楊移斌，艾曉輝，曹海鵬，楊先樂，姚嘉赟，沈錦玉

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，武漢 430223； 2.農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點實驗室，浙江省魚類健康與營養(yǎng)重點實驗室， 浙江省淡水水產(chǎn)研究所，浙江湖州 313001；3.上海海洋大學(xué)，上海 201306)

中華鱉(Trionyxsinensis)又名甲魚、水魚、團(tuán)魚等，其分類地位為龜鱉目(Testudines)鱉科(Trionychidae)，鱉屬(Trionyx)。中華鱉野生種群在國內(nèi)廣泛分布，同時也是國內(nèi)重要淡水養(yǎng)殖品種，深受廣大消費者喜愛。由于市場需求不斷增大，國內(nèi)養(yǎng)殖范圍不斷擴(kuò)大，中華鱉養(yǎng)殖業(yè)在國內(nèi)快速發(fā)展。但也因其養(yǎng)殖規(guī)模及集約化程度不斷提高，中華鱉養(yǎng)殖環(huán)境急劇惡化，病害頻發(fā)，尤其是細(xì)菌性病害常引起較大經(jīng)濟(jì)損失。目前已經(jīng)報道的中華鱉細(xì)菌性病原主要有嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)[1]、溫和氣單胞菌(A.sobria)[2]、豚鼠氣單胞菌(A.caviae)[3]、遲緩愛德華菌(Edwardsiellatarda)[4]、弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)[5]、格氏乳球菌(Lactococcusgarvieae)[6]、摩氏摩根菌(Morganellamorganii)[7]、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)[8]及蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)[9]。

2015年7-8月，湖北荊門某規(guī)?；B(yǎng)殖場中華鱉暴發(fā)大規(guī)模死亡。中華鱉發(fā)病死亡率高，但發(fā)病周期較長，引起了較大經(jīng)濟(jì)損失。經(jīng)臨床診斷及取樣，本研究在發(fā)病瀕死中華鱉體內(nèi)分離到1株優(yōu)勢菌，進(jìn)行了人工感染及鑒定實驗，確定了分離菌株的種類，并對其藥物敏感特性進(jìn)行了測定，以期為該病的有效防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗魚

具備典型癥狀的患病中華鱉10只取自湖北荊門中華鱉養(yǎng)殖場；感染用中華鱉(50±1.5) g購于湖北荊門中華鱉原種場，所購中華鱉體格健壯，無傷病，活力強，暫養(yǎng)于實驗室玻璃缸中7 d后無異常用于試驗。

1.1.2 試驗試劑

MH瓊脂、腦心浸出液培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯、革蘭氏染色液、藥敏紙片及細(xì)菌微量生化管均購自杭州微生物試劑有限公司；PCR反應(yīng)體系、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒均購自天根生化；測序服務(wù)及引物合成均由武漢擎科提供。

1.2 方法

1.2.1 臨床診斷

對中華鱉養(yǎng)殖場環(huán)境進(jìn)行調(diào)查，統(tǒng)計中華鱉發(fā)病死亡率，確定病害主要危害對象規(guī)格；對發(fā)病死亡中華鱉進(jìn)行臨床診斷，確定典型病癥，并通過光學(xué)顯微鏡鏡檢確定有無寄生蟲感染等，取具典型癥狀瀕死中華鱉回實驗室進(jìn)一步分析。

1.2.2 病原菌分離

在無菌條件下，取患病中華鱉的肝臟、腎臟、脾臟及腹水劃線于BHI平板上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中24 h，挑取形態(tài)、大小及顏色基本一致的菌落進(jìn)行細(xì)菌再純化，獲得的細(xì)菌純培養(yǎng)物加入25%的甘油混勻后置于-80 ℃保存。分離菌株暫命名為HD01。

1.2.3 人工感染及LD50測定

人工感染 將分離菌株HD01劃線于腦心浸出液瓊脂培養(yǎng)基上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中24 h，用無菌生理鹽水洗下菌苔，并參照麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)整菌懸液濃度為2.6×108CFU/mL。

