張雅月+田劭丹+祁爍

[摘要] 目的 觀察健脾益氣攝血方及其拆方對辛伐他汀誘導(dǎo)斑馬魚心臟出血模型血流量的改善作用，探索不同治則對斑馬魚血流動力學(xué)的變化聯(lián)系。 方法 將660尾72 h受精卵黑色素等位基因突變型Albino品系斑馬魚隨機(jī)分為正常對照組、模型對照組和實(shí)驗(yàn)藥物A（健脾顆粒配方）、B（健脾益氣顆粒配方）、C（健脾益氣補(bǔ)血顆粒配方）、D（健脾益氣補(bǔ)血攝血顆粒配方）組。每種藥物設(shè)100、250、500、750、1000 μg/mL五個(gè)不同濃度組，每組30尾。先以A、B、C、D組不同濃度藥物處理斑馬魚4 h，再用50 μmol/L辛伐他汀處理30 min，用心跳血流分析系統(tǒng)采集各組20尾斑馬魚血流影像，分析血流量，計(jì)算改善率。 結(jié)果 ①與模型對照組比較，A、B組各藥物濃度組對辛伐他汀誘導(dǎo)的斑馬魚心臟出血模型的血流量改善均無效果；C、D組的500、750、1000 μg/mL藥物濃度均能提高斑馬魚出血模型血流量改善率（P < 0.05）。②在改善辛伐他汀誘導(dǎo)斑馬魚心臟出血模型血流速度和血流量改善率方面，健脾益氣補(bǔ)血攝血方1000 μg/mL優(yōu)于健脾益氣補(bǔ)血方。 結(jié)論 健脾益氣補(bǔ)血攝血治則綜合運(yùn)用能夠明顯提高辛伐他汀誘導(dǎo)斑馬魚心臟出血模型血流量改善率，體現(xiàn)了“氣為血之帥，血為氣之母”的氣血相關(guān)理論。

[關(guān)鍵詞] 健脾益氣攝血方；斑馬魚；心臟出血；血流量

[中圖分類號] R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）12（c）-0009-05

[Abstract] Objective To observe the effect of Invigorating Spleen， Benefiting Qi， Controlling Blood Formula on the blood flow of Simvastatin-induced zebrafish cardiac hemorrhage model and to explore the relationship among the hemodynamic changes of zebrafish by different treatment. Methods The fertilized egg of 660 72-hour Albino zebrafish in melanin allele mutation was randomly divided into the normal control group， the model control group and group A （Invigorating Spleen Granule Formulations）， B （Invigorating Spleen， Benefiting Qi Granule Formulations）， C （Invigorating Spleen， Benefiting Qi， Replenishing Blood Granule Formulations）， D （Invigorating Spleen， Benefiting Qi， Replenishing Blood， Controlling Blood Granule Formulations） with different concentrations （100， 250， 500， 750， 1000 μg/mL） of experimental drugs. Each group of 30. First， the zebrafish of group A， B， C， D were treated with different concentrations of drugs for 4 hours， and then with 50 μmol/L Simvastatin for 30 minutes. Next， through collecting blood flow imaging of the 20 zebrafish in each group by heartbeat blood flow analysis system， the blood flow was analyzed and the improvement rate was calculated. Results ①Compared with the model control group， different concentrations of drug groups in group A， B had no effects on the improvement of blood flow in Simvastatin-induced zebrafish hemorrhage model； however， 500， 750，1000 μg/mL of drugs in group C， D could significantly increase the improvement rate of blood flow in zebrafish hemorrhage model （P < 0.05）. ②In ameliorating the model's velocity of blood flow and its improvement rate， 1000 μg/mL of Invigorating Spleen， Benefiting Qi， Replenishing Blood， Controlling Blood Formula was superior to that of Invigorating Spleen， Benefiting Qi， Replenishing Blood Formula. Conclusion The comprehensive application of invigorating spleen， benefiting qi， replenishing blood， controlling blood can ameliorate the blood flow of Simvastatin-induced zebrafish cardiac hemorrhage model， which reflects the theory of “qi is the commander of blood and blood is the mother of qi”.endprint

[Key words] Invigorating Spleen， Benefiting Qi， Controlling Blood Formula； Zebrafish； Cardiac hemorrhage； Blood flow

