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      利用siRNA高通量測序技術(shù)檢測平菇病毒*

      2018-01-27 05:27:27叢倩倩蘭玉菲崔曉安秀榮
      中國食用菌 2018年1期
      關(guān)鍵詞:平菇同源食用菌

      叢倩倩,蘭玉菲,崔曉,安秀榮

      (泰安市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,山東泰安271000)

      平菇(Pleurotus ostreatus),又名糙皮側(cè)耳,隸屬于真菌門擔(dān)子菌綱(Basidiomycetes)傘菌目(A-garicales)側(cè)耳科(Pleurotaceae)側(cè)耳屬(Pleurotus),是我國栽培面積最廣泛的食用菌之一[1]。平菇營養(yǎng)物質(zhì)豐富,適應(yīng)性強(qiáng),栽培成本低,周期短,且栽培原料能就地取材,可為栽培者帶來良好的經(jīng)濟(jì)效益。但是,在平菇菌種生產(chǎn)種植過程中可能會受到一些病毒的侵染,導(dǎo)致子實體畸形,品質(zhì)下降,產(chǎn)量降低甚至絕收[2]。

      病毒的檢測和診斷是預(yù)防和控制病毒病害的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié),對生產(chǎn)實踐具有重要的指導(dǎo)意義。相對于其他作物病毒病害的研究,食用菌病毒病害的研究范圍較窄,研究基礎(chǔ)較為薄弱。目前,對食用菌病毒的檢測和鑒定通常采用電鏡法[3-4]、血清學(xué)方法[5-6]、dsRNA技術(shù)[7-10]、PCR[11-12]等。上述方法僅在對病原物特征有預(yù)先了解的情況下使用,而在對病原物了解缺乏的情況下,這些檢測方法的使用就受到了極大的限制。

      應(yīng)用siRNA高通量測序技術(shù)鑒定病毒是近幾年快速發(fā)展起來的一項技術(shù)。在病毒與寄主的互作中,病毒復(fù)制產(chǎn)生的雙鏈RNA(dsRNA)可以被寄主體內(nèi)Dicer酶切割成大量針對入侵病毒的小干擾RNA(siRNA)[13-14]。siRNA分子量較小,長度為20 nt~25 nt,很容易與細(xì)胞中的其他RNA區(qū)分,因此可以利用高通量測序技術(shù)對病毒產(chǎn)生的siRNA序列進(jìn)行測序,并利用軟件對測序結(jié)果進(jìn)行組裝,組裝結(jié)果與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對來鑒定和發(fā)現(xiàn)新病毒[15-18]。

      本研究利用siRNA高通量測序技術(shù),檢測疑似被病毒侵染的平菇樣品中是否攜帶病毒,旨在為其他種類食用菌的病毒檢測鑒定提供借鑒和參考。

      1 材料與方法

      1.1 供試菌株

      平菇樣品采集于山東省聊城市鄭家鎮(zhèn),樣品表現(xiàn)癥狀為子實體球形變小,菌蓋黃褐色,見圖1。

      1.2 方法

      1.2.1 RNA的提取與質(zhì)量檢測

      圖1 平菇樣品癥狀Fig.1 Sample symptoms of Pleurotus ostreatus

      將5個平菇樣品混合后,采用Trizol法提取總RNA??俁NA用干冰保存,送往北京諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行測序。測序前需對RNA的質(zhì)量進(jìn)行檢測,包括:分析RNA是否降解及其是否有污染,檢測RNA的純度和完整性,精確定量RNA的濃度。

      1.2.2 文庫的構(gòu)建

      樣品檢測合格后,使用Small RNA Sample Pre Kit構(gòu)建cDNA文庫。

      1.2.3 測序數(shù)據(jù)過濾

      構(gòu)建好的文庫利用Illumina HiSeqTM 2000進(jìn)行測序。為了保證分析質(zhì)量,必須對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾,去除接頭序列和低質(zhì)量的讀段(reads),得到干凈的讀段(clean reads),最后選取18 nt~26 nt的reads來進(jìn)行后續(xù)分析。

      1.2.4 siRNA的序列拼接和候選病毒篩選

      所得的序列去除3’接頭,然后分別利用PFOR(參數(shù)為-x4)和Velvet(參數(shù)為k-mer 17)軟件對篩選所得siRNA進(jìn)行序列拼接,獲得較長的重疊群(contigs)。首先將拼接所得的contigs與寄主基因組數(shù)據(jù)庫(Host Genome)進(jìn)行比對,除去寄主的基因組序列,然后將剩余的contigs用BLASTN與核酸數(shù)據(jù)庫(NCBI Nt)進(jìn)行比對,尋找與這些contigs高度同源的序列,再然后用BLASTX將沒有找到高度同源序列的contigs與蛋白數(shù)據(jù)庫(NCBI Nr)進(jìn)行比對,尋找與contigs部分同源的序列,最后將與contigs高度同源序列和部分同源序列分別與病毒核酸數(shù)據(jù)庫(Virus RefSeq Nucleotide)和病毒蛋白數(shù)據(jù)庫(Virus RefSeq Protein)進(jìn)行比對,篩選出和病毒序列同源的contigs,從而得到候選病毒。比對采用參數(shù)限制e期望值(e-value)(1e-6 for BLASTN,1e-4 for BLASTX)。

