范文宏，曾佩，盧惠婷，劉瑩瑩，李曉敏

北京航空航天大學(xué)空間與環(huán)境學(xué)院， 北京 100191

二氧化鈦納米顆粒是目前使用最為廣泛的納米材料之一[1]。2006年，僅在美國(guó)就生產(chǎn)了4萬(wàn)t納米二氧化鈦(nTiO2)[2]。在生產(chǎn)、運(yùn)輸和應(yīng)用過(guò)程中，這些納米材料會(huì)進(jìn)入環(huán)境，通過(guò)污(廢水)排放、地表徑流等方式[3]，也不可避免地會(huì)進(jìn)入水環(huán)境中，必然會(huì)對(duì)其中的水生生物產(chǎn)生影響[4-5]。

有文獻(xiàn)指出，nTiO2本身毒性不大，對(duì)水生生物的半致死濃度大于100 mg·L-1 [6]。常見(jiàn)的nTiO2環(huán)境濃度為0.7～16 μg· L-1 [7]。但是進(jìn)入水體的nTiO2會(huì)與水體中其他物質(zhì)發(fā)生復(fù)雜反應(yīng)[8]，會(huì)影響其他污染物的環(huán)境行為和生態(tài)毒性。相關(guān)研究報(bào)道了nTiO2對(duì)重金屬、有機(jī)污染物生物毒性的影響。Zhang等[9]研究發(fā)現(xiàn)nTiO2存在會(huì)增強(qiáng)鯉魚(yú)體內(nèi)鎘(Cd2+)的生物蓄積。Zhu等[10]研究表明nTiO2會(huì)增強(qiáng)三丁基錫的水生生物毒性。重金屬不但污染水環(huán)境，也嚴(yán)重威脅人類和水生生物的生存。目前，已有大量關(guān)于重金屬離子對(duì)水生生物的毒性研究[11-12]。銅離子(Cu2+)是常見(jiàn)的重金屬之一，然而，目前二氧化鈦對(duì)銅的影響研究仍然較為缺乏。

研究表明，二氧化鈦對(duì)金屬毒性的影響與二氧化鈦本身性質(zhì)有關(guān)[13]。Hartmann等[14]研究不同粒徑nTiO2與Cd2+對(duì)綠藻的聯(lián)合毒性時(shí)發(fā)現(xiàn)，30 nm的nTiO2與Cd2+聯(lián)合暴露對(duì)綠藻的毒性效應(yīng)要大于Cd單獨(dú)存在時(shí)。Rosenfeldt等[15]研究發(fā)現(xiàn)nTiO2對(duì)重金屬銀、砷、銅的毒性影響與nTiO2的表面性質(zhì)有關(guān)。二氧化鈦有3種自然晶型，其中應(yīng)用最為廣泛的是銳鈦礦型和金紅石型[16]。我們實(shí)驗(yàn)室制備了晶型百分比有序變化的nTiO2[6]，研究了其對(duì)大型溞的急性毒性影響機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)研究了5種不同晶型nTiO2對(duì)銅的生物積累的影響，探索了 nTiO2的晶型對(duì)大型溞體內(nèi)金屬積累的影響機(jī)制，為納米材料的生態(tài)環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)安全評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法 (Material and methods)

1.1 nTiO2的制備與表征

nTiO2是實(shí)驗(yàn)室采用水熱法(高溫水解法)制備的銳鈦礦、金紅石2種材料，標(biāo)記為A-S和R-S。不同比例的A-S和R-S經(jīng)過(guò)物理方法均勻混合得到3種混合晶型，標(biāo)記為M1、M2、M3，其中銳鈦礦所占比例分別為80%、50%、20%，金紅石所占比例分別為20%、50%、80%[6]。將5種nTiO2加入到超純水(Millipore)中，震蕩并在超聲浴中超聲30 min配制成nTiO2濃度為1 g·L-1的懸浮液，利用透射電子顯微鏡(TEM，JEM-2100F，日本)對(duì)5種nTiO2進(jìn)行微觀結(jié)構(gòu)表征(圖1)，5種nTiO2的比表面積用BET方程計(jì)算得出[6]。