血液是人體生命活動賴以生存的基本物質(zhì)，因而具有重要的生理功能。按照中醫(yī)理論，血液調(diào)控體現(xiàn)在血液的推動、貯藏、調(diào)節(jié)及統(tǒng)攝等方面。其中，推動和統(tǒng)攝功能為血液貯藏、調(diào)節(jié)提供保障。血液能夠正常循行于脈道，內(nèi)注五臟六腑，外滋四肢百骸，主要依賴氣的推動和固攝功能。氣的推動動力正常，血液才能運(yùn)行不息；氣的固攝功能正常，血液才能在脈管中循環(huán)不息，周而往復(fù)。如果推動和固攝功能失常就會出現(xiàn)血液瘀滯和血液外溢兩種病理結(jié)局[1-2]?；谥嗅t(yī)臟象理論，血液的推動、固攝與心脾功能密切相關(guān)，故有“心主血”“脾統(tǒng)血”的調(diào)控理論[3-4]。

在臨床實(shí)際中，推動與固攝血液循行脈道之中是心與脾功能的協(xié)調(diào)[5]，氣與血動態(tài)平衡，相互依賴，密切相關(guān)。因此，為驗(yàn)證這一理論在動物實(shí)驗(yàn)過程中的重現(xiàn)性[6]，并為臨床應(yīng)用提供指導(dǎo)，本研究選擇了研究周期短、可以直觀發(fā)現(xiàn)和測試血液動力學(xué)的斑馬魚為研究對象[7-8]，并在成功復(fù)制辛伐他汀誘導(dǎo)斑馬魚心臟出血的基礎(chǔ)上，觀察健脾益氣攝血方及其拆方對斑馬魚血液流速的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

自然成對交配繁殖的黑色素等位基因突變型Albino品系斑馬魚，共660尾，年齡為受精后3 d（72 h受精卵），飼養(yǎng)于28℃的養(yǎng)魚用水中（水質(zhì)：每1升反滲透水中加入200 mg速溶海鹽，電導(dǎo)率為480～510 μS/cm；pH為6.9～7.2；硬度為53.7～71.6 mg/L CaCO3）[9]。實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK（浙）2012-0171。杭州環(huán)特生物科技股份有限公司的斑馬魚實(shí)驗(yàn)室已通過國際實(shí)驗(yàn)動物評估和認(rèn)可管理委員會（AAALAC）完全認(rèn)證，認(rèn)證號：001458。

1.2 藥物與試劑

實(shí)驗(yàn)藥物與試劑如下，①顆粒配方：干預(yù)實(shí)驗(yàn)藥物分別為A組（健脾顆粒配方）、B組（健脾益氣顆粒配方）、C組（健脾益氣補(bǔ)血顆粒配方）、D組（健脾益氣補(bǔ)血攝血顆粒配方）。為排除人為因素影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究采用了盲法設(shè)計(jì)，將課題組主要人員依據(jù)實(shí)驗(yàn)需求擬定的中藥處方直接交付北京康仁堂制藥有限公司生產(chǎn)，所有藥物均按照顆粒劑工藝水提處理，并以A～D編號包裝后轉(zhuǎn)交實(shí)驗(yàn)人員，研究人員在嚴(yán)格盲態(tài)情況下實(shí)驗(yàn)并進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，并將統(tǒng)計(jì)結(jié)果轉(zhuǎn)交課題負(fù)責(zé)人與藥物制備人員，雙方依據(jù)藥物編號揭盲后確認(rèn)。A組：實(shí)驗(yàn)藥物為黨參、白術(shù)、茯苓、炙甘草顆粒組成的健脾顆粒配方；B組：實(shí)驗(yàn)藥物為黨參、白術(shù)、茯苓、炙甘草、黃芪顆粒組成的健脾益氣顆粒配方；C組：實(shí)驗(yàn)藥物為黨參、白術(shù)、茯苓、炙甘草、黃芪、阿膠顆粒組成的健脾益氣補(bǔ)血顆粒配方；D組：實(shí)驗(yàn)藥物為黨參、白術(shù)、茯苓、炙甘草、黃芪、阿膠、茜草顆粒組成的健脾益氣補(bǔ)血攝血顆粒配方。實(shí)驗(yàn)開始前用斑馬魚飼養(yǎng)水配制成濃度為20 mg/mL的母液。②辛伐他?。喊唏R魚出血模型誘導(dǎo)劑，白色粉末，批號為404-520-2，購自日本TCI公司，用100% DMSO配制成濃度50 mmol/L的儲備液，-20℃保存?zhèn)溆?。③甲基纖維素（Methyl cellulose），白色纖維狀，購自美國Sigma公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

