鄭盈翔

國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局、國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)于2013年12月31日發(fā)布2013年第27號(hào)公告，批準(zhǔn)了《公共場(chǎng)所衛(wèi)生檢驗(yàn)方法 第1部分：物理因素》等5項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)，這些標(biāo)準(zhǔn)已于2014年12月01日起正式實(shí)施。其中GB/T 18204.3-2013《公共場(chǎng)所衛(wèi)生檢驗(yàn)方法 第3部分：空氣微生物》[1]（以下簡(jiǎn)稱“本標(biāo)準(zhǔn)”）與上一個(gè)版本GB/T 18204.3-2000[2]相比，技術(shù)內(nèi)容修訂變化較多。本標(biāo)準(zhǔn)實(shí)施三年來，新增的嗜肺軍團(tuán)菌檢驗(yàn)方法部分內(nèi)容在實(shí)際工作過程中暴露出了諸多的問題，檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)困惑較多，實(shí)際操作也可能出現(xiàn)理解偏差，影響了標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)施效果。為保證對(duì)國家標(biāo)準(zhǔn)的正確理解，完善可操作性，現(xiàn)探討如下。

1　范圍

本章規(guī)定“本部分適用于公共場(chǎng)所空氣細(xì)菌總數(shù)、真菌總數(shù)、溶血性鏈球菌以及嗜肺軍團(tuán)菌的測(cè)定，其他場(chǎng)所可參照?qǐng)?zhí)行?！边@里使用“測(cè)定”不妥，因?yàn)闇y(cè)定是通過測(cè)量獲得數(shù)據(jù)，而本標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)于嗜肺軍團(tuán)菌是定性檢驗(yàn)。所以，此處應(yīng)使用“檢驗(yàn)”這個(gè)名詞[3]。

2　術(shù)語和定義

除本標(biāo)準(zhǔn)2.4條對(duì)于嗜肺軍團(tuán)菌的拉丁學(xué)名應(yīng)寫為“Legionella pneumophila”[4]外，本標(biāo)準(zhǔn)2.5條對(duì)“撞擊法”的定義：“采用撞擊式空氣微生物采樣器，使空氣通過狹縫或小孔產(chǎn)生高速氣流，從而將懸浮在空氣中的微生物采集到營養(yǎng)瓊脂平板上，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)和得到菌落數(shù)的測(cè)定方法?！贝颂幎x有誤。首先，撞擊法的采集載體不僅限于平板，更不僅僅是營養(yǎng)瓊脂；其次，撞擊法僅僅是一種采樣方法，并不包括采樣后的實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)部分，所以，句末的“經(jīng)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)后得到菌落的測(cè)定方法”與采樣法無關(guān)，為贅述。本標(biāo)準(zhǔn)6.1條中對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌的采樣方法描述為“液體沖擊法”，實(shí)際就是撞擊法的一種，最終也無法得到菌落數(shù)。建議描述為“……將懸浮在空氣中的微生物采集到相應(yīng)培養(yǎng)基中的采樣方法”。

3　儀器和設(shè)備

本標(biāo)準(zhǔn)6.2.1和6.2.2中分別規(guī)定微生物氣溶膠濃縮器和液體沖擊式微生物氣溶膠采樣器“對(duì)于直徑3.0 μm以上粒子的捕集效率應(yīng)≥80%（或濃縮比≥8）”、“對(duì)于0.5 μm以上粒子的捕集效率應(yīng)≥90%”，目前并沒有相應(yīng)捕集效率的檢驗(yàn)方法，實(shí)驗(yàn)室無從證實(shí)。本標(biāo)準(zhǔn)6.2.3條規(guī)定使用50 mL離心管，實(shí)際分裝采樣吸收液的容量為20 mL，為了便于攜帶至現(xiàn)場(chǎng)采樣，建議采用25 mL容量的離心管。本標(biāo)準(zhǔn)6.2.6條對(duì)于紫外燈規(guī)定波長360 nm±2 nm，實(shí)際上一般用于觀察微生物菌落熒光的長波紫外燈波長為365 nm，規(guī)定為360 nm±2 nm必然給實(shí)驗(yàn)室?guī)砝_。普通光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡可用于觀察細(xì)菌染色形態(tài)或軍團(tuán)菌屬個(gè)別菌種的熒光現(xiàn)象，但在本標(biāo)準(zhǔn)的檢驗(yàn)步驟中并未使用這兩種顯微鏡，而且嗜肺軍團(tuán)菌并無自身熒光[4]，故本標(biāo)準(zhǔn)6.2.8條屬于贅述。因?yàn)楹罄m(xù)實(shí)驗(yàn)需要各種生化鑒定，比如明膠液化試驗(yàn)需要使用培養(yǎng)箱和冰箱[5]，所以，還遺漏了對(duì)于冰箱、恒溫培養(yǎng)箱的規(guī)定。

