方春雪 孫和平

1 長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中醫(yī)藥研究中心 （吉林 長(zhǎng)春 130021）

2 吉林省腫瘤醫(yī)院藥物臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu) （吉林 長(zhǎng)春 130021）

內(nèi)容提要： 近年來(lái)，高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)成為一種發(fā)展極為迅速的新興技術(shù)，在醫(yī)藥、化工、食品、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。因其具有靈敏度高、專(zhuān)屬性強(qiáng)、分析時(shí)間短及重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，也逐漸應(yīng)用于臨床檢測(cè)和輔助診斷，為精準(zhǔn)醫(yī)療提供技術(shù)支持。

1.總述

隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)得到飛速的發(fā)展?；仡欃|(zhì)譜儀的發(fā)展史，有幾個(gè)重要時(shí)間節(jié)點(diǎn)：①1912年，英國(guó)物理學(xué)家Thomson研制出了一臺(tái)簡(jiǎn)易的質(zhì)譜儀；②1942年，第一臺(tái)商用質(zhì)譜儀產(chǎn)生；③十九世紀(jì)八九十年代，科學(xué)家相繼研發(fā)出電噴霧質(zhì)譜儀及高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜[1,2]。一百多年的質(zhì)譜發(fā)展史，已經(jīng)有十余個(gè)諾貝爾獎(jiǎng)授予了與質(zhì)譜相關(guān)研究及應(yīng)用，足以見(jiàn)其技術(shù)的先進(jìn)性。

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS/MS）的應(yīng)用涉及了醫(yī)藥、環(huán)境、食品、化工等各個(gè)行業(yè)。該技術(shù)結(jié)合了液相色譜的良好分離能力和串聯(lián)質(zhì)譜的高特異性檢測(cè)的特點(diǎn)[3]，適于復(fù)雜生物樣本的分析檢測(cè)，LC-MS/MS技術(shù)在臨床診斷方面的發(fā)展勢(shì)頭尤為迅猛[4]。

2.LC-MS/MS的工作原理及特點(diǎn)

質(zhì)譜儀是檢測(cè)帶電物質(zhì)的質(zhì)量差異的一類(lèi)儀器。質(zhì)譜的檢測(cè)原理最早由英國(guó)物理學(xué)家Thomson提出，但是由于受離子化技術(shù)的限制，最初的質(zhì)譜儀僅應(yīng)用于一些分子量小且熱穩(wěn)定化合物的檢測(cè)。直到20世紀(jì)90年代，電噴霧離子化技術(shù)（ESI）及基質(zhì)輔助激光解析離子化技術(shù)（MALDI）的相繼開(kāi)發(fā)，才使得生物質(zhì)譜的研究取得跨越式發(fā)展。

2.1 質(zhì)譜離子源

離子化過(guò)程對(duì)質(zhì)譜檢測(cè)十分關(guān)鍵，只有將分析物變成帶電粒子并轉(zhuǎn)移到氣相中，才能被質(zhì)譜儀檢測(cè)到。目前應(yīng)用的離子化方法，除了上述提到的ESI及MALDI，還有大氣壓化學(xué)離子化（APCI）和大氣壓光離子化（APPI）。其中最常用的離子化方法是ESI[5]。

2.2 質(zhì)量分析器

質(zhì)量分析器是質(zhì)譜儀的重要組成部分，其作用是將生成的離子按照質(zhì)核比（m/z）將不同的待測(cè)成分分開(kāi)。質(zhì)量分析器主要有以下幾種：四級(jí)桿質(zhì)量分析器、離子阱質(zhì)量分析器及飛行時(shí)間質(zhì)量分析器等。不同類(lèi)型的質(zhì)量分析器可以互相組合串聯(lián)，如四級(jí)桿-離子阱串聯(lián)質(zhì)譜、四級(jí)桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜等。

2.3 生物樣本的LC-MS/MS分析

生物樣本的組分比較復(fù)雜，因此需要在進(jìn)行LC-MS/MS分析前對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行提純。常用的前處理方法主要有蛋白質(zhì)沉淀法（PPT）、液液萃取法（LLE）和固相萃取法（SPE）等。

樣品經(jīng)過(guò)前處理后，還需要進(jìn)行適當(dāng)?shù)姆蛛x。目前常用的分離技術(shù)有毛細(xì)管電泳（CE）、液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）等。生物樣本經(jīng)過(guò)前處理，再由HPLC進(jìn)行色譜分離，在離子源處離子化形成帶電離子，然后進(jìn)入質(zhì)譜系統(tǒng)。LC-MS/MS分析方法既包含了液相色譜高效的分離速度和更好的分離度，同時(shí)也具備了質(zhì)譜分析的超強(qiáng)的專(zhuān)屬性和超高的靈敏度，成為臨床檢測(cè)領(lǐng)域最富有活力的新技術(shù)之一。

3.LC-MS/MS技術(shù)在臨床上的應(yīng)用

3.1 全譜氨基酸檢測(cè)