解剖顯微鏡（SZX7，OLYMPUS，Japan）；與顯微鏡相連的相機(jī)（TK-C1481EC）；心跳血流分析系統(tǒng)（Zebralab3.3（PB2084C）；精密電子天平（CP214，OHAUS，America）。

1.4 方法

全部實(shí)驗(yàn)由杭州環(huán)特生物科技股份有限公司在盲態(tài)下進(jìn)行。利用隨機(jī)數(shù)字表法將660尾3dpf黑色素等位基因突變型Albino品系斑馬魚分為正常對照組、模型對照組和實(shí)驗(yàn)藥物A、B、C、D組。每種藥物設(shè)100、250、500、750、1000 μg/mL五個(gè)不同濃度組，每組30尾。先以A、B、C、D組不同濃度藥物處理斑馬魚4 h，再用50 μmol/L辛伐他汀處理30 min，用心跳血流分析系統(tǒng)采集各組20尾斑馬魚血流影像，分析血流量，計(jì)算改善率。血流量改善率（%）=[（實(shí)驗(yàn)藥物組-模型對照組）/（正常對照組-模型對照組）]×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或非參數(shù)檢驗(yàn)，多組組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 斑馬魚出血模型判定

光學(xué)顯微鏡下觀察心臟出血情況，當(dāng)發(fā)現(xiàn)心臟部位有不同程度出血點(diǎn)或出血斑塊時(shí)，即可判定斑馬魚心臟出血模型成功[9]。辛伐他汀誘導(dǎo)的斑馬魚心臟出血鏡下圖見圖1。

2.2 對斑馬魚心臟出血模型血流量的影響

2.2.1 A組各濃度對斑馬魚心臟出血模型血流量的影響 與正常對照組比較，模型對照組血流速度明顯降低（P < 0.05）；與模型對照組比較，A組各濃度組對斑馬魚血流量無明顯改善作用，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表1。

2.2.2 B組各濃度對斑馬魚心臟出血模型血流量的改善作用 與正常對照組比較，模型對照組血流速度明顯降低（P < 0.05）；與模型對照組比較，B組各濃度組對斑馬魚血流量無明顯改善作用，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表2。

2.2.3 C組各濃度對斑馬魚心臟出血模型血流量的改善作用 與模型對照組比較，C組的500、750、1000 μg/mL藥物濃度組均能明顯提高斑馬魚出血模型血流量改善率（P < 0.05），1000 μg/mL藥物濃度組血流量改善效果最佳。見表3。endprint

2.2.4 D組各濃度對斑馬魚心臟出血模型血流量的改善作用 與模型對照組比較，D組的250、500、750、1000 μg/mL藥物濃度組均能提高斑馬魚出血模型血流量改善率（P < 0.05），以1000 μg/mL藥物濃度組改善效果最佳。見表4。

2.3 兩種有效配方對斑馬魚心臟出血模型血流量影響比較

上述研究已經(jīng)證實(shí)，C、D組藥物能夠明顯改善斑馬魚心臟出血情況，為進(jìn)一步探索兩方存在的優(yōu)勢，本研究對健脾益氣補(bǔ)血顆粒配方、健脾益氣補(bǔ)血攝血顆粒配方中500、750、1000 μg/mL三個(gè)濃度對斑馬魚血流量的改善效果進(jìn)行了比較，結(jié)果見表5。從表5可以看出，C、D兩組組間500、750、1000 μg/mL三個(gè)藥物濃度組比較，僅1000 μg/mL差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。提示高濃度的D組配方能提高辛伐他汀誘導(dǎo)斑馬魚心臟出血模型血流速度和血流量改善率效應(yīng)。

3 討論

血流量又稱血流的容積速度，是指單位時(shí)間內(nèi)流經(jīng)血管某一截面的血量。血流量的大小與血管兩端的壓力差成正比，與血管對血流的阻力成反比。因心血管為一密閉的管道系統(tǒng)，流經(jīng)動脈、毛細(xì)血管和靜脈各段血管的總截面的血流量相等。