4　試劑和培養(yǎng)基

在本標(biāo)準(zhǔn)6.3.3條中，鹽酸氯化鉀溶液的制備方法存在疑問?！皩⑸鲜龀煞只旌?，用1 mol/L氫氧化鉀調(diào)整pH 2.2±0.2，121 ℃下高壓滅菌15 min備用?！丙}酸溶液經(jīng)過高壓滅菌后，氯化氫濃度會(huì)有很大的變化，最終pH值不可能是2.2±0.2。鑒于鹽酸（0.2 mol/L）pH值約為0.7，1 mol/L氫氧化鉀為強(qiáng)堿，細(xì)菌都無法存活，建議實(shí)驗(yàn)室改變制備方法，氯化鉀溶液121 ℃高壓滅菌15 min后，直接加入鹽酸（0.2 mol/L）3.9 mL混合，再用1 mol/L氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH后使用。

本標(biāo)準(zhǔn)6.3.4～6.3.6中規(guī)定了分離或鑒定培養(yǎng)基分別為GVPC瓊脂平板、BCYE瓊脂平板、BCYE CYE瓊脂平板。除此處“BCYE CYE瓊脂平板”與后續(xù)出現(xiàn)的“L-半光氨酸缺失的BCYE瓊脂平板”描述不符外，作為標(biāo)準(zhǔn)，出現(xiàn)英文縮略語的時(shí)候，應(yīng)該同時(shí)標(biāo)注英文全稱，還應(yīng)明確每一種培養(yǎng)基的具體配方和質(zhì)量控制要求，否則容易導(dǎo)致誤用培養(yǎng)基。如BCYE CYE瓊脂平板，該培養(yǎng)基為L-半胱氨酸缺失的BCYE瓊脂平板，CYE為活性炭酵母浸出物（charcoal yeast extract）的縮寫，半胱氨酸（cysteine）縮寫應(yīng)為CYS，所以，本標(biāo)準(zhǔn)6.3.6條應(yīng)描述為BCYE-CYS瓊脂平板。

本標(biāo)準(zhǔn)6.3.7條革蘭氏染色液，該試劑在后續(xù)檢驗(yàn)步驟中并未使用到，屬于贅述。

由于嗜肺軍團(tuán)菌生長營養(yǎng)需求特殊，在沒有特殊營養(yǎng)添加的生化反應(yīng)試劑中，嗜肺軍團(tuán)菌無法正常生長[4]，所以，本標(biāo)準(zhǔn)6.3.8條對(duì)于馬尿酸鹽生化反應(yīng)管，缺少明確說明應(yīng)使用特殊營養(yǎng)添加的生化反應(yīng)試劑。且馬尿酸鹽水解實(shí)驗(yàn)根據(jù)實(shí)驗(yàn)原理的不同可分為三氯化鐵法與茚三酮法，前者適用于鏈球菌等革蘭氏陽性菌，后者適用于彎曲菌等革蘭氏陰性菌[6]，此處未加以明確。

本章還遺漏了對(duì)于后續(xù)采樣必備和生化鑒定需要的無菌礦物油、氧化酶、硝酸鹽還原、尿素酶、明膠液化等多種生化試驗(yàn)用培養(yǎng)基和試劑的規(guī)定。