將感染用中華鱉分為試驗組和對照組，每組均設(shè)置3個重復(fù)，每個重復(fù)30只中華鱉。連續(xù)充氧，水溫控制在26～29 ℃。實驗組中華鱉腹腔注射分離菌株菌液0.1 mL/尾，對照組相同部位注射等量無菌生理鹽水。每8 h觀察中華鱉活動狀況，及時記錄發(fā)病死亡中華鱉數(shù)量，并對死亡中華鱉進(jìn)行解剖觀察，進(jìn)行細(xì)菌再分離。

細(xì)菌LD50測定 將HD01株菌液稀釋成濃度為9.0×1010、9.0×109、9.0×108、9.0×107、9.0×106CFU/mL的菌懸液，分別注射到不同組中華鱉體內(nèi)，每只中華鱉注射0.1 mL，相當(dāng)于不同組每尾注射分離菌株HD01的劑量9.0×109、9.0×108、9.0×107、9.0×106、9.0×105CFU，進(jìn)行攻毒實驗，對照組中華鱉相同部位注射等量無菌生理鹽水，每組中華鱉各30只。持續(xù)觀察試驗中華鱉的活動情況，及時記錄發(fā)病死亡數(shù)量，并用概率單位圖解法[10]計算半致死劑量(LD50)。

1.2.4 形態(tài)學(xué)及生理生化特性測定

將分離菌株在營養(yǎng)瓊脂平板上劃線，分別置于28 ℃及37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，觀察菌落大小、形態(tài)特征及其顏色，并進(jìn)行革蘭氏染色，采用細(xì)菌微量生化鑒定管參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[11]測定分離菌株生理生化指標(biāo)。

1.2.5 16 S rRNA基因序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析

將菌株HD01接種于腦心浸出液培養(yǎng)基中，置于28 ℃震蕩培養(yǎng)24 h，高速離心后收集菌體，提取DNA作為PCR擴(kuò)增反應(yīng)模板。細(xì)菌16S rRNA序列擴(kuò)增引物為27F：5′-AGAGTTTGATC(C/A)TGGCTCAG-3′，1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。參照董婷等[12]方法進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的基因。擴(kuò)增產(chǎn)物確定為目的片段后送武漢擎科生物公司純化及序列測定。

將測序結(jié)果放到美國國家生物技術(shù)信息中心基因庫中進(jìn)行比對，根據(jù)比對結(jié)果下載同源性較高的序列采用Clustal X軟件進(jìn)行多序列匹配分析，通過MEGA5.1軟件Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，1 000次Bootstrap檢驗置信度。

1.2.6 藥敏特性分析

分離菌株藥敏特性分析參照NCCLS抗微生物藥物敏感性實驗執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)采用K-B法進(jìn)行[13]。將分離菌株HD01接種于BHI液體培養(yǎng)基中，經(jīng)28 ℃震蕩培養(yǎng)24 h，用無菌生理鹽水制成濃度為107CFU/mL的菌懸液，取200 μL菌液均勻涂于MH瓊脂平板上，貼上不同種類的藥敏紙片，置于28 ℃培養(yǎng)24 h后測量不同藥敏紙片的抑菌圈直徑。

2 結(jié)果

2.1 臨床診斷

發(fā)病養(yǎng)殖場規(guī)模較大，養(yǎng)殖面積達(dá)67 hm2，其中發(fā)病約占30%。池塘養(yǎng)殖的中華鱉發(fā)病率約20%，死亡率卻高達(dá)90%，從發(fā)病到死亡約1個月，周期較長，發(fā)病規(guī)格為400～600 g，引起較大經(jīng)濟(jì)損失。經(jīng)對養(yǎng)殖環(huán)境調(diào)查發(fā)現(xiàn)，其養(yǎng)殖用水氨氮在0.2～0.5 mg/L，亞硝酸鹽在0.02～0.06 mg/L，pH7.2，溶氧6.5～8.2 mg/L，水溫25～29 ℃；經(jīng)鏡檢未發(fā)現(xiàn)寄生蟲，其典型癥狀主要為搖頭晃腦，離水上岸不久即死亡，解剖后腹腔有大量腹水，重要組織器官如腎臟等有充血，肝腎脾腫大，肝臟鮮紅色，脾臟發(fā)紫，腎臟發(fā)黑，腸道無明顯病變，但無食物。