動脈血流速度隨著心縮和心舒而波動，心室收縮時(shí)血流加快，舒張時(shí)血流變慢。例如，馬的頸動脈血流速度，心臟收縮與心臟舒張時(shí)差異很大。這種波動幅度在小動脈管即逐漸變小，到了毛細(xì)血管，流速的波動即不明顯，靜脈的血流則始終表現(xiàn)均勻。因此，測定人類或大動物的血流量常采用靜脈。而斑馬魚體積很小[10-12]，不易分離動靜脈系統(tǒng)，測定靜脈血流量非常困難。因此，在該項(xiàng)研究中，我們采用了心跳血流分析系統(tǒng)采集斑馬魚血流影像，分析血流量，并計(jì)算血流量改善率。

利用血流量測定技術(shù)可以明確判定實(shí)驗(yàn)動物整體血液流動狀態(tài)，并能夠判斷實(shí)驗(yàn)動物的生理功能常態(tài)和病理現(xiàn)象，同時(shí)，能夠?yàn)樗幚韺W(xué)研究提供療效信息。通過分析本研究數(shù)據(jù)，可以看到：①與模型對照組比較，A、B組各藥物濃度組對辛伐他汀誘導(dǎo)的斑馬魚心臟模型的血流量均無明顯改善效果。其中，B組高濃度（1000 μg/mL）顯示有提高血流量改善率的趨勢。②與模型對照組比較，C、D組的500、750、1000 μg/mL藥物濃度組均能明顯提高斑馬魚出血模型血流量改善率（P < 0.05），以1000 μg/mL藥物濃度組血流量改善效果最佳。③C、D組組間500、750、1000 μg/mL三個(gè)藥物濃度組血流量改善率比較，僅1000 μg/mL具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P < 0.05），提示D組高濃度在改善辛伐他汀誘導(dǎo)斑馬魚心臟出血模型血流速度和血流量改善率優(yōu)于C組。

氣血都是人體生命活動的基本物質(zhì)[13]，氣血相輔相成、動態(tài)平衡是人體各種功能活動的根本保障[14]。氣與血的關(guān)系可以概括為“氣為血之帥，血為氣之母”。前者講的是氣能生血[15]，也能夠行血；后者講的是血能載氣，亦能化氣[16-17]。研究發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀誘導(dǎo)的斑馬魚出血模型的血流量降低、運(yùn)動速度減緩等類似于中醫(yī)氣血兩虛、氣不攝血證候特點(diǎn)[18]。基于氣血相關(guān)理論，對上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能的解釋如下：①健脾和健脾益氣顆粒配方不能提高斑馬魚出血模型血流量改善率，可以用“氣為血之帥”“有形之血不能速生”理論來解釋，即單純益氣而非補(bǔ)血勢必形成“氣無所依”“氣無載體”“氣無所推”[19]的功能缺陷狀態(tài)。②健脾益氣補(bǔ)血與健脾益氣補(bǔ)血攝血顆粒配方能夠提高斑馬魚心臟出血模型血流改善率，可以用“血為氣之母”以及“血即可載氣運(yùn)行”“氣可推運(yùn)血行”理論來解釋[20]。③關(guān)于健脾益氣補(bǔ)血攝血顆粒配方在改善辛伐他汀誘導(dǎo)斑馬魚心臟出血模型血流速度和血流量改善率優(yōu)于健脾益氣補(bǔ)血顆粒配方的解釋，與茜草密切相關(guān)。茜草除具有止血功效外，還具有“祛瘀”功效。祛瘀可暢通脈道，促進(jìn)血流，故而能提高辛伐他汀誘導(dǎo)斑馬魚出血模型的血流量。

