。取定容液，稀釋40倍，以5%三氯乙酸作為空白對照，于260 nm處測定OD值，建立菌絲體質(zhì)量（g）與吸光值之間的線性方程。

（2）發(fā)酵物中核酸的提取測定

各配方固體發(fā)酵物經(jīng)60℃干燥，粉碎。準(zhǔn)確稱取1.0 g粉末按1.2.5（1）方法提取核酸，未經(jīng)發(fā)酵的固體發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)采用同樣的方法處理作為空白對照，在260 nm處測定提取液的OD值，由所測OD值對照純菌體與核酸紫外吸收曲線關(guān)系（見圖2），換算成菌絲體量。

1.2.6 固體發(fā)酵物中腺苷含量的測定

（1）色譜條件

Waters Atlantis T3色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫30℃，紫外檢測器，波長260 nm，流動相20%甲醇-水溶液，流速1 mL·min-1，進(jìn)樣量為20 μL。

（2）腺苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

精確稱取10 mg腺苷標(biāo)準(zhǔn)品，用超純水溶解于25 mL容量瓶，分別配置1.00 μg·mL-1、2.00 μg·mL-1、5.00 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1、20.0 μg·mL-1和40.0 μg·mL-1的腺苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，在給定的儀器條件下進(jìn)行液相色譜分析，以出峰時間定性分析，以試樣峰面積對標(biāo)準(zhǔn)液濃度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算線性回歸方程為y=43.82x-3.62，R2=0.9999。

（3）樣品腺苷含量的測定

精確稱取2 g固體發(fā)酵物粉末，置于25 mL容量瓶中，加超純水定容，超聲處理1 h，放冷后補水至滿刻度，充分搖勻，8 000 r·min-1，離心5 min，取適量上清液經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過濾后供液相色譜檢測用。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌絲體質(zhì)量與核酸含量的線性關(guān)系

研究表明，核酸在細(xì)胞中含量穩(wěn)定，不受營養(yǎng)條件、菌齡等因素的影響，理論上講應(yīng)與生物量具有較好的線性關(guān)系。菌絲體質(zhì)量與核酸OD值的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 菌絲體質(zhì)量與核酸OD值的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve between amount of mycelia and nucleic acid content

由圖1可知，中國被毛孢純菌絲體質(zhì)量與吸光度之間具有良好的線性關(guān)系。線性方程y=2.536x+0.021，相關(guān)性良好，相關(guān)系數(shù)R2=0.9994。

2.2 不同來源的中國被毛孢菌絲體中核酸含量

不同來源的中國被毛孢菌絲體中核酸含量情況見表2。

表2 不同來源的中國被毛孢菌絲體中核酸含量Tab.2 Nucleic acid content of Hirsutella sinensis mycelium from different sources

由表2可知，液體發(fā)酵所得菌絲體、純菌絲體與市售中國被毛孢菌絲體中核酸含量相差不大。說明培養(yǎng)基中碳源、氮源、營養(yǎng)素，以及培養(yǎng)條件對菌絲體中核酸的影響較小，進(jìn)一步驗證了核酸作為中國被毛孢菌絲體生物量的表征指標(biāo)之一。

2.3 固體發(fā)酵菌絲體生長情況

不同配方條件下，中國被毛孢生長情況見表3。

表3 中國被毛孢菌絲生長情況Tab.3 Growth of Hirsutella sinensis mycelium

由表3可知，在3 d～5 d各配方均有菌絲體萌發(fā)生長，其中G7配方菌絲體長勢良好。發(fā)酵培養(yǎng)50 d后，不同配方的中國被毛孢菌落形態(tài)特征差異較為明顯，配方G1、G2、G4僅在培養(yǎng)基表面出現(xiàn)呈灰白色的菌絲體，配方G1、G2表面無明顯菌落，培養(yǎng)基內(nèi)也無菌絲體，而配方G4表面則呈現(xiàn)少量不規(guī)則菌落，培養(yǎng)基內(nèi)則看到少量菌絲體。配方G3、G5、G6、G8的培養(yǎng)基表面出現(xiàn)呈灰白色的菌絲體，形成部分不規(guī)則的菌落，而培養(yǎng)基內(nèi)部亦發(fā)現(xiàn)稀松至較密集的菌絲體。配方G7整個培養(yǎng)基表面出現(xiàn)呈灰白至亮白色的成片規(guī)則菌落，培養(yǎng)基內(nèi)菌絲體密集，長勢良好。結(jié)果表明，在水解乳蛋白為動物型氮源基礎(chǔ)上，僅以大米、小麥作為單一碳源時，中國被毛孢的長勢較差，在培養(yǎng)基表面僅形成了部分的菌絲組織，隨著時間增加，菌落幾乎無變化。