全譜氨基酸在體內(nèi)處于一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡，一旦這種平衡被破壞，便會(huì)引發(fā)人體的眾多疾病。全譜氨基酸在體內(nèi)涉及到免疫、神經(jīng)系統(tǒng)、激素分泌、物質(zhì)代謝及能量代謝等諸多環(huán)節(jié)[6]。因此，其檢測(cè)對(duì)健康評(píng)估和疾病診斷具有重要意義[7]。

時(shí)正媛等[8]使用UPLC-MS/MS方法建立了人體血清中包括丙氨酸、精氨酸、谷氨酸、甘氨酸和脯氨酸等在內(nèi)的13種氨基酸含量測(cè)定的方法。以13種同位素標(biāo)記的氨基酸混合物為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，血清樣本用蛋白質(zhì)沉淀法進(jìn)行前處理，取上清液進(jìn)行UPLC-MS/MS分析。分析時(shí)間短、特異性強(qiáng)、靈敏度高。為全譜氨基酸檢測(cè)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

3.2 同型半胱氨酸檢測(cè)

同型半胱氨酸（HCY）是引起心腦血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。1969年Mccully提出了高同型半胱氨酸血癥能夠?qū)е聞?dòng)脈粥樣硬化疾病的假說(shuō)。該假說(shuō)認(rèn)為HCY能引起血管內(nèi)皮系統(tǒng)的損傷，加快血管平滑肌細(xì)胞的增殖，對(duì)低密度脂蛋白的氧化產(chǎn)生影響，同時(shí)增強(qiáng)血小板功能，促進(jìn)血栓形成。因此，測(cè)定HCY對(duì)于心腦血管疾病的預(yù)防和早期診斷具有重要意義[9]。

趙瑞等[10]收集63例進(jìn)行HCY檢測(cè)的血清樣本，用LCMS/MS法和循環(huán)酶法分別測(cè)定了63例血清樣本中的HCY濃度。樣本前處理中使用三氯醋酸銨作為沉淀劑，線(xiàn)性關(guān)系良好，用Spearman法對(duì)2種方法進(jìn)行相關(guān)性分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.3 類(lèi)固醇激素檢測(cè)

類(lèi)固醇激素是一種弱極性的小分子激素，主要由腎上腺、胎盤(pán)和生殖腺產(chǎn)生。類(lèi)固醇激素主要包括雄激素、雌激素、孕激素、糖皮質(zhì)激素和鹽皮質(zhì)激素等，體內(nèi)激素水平的變化，可以作為疾病診斷的依據(jù)之一。如醛固酮增生癥、先天性腎上腺皮質(zhì)增生、庫(kù)欣綜合征及先天代謝缺陷等，都會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)相應(yīng)激素水平的變化。因此，機(jī)體類(lèi)固醇激素水平的測(cè)定，可以作為疾病診斷的依據(jù)。

高潔等[11]使用固相萃取技術(shù)結(jié)合UPLC-MS/MS法建立了快速準(zhǔn)確的52種類(lèi)固醇激素的聯(lián)合測(cè)定方法。其中包括20種雄激素、8種雌激素、10種孕激素及14種糖皮質(zhì)激素。樣品用β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶水解后，經(jīng)乙腈超聲提取，過(guò)固相萃取柱，處理后進(jìn)行UPLC-MS/MS分析。質(zhì)譜采用電噴霧正/負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）檢測(cè)，方法簡(jiǎn)便快捷、專(zhuān)屬性強(qiáng)、靈敏度高，為質(zhì)譜檢測(cè)類(lèi)固醇激素提供了可靠依據(jù)。

3.4 T3/T4分析

三碘甲狀腺原氨酸（T3）/甲狀腺素（T4）與甲狀腺功能紊亂及甲狀腺癌密切相關(guān)。人群中大約有4～10%的成人有甲狀腺功能紊亂的癥狀。其中女性甲狀腺癌發(fā)病率為3～16人/萬(wàn)人，與男性發(fā)病率相比，高出約3～4倍。甲狀腺癌是一種常見(jiàn)癌癥，易于診斷且死亡率低，因此T3/T4的檢測(cè)對(duì)預(yù)防甲狀腺癌具有重要意義。

人體血液中的T3和T4大部分以結(jié)合態(tài)存在（約99%），如甲狀腺素結(jié)合球蛋白（TBG）游離態(tài)才有生物活性。臨床上通常采用放射性免疫分析法檢測(cè)T3/T4，但該方法可能會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性。國(guó)際臨床化學(xué)協(xié)會(huì)（IFCC）提出要對(duì)血清游離甲狀腺素的標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)方法進(jìn)行規(guī)范，該檢測(cè)主要基于平衡透析法結(jié)合LC-MS/MS進(jìn)行。足以見(jiàn)得LC-MS/MS分析方法在該檢測(cè)項(xiàng)目上的必要性。

4.結(jié)語(yǔ)

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)代表當(dāng)今精準(zhǔn)醫(yī)療發(fā)展方向之一，可實(shí)現(xiàn)多種分析物的同時(shí)測(cè)定，對(duì)健康評(píng)估和疾病診斷均具有重要意義。