健脾方和健脾益氣方雖可補(bǔ)氣，但無血藥，不能體現(xiàn)“血能載氣”的中醫(yī)理論，因而氣不能有效攝血。按照中醫(yī)氣血相關(guān)理論，補(bǔ)氣即能生血，但因?qū)嶒?yàn)周期較短，有形之血不能速生；健脾益氣補(bǔ)血方與健脾益氣攝血方既能益氣又能補(bǔ)血，體現(xiàn)了“氣為血之帥，血為氣之母”的氣血相關(guān)理論，因而止血效果良好；健脾益氣攝血方中茜草具有的“祛瘀、通經(jīng)”功效能夠疏通血管，暢調(diào)血液，不但可以加強(qiáng)健脾益氣攝血方的攝血效果，也是發(fā)揮止血功效的載體；健脾益氣補(bǔ)血方、健脾益氣攝血方能夠顯著改善心臟出血斑馬魚血流量，進(jìn)一步驗(yàn)證了氣血相關(guān)理論和應(yīng)用價(jià)值。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 張金生，張寶霞，朱慧芳，等.干細(xì)胞、微環(huán)境與活血化瘀[J].中國組織工程研究，2016，20（23）：3484-3490.

[2] 郝晶明，郭思蘭.中藥治療小兒過敏性紫癜略述[J].中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育，2013，11（17）：117-118.

[3] 李天天，褚雨霆，楊璐，等.脾主統(tǒng)血理論的內(nèi)涵與拓展[J].中醫(yī)藥信息，2015，32（6）：99-102.

[4] 潘光明，盛小剛，吳瑜，等.“心脾相關(guān)”理論源流探討[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2011，9（6）：744-745.

[5] 沈真真，李運(yùn)倫.“損其心者調(diào)其營衛(wèi)”治則的探討[J].中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育，2014，12（8）：11-13.

[6] 陳志爐，周郁鴻.中醫(yī)藥治療免疫性血小板減少癥臨床研究概況[J].浙江中醫(yī)雜志，2012，47（4）：304-305.

[7] 辛勝昌，趙艷秋，李松，等.斑馬魚模型在藥物篩選中的應(yīng)用[J].遺傳，2012，34（9）：1144-1152.

[8] 王佑華，黎晌，楊彬睿，等.斑馬魚模型在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用現(xiàn)狀[J].中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào)，2012，10（11）：1189-1197.

[9] Chu Y，Zhang L，Zhu X，et al. Investigation of hemostatic effect of Spleen-invigorating，Qi-replenishing and Blood-arresting Formula on simvastatin-induced zebrafish hemorrhage model [J]. Journal of Traditional Chinese Medical Sciences，2016，3（4）：226-233.endprint

[10] 李輝輝，黃萍，董巍，等.斑馬魚研究走向生物醫(yī)學(xué)[J].遺傳，2013，35（4）：410-420.

[11] 鐘敏.斑馬魚造血調(diào)控因子的研究進(jìn)展[J].國際輸血及血液學(xué)雜志，201l，34（1）：70-74.

[12] 李春梅.淫羊藿苷減輕阿伐他汀誘導(dǎo)的斑馬魚顱內(nèi)出血[J].遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，37（2）：181-182，187.

[13] 紀(jì)云西，黃貴華，蔣歷，等.脾之“運(yùn)與化”淺析[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2013，24（2）：454-455.

[14] 周雪明，姜德友.國醫(yī)大師張琪以氣血為綱辨治疑難雜病[J].長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，31（4）：704-706.

[15] 陳素美.近二十年對中醫(yī)脾生理功能的現(xiàn)代研究進(jìn)展[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2010，16（4）：348-351.

[16] 溫洋洋，謝苗，郭選賢，等.對關(guān)幼波氣血辨證的思考[J].光明中醫(yī)，2015，30（10）：2093-2094.

[17] 褚雨霆，陳信義，李天天，等.運(yùn)用脾統(tǒng)血理論指導(dǎo)免疫性血小板減少性紫癜臨床治療[J].中華中醫(yī)藥雜志，2016， 31（4）：1170-1172.

[18] 李天天，褚雨霆，劉慶，等.中醫(yī)藥治療免疫性血小板減少性紫癜優(yōu)勢與問題分析[J].遼寧中醫(yī)雜志，2015，42（1）：9-11.

[19] 紀(jì)云西，黃貴華，蔣歷，等.脾之“運(yùn)與化”淺析[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2013，24（2）：454-455.

[20] Li T，He H，Hou L，et al. Regulation of non-classical immune parameters in immunethrombocytopenic purpura mice by a spleen-invigorating，qi-replenishing and blood-containing formula [J]. Journal of Traditional Chinese Medical Sciences，2015，2（2）：91-98.

（收稿日期：2017-09-05 本文編輯：張瑜杰）endprint