1.2 養(yǎng)殖用水和和暴露用水

養(yǎng)殖用水取自京密引水渠的頤和園段，定期監(jiān)測(cè)水體中的TOC、pH值和金屬元素。暴露用水采用簡(jiǎn)化的SM7配方水[17]，其成分為CaCl2(293.8 mg·L-1)、 MgSO4(123.3 mg·L-1)、 K2HPO4(0.184 mg·L-1)、 KH2PO4(0.143 mg·L-1)、 NaNO3(0.274 mg·L-1)、 NaHCO3(64.8 mg·L-1)、 Na2SiO3(10 mg·L-1)、 H3BO3(0.715 mg·L-1) 和 KCl (5.8 mg·L-1)，該配水的pH 值測(cè)得為 7.71±0.20。暴露之前利用SM7配方水將5種nTiO2懸浮液稀釋到1 mg·L-1，并超聲30 min以保持分散狀態(tài)。

1.3 nTiO2對(duì)Cu2+的吸附實(shí)驗(yàn)

用SM7將 1 g·L-1Cu2+標(biāo)準(zhǔn)液稀釋至Cu2+濃度為50 μg·L-1，加入適量1 g·L-1nTiO2懸浮液(5種材料各設(shè)3個(gè)平行樣)，使nTiO2溶液的濃度達(dá)到1 mg· L-1。將混合溶液放入25 ℃、100 r·min-1搖床中振蕩，在吸附15、30、45、60、90、120、150、180、240、360 min 分別取4 mL樣品，在12 000 ×g條件下離心10 min (在該高速離心下可以去除91.8%～95.0% nTiO2)[18]， 分別取2 mL上清液于5 mL離心管中，加入 20 μL HNO3， 用ICP-MS測(cè)Cu2+濃度。nTiO2對(duì)Cu2+的吸附量可以通過(guò)吸附開(kāi)始和吸附平衡后溶液中Cu2+濃度之差計(jì)算得到。

1.4 水生生物的培養(yǎng)與暴露

大型溞(Daphniamagna)為本實(shí)驗(yàn)室連續(xù)培養(yǎng)10年以上的單克隆品系，每只大型溞培養(yǎng)在至少10 mL過(guò)濾后的京密水中，培養(yǎng)溫度為 23.5 ℃，光照周期為亮:暗=16 h:8 h，光照強(qiáng)度7 000 lux，每天喂食萊茵衣藻 (Chlamydomonasreinhardtii)，每2天換一次水。正式實(shí)驗(yàn)之前，對(duì)6～24 h 的幼溞進(jìn)行敏感性實(shí)驗(yàn)，重鉻酸鉀的24 h半數(shù)致死濃度(24 h-EC50) 在 0.5～2 mg·L-1范圍內(nèi)為滿足毒性實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，方可用于正式實(shí)驗(yàn)(24 h-EC50為 0.75 mg·L-1)。實(shí)驗(yàn)前將出生14 d的大型溞放在SM7配方水中約2 h，以去除其腸道內(nèi)食物的殘留，同時(shí)適應(yīng)新的實(shí)驗(yàn)環(huán)境。

大型溞的暴露在500 mL大燒杯內(nèi)進(jìn)行，分別放入健康的14 d大型溞各50 只，Cu2+濃度為50 μg·L-1，5種nTiO2的暴露濃度均為1 mg·L-1，分別進(jìn)行有無(wú)nTiO2條件下的暴露，設(shè)3個(gè)平行樣。暴露采用靜態(tài)法，實(shí)驗(yàn)期間不換水，暴露時(shí)間均為48 h，暴露期間不取樣。暴露結(jié)束后，從存活的大型溞中選擇10只用于測(cè)定銅積累量和鈦積累量，用超純水沖洗3次，放入離心管中，在80 ℃下烘干至恒重，測(cè)量干重，將干燥恒重后的樣品轉(zhuǎn)移到消解管中，加入1 mL濃HNO3，消解至溶液澄清透明。加入1 mL硫酸和硫酸銨溶液，用適量2% HNO3溶液定容至10 mL，用ICP-MS測(cè)定樣品中Cu和Ti的濃度，根據(jù)干重，計(jì)算大型溞體內(nèi)銅和鈦的積累量，用μg·g-1dry wt干重表示。

1.5 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，利用One-way Anova分析各種指標(biāo)與對(duì)照組的差異顯著性。P<0.05，則認(rèn)為2個(gè)不同處理組之間存在顯著性差異。

2 結(jié)果 (Results)

2.1 nTiO2的表征

圖1為水中5種nTiO2的TEM圖，可以看出5種TiO2都為納米級(jí)材料，且都在水中發(fā)生了團(tuán)聚作用。5種nTiO2(A-S、M1、M2、M3、R-S)的比表面積分別為32.2、45.3、38.4、36.6、32.4 m2·g-1[6]。