2.2 細(xì)菌分離

從患病中華鱉肝、腎、脾及腹水中分離到一株優(yōu)勢菌HD01。經(jīng)人工回歸感染實驗，注射濃度為2.6×108CFU/mL HDO1的實驗組中華鱉死亡26.67%，而對照組未出現(xiàn)異常。感染發(fā)病死亡中華鱉與自然發(fā)病的中華鱉病癥基本一致，經(jīng)細(xì)菌再分離實驗獲得了與菌株HD01形態(tài)及理化特征一致的菌株，表明分離菌株HD01是本養(yǎng)殖場中華鱉的病原菌。根據(jù)表1建立實驗魚死亡率(%)與細(xì)菌劑量對數(shù)[lg(CFU)]的關(guān)系曲線：y=0.25x-1.587 5(圖1)，分離菌株HD01對中華鱉半數(shù)致死劑量LD50=2.24×108CFU/尾，即4.48×106CFU/g。

表1 分離株對中華鱉LD50試驗結(jié)果Tab.1 Results of LD50 of isolation strain in T.sinensis

圖1 中華鱉死亡率(%)與細(xì)菌劑量對數(shù) [lg (CFU)]的關(guān)系曲線Fig.1 The relation curve of T.sinensis mortality with logarithm of bacteria dose

2.3 細(xì)菌鑒定

經(jīng)培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，分離菌株HD01在28 ℃條件下，在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上呈現(xiàn)鮮紅色，而在37 ℃條件下呈現(xiàn)無色，而其形態(tài)大小均無明顯不同。分離菌株HD01為革蘭氏陰性菌，具體生理生化指標(biāo)見表2，生理生化指標(biāo)初步確定菌株HD01為粘質(zhì)沙雷氏菌。將分離菌株HD01的16S rRNA基因序列與基因庫中已有序列進(jìn)行比對，結(jié)果顯示HD01株與沙雷菌屬種類同源性最高，選取同源性高的沙雷菌屬序列及水產(chǎn)常見病原菌的16S RNA系列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)，結(jié)果顯示分離菌株HD01與粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)聚為一支，同源性最高，為99%。因此綜合生理生化特性判定HD01株為粘質(zhì)沙雷氏菌。

表2 菌株HD01的生理生化試驗結(jié)果Tab.2 Results of biochemical characteristics of strain HD01

注：“+”：陽性；“-”：陰性；“(+)”：陽性反應(yīng)超過24 h，“(-)”：陰性反應(yīng)超過24 h；“d”：11%～89%菌株為陽性。

圖2 HD01株 16S rRNA 基因序列與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of HD01 16S rRNA gene sequence and its relatives

2.4 藥敏特性

藥敏實驗結(jié)果(表3)顯示分離菌株HD01對氟苯尼考、多西環(huán)素、慶大霉素、苯唑西林、磺胺異惡唑及氯霉素等14種抗生素高度敏感；對阿莫西林中度敏感；對青霉素、頭孢拉定及痢特靈等7種抗生素耐藥。

3 討論

3.1 粘質(zhì)沙雷氏菌的鑒定

粘質(zhì)沙雷氏菌隸屬于變形菌門(Proteobacteria)腸桿菌目(Saccharomycetales)腸桿菌科(Enterobacteriaceae)沙雷氏菌屬(Serratia)，是革蘭氏陰性桿菌[14]。本研究通過革蘭氏染色，形態(tài)學(xué)觀察及微量生化鑒定管測定分離菌株HD01，結(jié)果顯示HD01為革蘭氏陰性桿菌，生化特征與粘質(zhì)沙雷氏菌一致，并且在28 ℃培養(yǎng)產(chǎn)生紅色色素，而在37 ℃培養(yǎng)則不產(chǎn)生[15]，亦符合粘質(zhì)沙雷氏菌的基本特性。