      1.2.5 PCR驗證

      根據(jù)所得候選病毒,設(shè)計特異性引物分別進(jìn)行擴(kuò)增以進(jìn)一步驗證測序結(jié)果的準(zhǔn)確性。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 平菇樣品總RNA質(zhì)量分析

      平菇樣品總RNA質(zhì)量分析結(jié)果見表1,檢測結(jié)果合格,符合建立cDNA文庫的要求。

      表1 平菇樣品總RNA質(zhì)量分析Tab.1 Quality analysis on total RNA of Pleurotus ostreatus

      2.2 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量情況

      對siRNA測序結(jié)果進(jìn)行分析,去除接頭序列和低質(zhì)量的讀段,測序得到的數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果見表2。

      對數(shù)據(jù)庫的測序質(zhì)量進(jìn)行評估,其中干凈的讀段占總讀段的百分比達(dá)到了95%以上,表明測序質(zhì)量較高,達(dá)到信息分析的要求。

      2.3 siRNA的拼接與注釋

      5個數(shù)據(jù)庫所注釋的contigs維恩圖和結(jié)果統(tǒng)計見圖2和表3。

      從clean reads中篩選長度18 nt~26 nt的siRNA來進(jìn)行后續(xù)分析,經(jīng)長度篩選后所得的總reads數(shù)為2 749 087。使用PFOR軟件和velvet軟件對篩選的siRNA進(jìn)行序列拼接,得到總的重疊群數(shù)為479,將拼接所得的contigs分別與Host Genome、NCBI Nr、NCBI Nt、Virus RefSeq Nucletide和Virus RefSeq Protein五個數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對,發(fā)現(xiàn)被Host Genome注釋所得的contigs數(shù)為85,未被Host Genome而只被NCBI Nr和NCBI Nt注釋的contigs數(shù)分別為5和17,被Virus RefSeq Nucleotide和Virus RefSeqProtein注釋所得的contigs數(shù)分別為2和7。

      表2 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量統(tǒng)計Tab.2 Quality statistics of sequencing data

      圖2 5個數(shù)據(jù)庫所注釋的contigs維恩圖Fig.2 Contigs Venn diagrams annotated by 5 databases

      2.4 候選病毒檢測結(jié)果

      在以上分類注釋結(jié)果中分離與病毒相關(guān)的con tigs,其病毒檢測結(jié)果見表4。

      從結(jié)果可以看出,文庫中檢測到8種候選病毒。其中,與Burdock mottle virus同源的contigs數(shù)目最高為3,其次檢測到了與Choristoneura occidentalisgranulovirus和Beet soil-borne mosaic virus同源的contigs數(shù)都為2,樣本中還檢測到與Culex originated Tymoviridae-like virus、Fig fleck-associated virus、Beet necrotic yellow vein virus、Blackberry virus E、Grapevine fleck virus同源的contigs數(shù)都為1。由于檢測到的與8種病毒同源的contigs數(shù)目均較少,而且能比對上的contigs總長度都較短,因此測序結(jié)果需要進(jìn)一步的試驗驗證才能明確所采集的樣品里是否含有這幾種病毒。

      表3 5個數(shù)據(jù)庫所注釋的contigs結(jié)果統(tǒng)計Tab.3 Contigs statistics annotated by 5 databases

      表4 平菇siRNA文庫病毒檢測結(jié)果Tab.4 Detection results of virus in Pleurotus ostreatus siRNA library

      2.5 RT-PCR驗證

      根據(jù)序列拼接結(jié)果,設(shè)計針對這八種候選病毒的特異性引物,利用RT-PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增驗證,RT-PCR結(jié)果卻未檢測到目的條帶,說明采集的平菇樣品中不存在這八種病毒,推測平菇球形癥狀的產(chǎn)生可能不是由于病毒侵染所導(dǎo)致的。

      3 討論

      常規(guī)的檢測方法在病毒檢測和新病毒發(fā)現(xiàn)中存在一定缺陷,適用于研究比較清楚的病毒,其針對性強(qiáng),但對于新病毒的發(fā)現(xiàn)較困難。與其相比,應(yīng)用深度測序技術(shù)可在病毒序列、特征等信息未知情況下,只需要提取樣品總RNA,通過篩選,建立小RNA文庫,然后對小RNA進(jìn)行測序,并通過組裝來檢測和發(fā)現(xiàn)病毒,靈敏度高,適用性強(qiáng),獲得的信息豐富。近年來,利用siRNA深度測序技術(shù)已在鑒定許多動植物的未知病原物中發(fā)揮重要作用[15-18]。

      目前,對食用菌病毒研究相對較少,可以利用的序列信息也較少,利用常規(guī)檢測方法難以對食用菌病毒做到全面檢測和鑒定,特別是尚未報道的病毒[19]。本研究利用siRNA高通量測序技術(shù)直接對球形平菇樣品中提取的siRNA進(jìn)行測序和生物信息學(xué)分析,鑒定其是否受病毒侵染,結(jié)果證明本研究采集的球形平菇樣品中不存在病毒,表明這種癥狀的產(chǎn)生并不是由病毒侵染所導(dǎo)致的。平菇畸形癥狀產(chǎn)生的原因有很多,包括栽培環(huán)境不適宜、管理不當(dāng)、菌種退化或變異等,我們所采集的樣品具體由哪種原因所導(dǎo)致還有待于進(jìn)一步的試驗證明。

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