2.2 nTiO2對(duì)Cu2+的吸附

5種不同晶型nTiO2材料對(duì)水體中Cu2+的吸附如圖2所示。根據(jù)上清液中Cu2+濃度的降低來(lái)確定nTiO2對(duì)Cu2+的吸附作用，可以看出，TiO2對(duì)水體中Cu2+的吸附過(guò)程很快，吸附30 min后就達(dá)到了吸附平衡，不同晶型nTiO2對(duì)Cu2+的吸附能力不同，nTiO2吸附Cu的能力大小：A-S > R-S > M2 > M3 >M1。銳鈦礦吸附的Cu量最高，這可能與銳鈦礦晶型的空間結(jié)構(gòu)有關(guān)。相對(duì)于正交的金紅石晶型，銳鈦礦的八面體有嚴(yán)重的扭曲，進(jìn)而導(dǎo)致其電子-空穴分離能力變強(qiáng)，含有較多的缺陷，包括一個(gè)表面羥基和一個(gè)化學(xué)吸附的水[19]。nTiO2的表面羥基可以和Cu2+發(fā)生交換作用從而吸附銅，因此A-S能更強(qiáng)地吸附Cu2+。

圖1 5種nTiO2的TEM圖注: (A) A-S, Anatase nTiO2; (B) M1, Anatase: Rutile=4:1 nTiO2; (C) M2, Anatase: Rutile=1:1 nTiO2; (D) M3, Anatase: Rutile=1:4 nTiO2, and (E) R-S, Rutile nTiO2.Fig. 1 TEM images of the morphological structure of the five nTiO2Note: (A) A-S, Anatase nTiO2; (B) M1, Anatase: Rutile=4:1 nTiO2; (C) M2, Anatase: Rutile=1:1 nTiO2; (D) M3, Anatase: Rutile=1:4 nTiO2, and (E) R-S, Rutile nTiO2.

圖2 5種不同晶型nTiO2材料對(duì)水體中Cu2+的吸附Fig. 2 Adsorption of Cu2+ onto TiO2 nanoparticles with different crystal forms

2.3 大型溞體內(nèi)的金屬積累

圖3是大型溞暴露48 h后體內(nèi)的Ti積累量和Cu積累量。圖3(a)中，大型溞在僅含nTiO2的暴露液中具有較高的鈦積累量，其中nTiO2攝入量最高的為A-S，相對(duì)于其他4種nTiO2，A-S可能更易進(jìn)入或者聚集在大型溞體內(nèi)。加入銅后nTiO2溶液中大型溞體內(nèi)鈦積累量顯著降低。Rosenfeldt等[15]在研究nTiO2對(duì)砷的生物影響時(shí)也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果，并指出大型溞體內(nèi)積累降低的原因是nTiO2對(duì) As 的快速吸附以及聚集沉降等過(guò)程。類似的，本實(shí)驗(yàn)中Cu2+的加入可能加劇了nTiO2的團(tuán)聚，以至于大型溞不能有效攝取這些nTiO2顆粒。圖3(b)中，與單獨(dú)銅暴露相比，M1和M2這2種nTiO2的存在使大型溞體內(nèi)Cu積累量顯著降低，這可能是由于受到金屬銅積累影響后,大型溞的攝食速率降低，從而減少了對(duì)nTiO2顆粒的攝食。其他3種晶型nTiO2的存在對(duì)銅積累沒(méi)有顯著影響。

3 討論 (Discussion)

3.1 大型溞體內(nèi)的金屬銅積累影響機(jī)制

圖3 大型溞體內(nèi)Ti積累量(A)和Cu積累量(B)注：數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差(n=3),不同字母(a、b、c)代表組間具有顯著差異。Fig. 3 The accumulation of Ti (A) and Cu (B)Note: the data were mean ± standard deviation (n = 3), different letters (a, b, c) represent significant differences between groups.

圖4 nTiO2和Cu共存時(shí)大型溞體內(nèi)銅積累量與nTiO2對(duì)Cu吸附量的相關(guān)關(guān)系(A);大型溞體內(nèi)銅積累量與鈦積累量的相關(guān)關(guān)系(B)Fig. 4 The relationship between Cu accumulation and Cu adsorption on nTiO2 in the coexistence of nTiO2 and Cu (A); the correlation between the Cu accumulation and Ti accumulation in D. magna (B)

圖5 大型溞體內(nèi)單位鈦積累量的銅積累量(A) ; nTiO2和Cu共存時(shí)大型溞體內(nèi)單位鈦積累量的銅積累量與nTiO2比表面積的相關(guān)關(guān)系(B) Fig. 5 Cu accumulation in unit Ti accumulation in D. magna (A); the relationship between Cu accumulation in unit Ti accumulation and of SBET of nTiO2 in the coexistence of nTiO2 and Cu (B)