5　采樣

本標(biāo)準(zhǔn)6.4條中存在的問題，除了缺少對(duì)于采樣過程無菌操作的相應(yīng)規(guī)定外，6.4.4條規(guī)定“每個(gè)氣溶膠樣品采集空氣量1 m3～2 m3”，首先描述為“每個(gè)氣溶膠樣品”不合適，按照本標(biāo)準(zhǔn)6.6條結(jié)果報(bào)告和附錄A.2條撞擊法采樣布點(diǎn)要求，應(yīng)描述為“每個(gè)采樣點(diǎn)”；關(guān)鍵是此處所界定的應(yīng)采集的空氣量比較隨意，最大值為最小值的兩倍，標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定不明確，就可能引起法律糾紛。

本標(biāo)準(zhǔn)6.4.5所描述的“將采樣吸收液2（6.3.2）20 mL倒入微生物氣溶膠采樣器（6.2.2）中，然后用吸管加入礦物油1滴～2滴；在相同采樣點(diǎn)重復(fù)6.4.3、6.4.4步驟?！贝瞬襟E緊接著本標(biāo)準(zhǔn)6.4.2進(jìn)行，在實(shí)際工作中，并不可能購買大量的微生物氣溶膠采樣器，采樣后的吸收液1如何存放，所使用過的微生物氣溶膠采樣器如何消毒，此處應(yīng)加以說明。

6　檢驗(yàn)步驟

本標(biāo)準(zhǔn)6.5.1條規(guī)定“樣品的酸處理：對(duì)采樣后的吸收液1（6.3.1）和吸收液2（6.3.2）原液各取1 mL，分別加入鹽酸氯化鉀溶液（6.3.3）充分混合，調(diào)pH至2.2，靜置15 min”。在加入酸處理液后，再測(cè)定并調(diào)節(jié)pH值，操作繁瑣，也難以確定具體時(shí)間，ISO 11731:2017是將樣本1 mL與酸處理液1 : 9混合即可[7]；有報(bào)告靜置15 min可能影響目標(biāo)菌檢出率[8]，建議實(shí)驗(yàn)室將酸處理時(shí)間控制在3 min～5 min。

本標(biāo)準(zhǔn)6.5.2條規(guī)定“各取懸液0.2 mL～0.3 mL分別接種GVPC平板（6.3.4）”，取樣量不同，可能對(duì)于檢驗(yàn)結(jié)果就會(huì)產(chǎn)生影響，甚至引起爭(zhēng)議。另外，沒有明確接種方式。多數(shù)檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)可能選擇采用涂布棒進(jìn)行整個(gè)平板表面的涂布，建議先用涂布棒表面涂布半個(gè)平板，然后再用接種環(huán)在另外半邊平板上分區(qū)劃線，這樣可以保證更好的分離效果。

本標(biāo)準(zhǔn)6.5.4條描述的多種菌落顏色，都是對(duì)軍團(tuán)菌屬的菌落形態(tài)描述，并非本標(biāo)準(zhǔn)的目標(biāo)菌嗜肺軍團(tuán)菌，故如此描述易引起誤判，建議實(shí)驗(yàn)室通過作業(yè)指導(dǎo)書形式細(xì)化判斷特征。

本標(biāo)準(zhǔn)6.5.5條除兩處“半光氨酸”出現(xiàn)書寫錯(cuò)誤，應(yīng)為“半胱氨酸”外，規(guī)定“從平皿上挑取2個(gè)可疑菌落”進(jìn)行菌落驗(yàn)證，挑取的菌落數(shù)量偏少，可能導(dǎo)致漏檢。軍團(tuán)菌屬中有個(gè)別種可在L-半胱氨酸缺失的狀態(tài)下微弱生長[4]，所以規(guī)定“凡在BCYE瓊脂平板上生長而在L-半光氨酸缺失的BCYE瓊脂平板不生長的則為軍團(tuán)菌菌落”不妥，建議描述為“凡在BCYE瓊脂平板上生長而在L-半胱氨酸缺失的BCYE瓊脂平板不生長或微弱生長的則為軍團(tuán)菌菌落”。