而在單一碳源基礎(chǔ)上再添加玉米粉、黃豆粉植物型氮源，中國被毛孢菌絲體長勢表現(xiàn)為玉米粉好于黃豆粉，說明在本文配方中，玉米粉作為氮源更適于中國被毛孢菌絲體生長。進(jìn)一步研究表明，以大米、小麥作為復(fù)合碳源，添加玉米粉和黃豆粉，中國被毛孢菌絲體長勢表現(xiàn)為玉米粉好于黃豆粉。研究也表明，動物型氮源更適于中國被毛孢生長，本文則發(fā)現(xiàn)動物型氮源與植物型氮源合理組合，更利于中國被毛孢菌絲體生長，并隨著碳源種類的增加，可獲得長勢良好和菌落密集的中國被毛孢菌絲體。因此，在配方中將不同種類碳源與動物型氮源、植物型氮源合理搭配，可有效提高中國被毛孢固體發(fā)酵的產(chǎn)率。

2.4 固體發(fā)酵物中菌絲體含量

不同配方對中國被毛孢菌絲體生物量的影響見圖2。

圖2 不同固體發(fā)酵配方中發(fā)酵物菌絲體含量Fig.2 Mycelium content in different solid fermentation formulas

由圖2可知，固體發(fā)酵配方G3、G5、G7、G8中菌絲體含量較高，超過37 mg·g-1，其中配方G7中菌絲體含量高達(dá)80.70 mg·g-1；而配方G1、G2、G4、G6中菌絲體含量較低。以菌落生物量為指標(biāo)，最佳碳源、氮源配方依次為：G7＞G3＞G5＞G8＞G6＞G2＞G1＞G4，并結(jié)合菌絲體的生長情況，在配方中添加大米、小麥為復(fù)合碳源，玉米粉、水解乳蛋白為復(fù)合氮源，能有效增加中國被毛孢菌絲體的生物量。

2.5 優(yōu)化配方固體發(fā)酵物中腺苷含量

腺苷標(biāo)準(zhǔn)品和固體發(fā)酵物的HPLC色譜圖見圖3。不同固體發(fā)酵配方（4個較優(yōu)配方）發(fā)酵物中腺苷含量情況見圖4。

圖3 腺苷標(biāo)準(zhǔn)品（a）和固體發(fā)酵物的HPLC色譜圖（b）Fig.3 HPLC chromatograms of adenosine standard(a)and solid fermentation samples(b)

圖4 不同固體發(fā)酵配方發(fā)酵物中腺苷含量Fig.4 Content of adenosine in solid fermentation formulas

圖3結(jié)果顯示，由固體發(fā)酵獲得中國被毛孢菌絲體中的腺苷具有良好的峰形和分離度。根據(jù)不同配方固體發(fā)酵菌絲體生長情況及生物量結(jié)果，得到4個中國被毛孢固體發(fā)酵較優(yōu)配方（配方G3、G5、G7、G8）。配方G7中腺苷含量高達(dá)63.76 μg·g-1，配方G3次之，配方G5、G8中腺苷含量較少，并且腺苷含量與菌絲體含量的變化呈正相關(guān)，而配方G8中以黃豆粉為復(fù)合氮源，其生物量和腺苷含量均小于以玉米粉為復(fù)合氮源的配方，進(jìn)一步證明了在固體發(fā)酵配方中添加玉米作為復(fù)合氮源，能有效改善中國被毛孢菌絲體的長勢以及提高菌絲體有效成分的含量。

3 結(jié)論

中國被毛孢作為1種真菌，其菌絲體生長繁殖離不開碳氮源等營養(yǎng)成分。由于核酸在細(xì)胞內(nèi)的含量較穩(wěn)定，不受培養(yǎng)條件影響，因此，本研究首先驗證核酸能作為生物量的間接指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)菌絲體質(zhì)量與核酸含量呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。同時在配方中將不同種類碳源與動物型氮源、植物型氮源合理搭配，并從8種固體發(fā)酵配方中篩選出以大米和小麥作為復(fù)合碳源，玉米粉為復(fù)合植物型氮源的配方，獲得的菌絲長勢最佳，其生物量和功效成分腺苷含量最高。

目前關(guān)于中國被毛孢固體發(fā)酵的研究較少，并且固體發(fā)酵研究主要以菌絲體生物量為指標(biāo)，以功能成分為指標(biāo)的研究不多。本文以核酸含量作為間接指標(biāo)評價菌絲體含量，篩選出中國被毛孢較佳的固體發(fā)酵配方工藝，進(jìn)一步地以功能成分腺苷含量作為指標(biāo)，獲得以大米和小麥作為復(fù)合碳源，玉米粉為復(fù)合植物型氮源的最佳配方。前期研究主要確定碳源、氮源種類并在添加量基礎(chǔ)上選用了2種植物型氮源，由于植物型和動物型氮源的來源較多，下一步將繼續(xù)針對不同種類碳源、氮源及其添加量進(jìn)行更深入研究，以期為中國被毛孢固體發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)提供更多研究數(shù)據(jù)。

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