注：S：高度敏感； I：中度敏感；R：耐藥。

細(xì)菌的16S rRNA 基因片段保守性很高，其片段長度約1 500 bp，但也存在相對變異區(qū)，即在不同科屬種間存在一定的變異[16]，通過測定菌株16S rRNA能快速、準(zhǔn)確、高效區(qū)分不同菌株，目前16S rRNA基因序列分析成為微生物鑒定的良好工具[17]。通過對分離菌株HD01的16S rRNA序列進(jìn)行測序，在NCBI中進(jìn)行比對后，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分離菌株與粘質(zhì)沙雷氏菌聚為一支，同源性達(dá)99%。因此綜合形態(tài)學(xué)、生理生化特性測定及16S rRNA系列分析，判定分離菌株HD01為粘質(zhì)沙雷氏菌，鑒定結(jié)果科學(xué)、準(zhǔn)確、高效。

3.2 粘質(zhì)沙雷氏菌的危害

粘質(zhì)沙雷氏菌在自然環(huán)境廣泛存在，是水和土壤中的正常種群[18]，但大量研究證實，其也是臨床上的條件致病菌。目前已經(jīng)報道粘質(zhì)沙雷氏菌對多種昆蟲具備一定的致病性，如對棉鈴蟲、菜青蟲、蝗蟲、黃曲條跳甲幼蟲和成蟲、甜菜夜蛾等[18]，另外粘質(zhì)沙雷氏菌還能引起家蠶的大規(guī)模死亡[14]；在人體免疫機(jī)能下降時，粘質(zhì)沙雷氏菌會引起肺炎、關(guān)節(jié)炎、尿道感染、水型腸胃炎，甚至暴發(fā)敗血癥等嚴(yán)重疾病[19-21]。而關(guān)于粘質(zhì)沙雷氏菌對水生動物致病報道相對較少，僅Cao等[22]報道了其引起西伯利亞鱘出現(xiàn)紅嘴病，導(dǎo)致西伯利亞鱘出現(xiàn)死亡。而本研究中中華鱉感染粘質(zhì)沙雷氏菌導(dǎo)致?lián)u頭晃腦及重要器官嚴(yán)重充血，與西伯利亞鱘發(fā)病癥狀有類似處。經(jīng)回歸感染，試驗組中華鱉出現(xiàn)與自然發(fā)病相同癥狀，粘質(zhì)沙雷氏菌對中華鱉半致死劑量LD50=4.48×106CFU/g，表明粘質(zhì)沙雷氏菌是中華鱉的病原菌。

3.3 中華鱉粘質(zhì)沙雷氏菌病的藥物防治

本研究測定了分離菌株HD01對22種抗生素的敏感性，實驗結(jié)果顯示，菌株HD01對氟苯尼考、多西環(huán)素、慶大霉素、苯唑西林、磺胺異惡唑及氯霉素等14種抗生素高度敏感；對阿莫西林中度敏感；對青霉素、頭孢拉定及痢特靈等7種抗生素耐藥。藥敏實驗結(jié)果與Cao等[22]研究有差異，可能是因為菌株來源、地理環(huán)境及用藥情況等不同造成的。經(jīng)挑選高度敏感藥物氟苯尼考，參考水產(chǎn)用商品藥說明書使用，配合黃芪多糖伴餌投喂3 d后停止死亡，一個療程7 d后中華鱉恢復(fù)正常，不再出現(xiàn)異?；顒觽€體，取得了很好的治療效果。

雖然目前在水生動物病害治療時，藥物主要是抗生素治療仍然是首選有效手段之一，但細(xì)菌病害頻發(fā)，藥物濫用不僅導(dǎo)致病害防控失敗，也易引起環(huán)境問題，故研制高效預(yù)防技術(shù)如免疫防治等勢在必行。

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