為了深入研究大型溞體內(nèi)金屬的積累機(jī)制，我們分析了大型溞體內(nèi)的金屬積累量和二氧化鈦對(duì)銅吸附量的關(guān)系，結(jié)果如圖4所示。圖4 (A)中大型溞體內(nèi) Cu積累量和吸附在nTiO2上的Cu量存在正相關(guān)關(guān)系(r=0.82,P< 0.1)，即隨著nTiO2吸附的Cu量增加，大型溞體內(nèi) Cu積累量也增加。這說(shuō)明金屬銅的積累和納米材料對(duì)金屬銅的吸附作用密切相關(guān)。大型溞體內(nèi)金屬銅的來(lái)源主要有2種，一個(gè)是自由離子銅，一個(gè)是納米材料吸附的銅。當(dāng)Cu與nTiO2共存時(shí)，nTiO2能吸附Cu2+，導(dǎo)致自由Cu2+濃度降低，降低Cu的生物積累。另一方面，大型溞能吞食吸附了Cu的nTiO2顆粒，這會(huì)增加Cu的生物積累。這兩方面的原因都能導(dǎo)致大型溞不但能吸收水中的溶解性金屬銅，同時(shí)也使一部分nTiO2結(jié)合的金屬進(jìn)入到生物體內(nèi)[20]。

進(jìn)一步分析了大型溞體內(nèi) Ti積累量和Cu積累量的關(guān)系，圖4 (B)中發(fā)現(xiàn)二者之間存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系 (r=0.68,P< 0.05)，即Ti積累量越高，Cu積累量越低。這說(shuō)明大型溞體內(nèi)的Cu積累量不完全來(lái)源于nTiO2的吸附。類似地，F(xiàn)an等[21]在研究中也發(fā)現(xiàn)nTiO2降低了Cu積累，并指出共存體系中nTiO2使大型溞體內(nèi)Cu積累量顯著降低的原因可能是納米顆粒主要積累在大型溞的腸道內(nèi)，阻礙銅的吸收，也可能對(duì)大型溞的腸道造成損傷，降低腸道細(xì)胞的功能。因此，nTiO2與銅共存時(shí)大型溞的體內(nèi)鈦積累可能會(huì)阻礙銅的生物積累。

3.2 不同晶型nTiO2對(duì)銅積累的影響

為了進(jìn)一步比較不同晶型nTiO2對(duì)銅的影響，進(jìn)行了歸一化處理，計(jì)算了單位鈦積累量引起的銅積累量，結(jié)果如圖5所示，從圖中可以看出5種nTiO2中單位鈦積累量的銅積累量最高的是M1，其次為M2、M3、R-S，A-S最低。大型溞體內(nèi)金屬銅積累量的來(lái)源主要有自由離子銅和納米材料吸附的銅2種。單位鈦積累量一致時(shí)，大型溞體內(nèi)的銅積累量是由于自由Cu2+在體內(nèi)的富集，M1的單位鈦積累量的銅積累量最高，原因可能是M1在大型溞體內(nèi)積累對(duì)自由Cu2+進(jìn)入大型溞的阻礙能力最小。

為探討原因我們分析了單位鈦積累量的銅積累量與5種nTiO2比表面積之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)二者之間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系。類似的，Rosenfeldt等[22]在研究中發(fā)現(xiàn)nTiO2會(huì)減小Cu的毒性，可能是由于nTiO2比表面積和結(jié)構(gòu)引起nTiO2對(duì)Cu的吸附以及聚集沉降作用。Ni等[23]在研究時(shí)也發(fā)現(xiàn)氧化石墨烯存在條件下減少了銅的積累量，并指出原因可能是氧化石墨烯表面含氧基團(tuán)豐富，因而對(duì)重金屬離子的吸附能力較強(qiáng)，并且氧化石墨烯較易發(fā)生團(tuán)聚作用，因而降低了大型溞體內(nèi)的銅富集量。因此，本實(shí)驗(yàn)中nTiO2的比表面積越大，nTiO2的表面含氧基團(tuán)越多，nTiO2的羥基自由基(·OH)越易形成，從而nTiO2越易吸附銅離子，因此單位鈦積累量的銅積累量越高。因此，5種不同晶型nTiO2對(duì)銅的水生生物毒積累降低的主要原因，是受到5種nTiO2比表面積的影響，而比表面積這種材料性質(zhì)的差異主要是由于不同比例的銳鈦礦和金紅石的晶型結(jié)構(gòu)差異導(dǎo)致的。

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