本標(biāo)準(zhǔn)6.5.6條規(guī)定“應(yīng)進(jìn)行生化培養(yǎng)與血清學(xué)實(shí)驗(yàn)確定嗜肺軍團(tuán)菌”?！吧囵B(yǎng)”這種描述欠妥，關(guān)鍵是對(duì)于各種生化和血清學(xué)試驗(yàn)，具體該如何操作，并沒有明確說明。水解馬尿酸試驗(yàn)還缺少了最終的判定標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)為陽性。關(guān)于“嗜肺軍團(tuán)菌診斷血清”與本標(biāo)準(zhǔn)6.3.9條“軍團(tuán)菌分型血清試劑”描述不一致。另外，是否能夠直接應(yīng)用目前微生物檢驗(yàn)常用的商業(yè)化生化鑒定試劑盒或全自動(dòng)微生物鑒定儀，標(biāo)準(zhǔn)未能與時(shí)俱進(jìn)。

7　存在的其他問題

本標(biāo)準(zhǔn)還缺少對(duì)質(zhì)量控制的要求，例如生物安全、標(biāo)準(zhǔn)菌株也應(yīng)進(jìn)行規(guī)定[9-10]。目前，公共場(chǎng)所系列衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)之間不配套的現(xiàn)象仍然亟待解決[11]。如GB/T 18204.6-2013《公共場(chǎng)所衛(wèi)生檢驗(yàn)方法第6部分：衛(wèi)生監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范》4.9條“公共場(chǎng)所衛(wèi)生學(xué)評(píng)價(jià)”規(guī)定“開展公共場(chǎng)所衛(wèi)生學(xué)評(píng)價(jià)時(shí)，要連續(xù)監(jiān)測(cè)3 d，每次監(jiān)測(cè)應(yīng)采集平行樣品”[12]。對(duì)公共場(chǎng)所空氣嗜肺軍團(tuán)菌檢驗(yàn)來說，是否需要采集平行樣品，平行樣品檢驗(yàn)結(jié)果不一致的時(shí)候如何判定，以符合GB/T 18204.6-2013的明確規(guī)定，只能期待標(biāo)準(zhǔn)的下一次修訂了。

[1]GB/T 18204．3-2013． 公共場(chǎng)所衛(wèi)生檢驗(yàn)方法第3部分：空氣微生物[S]． 北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2013．

[2]GB/T 18204-2000．公共場(chǎng)所衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法[S]． 北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2000．

[3]中國社會(huì)科學(xué)院語言研究所． 現(xiàn)代漢語詞典[M]． 2版． 北京：商務(wù)印書館，1995：109，553．

[4]倪語新，尚紅． 臨床微生物學(xué)與檢驗(yàn)[M]． 4版． 北京：人民衛(wèi)生出版社，2007：72，167-173．

[5]何曉青． 衛(wèi)生防疫細(xì)菌檢驗(yàn)-兼論醫(yī)學(xué)細(xì)菌分類學(xué)基礎(chǔ)[M]． 北京：新華出版社，1989：595-596．

[6]王秀茹． 預(yù)防醫(yī)學(xué)微生物及檢驗(yàn)技術(shù)[M]． 北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：907．

[7]ISO 11731：2017，Water quality--Enumeration of Legionella[S]．Switzerland：International Organization for Standardization，2017．

[8]龔瑾，胡必杰，謝紅梅，等． 酸處理時(shí)間對(duì)軍團(tuán)菌生長的影響[J]．藥學(xué)服務(wù)與研究，2008，8（3）：209-212．

[9]GB/T 19489-2008． 實(shí)驗(yàn)室 生物安全通用要求 [S]． 北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008．

[10]CNAS-CL09：2013． 檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力認(rèn)可準(zhǔn)則在微生物檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用說明[S]． 北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2014．

[11]周立波，夏海燕，周沼． 關(guān)于公共場(chǎng)所衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)方法的問題探討 [J]． 中國民康醫(yī)學(xué)，2007，19（12）：488．

[12]GB/T 18204．6-2013． 公共場(chǎng)所衛(wèi)生檢驗(yàn)方法 第6部分：衛(wèi)生監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范[S]． 北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2013．