吳植+顧玲玲+朱善元+王安平

摘要：利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行Ⅰ型鴨甲型肝炎病毒蛋白水解酶3C基因的表達(dá)研究。首先通過PCR方法擴(kuò)增出3C基因，亞克隆至桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBac1中，獲得重組轉(zhuǎn)座載體pFB-3C，隨后將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH10Bac進(jìn)行同源重組，經(jīng)藍(lán)白斑篩選及PCR鑒定后，獲得重組桿狀病毒穿梭質(zhì)粒rBacmid-3C，將其在脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細(xì)胞，獲得重組桿狀病毒rBac-3C，并進(jìn)行重組蛋白表達(dá)的檢測。間接免疫熒光結(jié)果，鴨抗全病毒陽性血清能夠與重組蛋白發(fā)生特異性結(jié)合。結(jié)果表明，DHAV-Ⅰ 3C蛋白在sf9昆蟲細(xì)胞中獲得了成功表達(dá)。

關(guān)鍵詞：Ⅰ型鴨甲型肝炎病毒；3C基因；昆蟲細(xì)胞；表達(dá)

中圖分類號： S858.32文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2017）23-0033-02

鴨甲型肝炎病毒（duck hepatitis A virus，DHAV）主要侵害4周齡之內(nèi)雛鴨，引起一種急性高度接觸致死性烈性傳染病，以角弓反張和肝臟病變?yōu)橹饕卣鳎?周齡以內(nèi)的雛鴨病死率接近100%，嚴(yán)重危害我國養(yǎng)鴨業(yè)。DHAV可分為3種血清型，分別為DHAV-Ⅰ（經(jīng)典的DHV-Ⅰ）[1]、DHAV-Ⅱ（新發(fā)現(xiàn)于臺灣的血清型）[2]、DHAV-Ⅲ（新發(fā)現(xiàn)于中國和韓國的血清型）[3-4]，3個血清型之間存在明顯的差異，無交叉免疫性。目前，我國DHAV-Ⅰ流行較普遍，對養(yǎng)鴨業(yè)危害最大。

DHAV-Ⅰ為小RNA病毒科的成員，具有小RNA病毒的基本結(jié)構(gòu)，整個基因組分為3個部分：5′非編碼區(qū)（untranslated region，UTR），1個編碼多聚蛋白的開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF）和3′非編碼區(qū)（3′UTR），3′UTR之后是poly（A）尾。ORF編碼的聚合蛋白分為1個結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)（P1）和2個非結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)（P2、P3），結(jié)構(gòu)蛋白P1在病毒自身編碼的蛋白酶的作用下可以水解成VP0、VP1、VP3 3種衣殼蛋白；P2區(qū)可以裂解為2A1、2A2（2A3）、2B、2C 4種或5種非結(jié)構(gòu)蛋白；P3區(qū)又可以裂解為3A、3B、3C、3D 4種非結(jié)構(gòu)蛋白。其中3C蛋白是一種蛋白水解酶，在多聚蛋白的水解以及病毒的復(fù)制、形成過程中發(fā)揮重要作用[5-6]。本研究利用桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)DHAV-Ⅰ 3C基因，為3C蛋白的開發(fā)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1載體、菌株和毒株

DHAV-Ⅰ SH株由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所惠贈；感受態(tài)細(xì)胞DH10Bac、DH5α、桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBac1、含有目的基因的重組質(zhì)粒pET-3C均由江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點實驗室制備并保存。

1.2工具酶和試劑

轉(zhuǎn)染試劑Cellfectin Ⅱ Reagent購自Invitrogen公司；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、pfu DNA聚合酶購自Fermentas公司；FITC標(biāo)記的羊抗鴨IgG購自KPL公司；異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）、氨芐青霉素（Amp）、卡那青霉素（Kan）、四環(huán)霉素（Tet）、慶大霉素（Gen）購自Sigma公司；昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基Sf-900 Ⅱ SFM（serum free medium）購自GBICO公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純級。

1.3引物的合成

根據(jù)GenBank中DHAV-1 SH株病毒全基因組序列（登錄號FJ157178），設(shè)計1對特異性引物以擴(kuò)增其開放閱讀框，并在上下游引物5′端分別引入BamHⅠ、XhoⅠ酶切位點，3C-F：5′-TATGGATCCATGAGCGGGCGGGTGAATTTCAGAC-3′（BamHⅠ酶切位點），3C-R：5′-CGCCTCGAGTTATTGG TTAAAAACTGGAAAAACC-3′（XhoⅠ酶切位點），通用引物M13序列參照桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)操作說明書設(shè)計。引物均由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。

1.43C基因的擴(kuò)增

以含有目的基因的重組質(zhì)粒pET-3C為模板高保真PCR擴(kuò)增3C基因。50 μL擴(kuò)增體系：pfu DNA Polymerase 1 μL、10×Buffer 5 μL、Primer F 1 μL、Primer R 1 μL、dNTP（2 mmol/L）5 μL、DNA 1 μL、DDW 36 μL。反應(yīng)程序為 94 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃變性 20 s，52 ℃退火20 s，72 ℃延伸 90 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5重組轉(zhuǎn)座載體pFB-3C的構(gòu)建

將回收的PCR產(chǎn)物及桿狀病毒載體pFastBac1分別用XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切后，回收3C基因片段及線性化的載體，T4連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5α。挑取單菌落，提取質(zhì)粒，XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定。重組子命名為pFB-3C。

1.6質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)座

參照Invitrogen公司的桿狀病毒操作流程說明書，將重組質(zhì)粒pFB-3C轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH10Bac，均勻涂布于含有IPTG、X-Gal的LB平板上（含慶大霉素、卡那霉素和四環(huán)素），37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，直至藍(lán)白斑出現(xiàn)。隨機挑取數(shù)個白色菌落，堿裂法提取質(zhì)粒DNA，用引物M13進(jìn)行PCR鑒定。PCR產(chǎn)物用0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.7重組桿狀病毒rBac-3C的制備

將提取的重組桿粒rBacmid-3C和野生型Bacmid DNA參照轉(zhuǎn)染試劑說明書轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞sf9。轉(zhuǎn)染后約72 h，待細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變、細(xì)胞變大時，收集細(xì)胞上清，即為P1代 rBac-3C，4 ℃避光保存?zhèn)溆?。參照Invitrogen公司的桿狀病毒操作流程說明書，將P1代重組桿狀病毒在sf9昆蟲細(xì)胞上進(jìn)行擴(kuò)增，直至P3代，并利用空斑試驗測定P3代rBac-3C的病毒滴度。endprint

1.8表達(dá)產(chǎn)物的間接免疫熒光鑒定

將P3代rBac-3C按MOI為5感染24孔板中處于對數(shù)生長期的sf9細(xì)胞，72 h后，棄去上清，用預(yù)冷的冷丙酮固定20 min，PBS洗滌3次，用5% BSA室溫封閉1 h，加入鴨抗全病毒血清（1 ∶100），37 ℃孵育2 h后，PBST洗滌3次后，加入FITC標(biāo)記的羊抗鴨IgG（1 ∶100），37 ℃孵育30 min，PBST洗滌3次后，在熒光倒置顯微鏡下觀察特異性熒光。

2結(jié)果與分析

2.1目的基因的克隆

高保真PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，可見1條大小約為580 bp的目的條帶（圖1），與預(yù)期值一致。

2.2重組轉(zhuǎn)座載體pFB-3C的構(gòu)建與鑒定

3C基因經(jīng)XhoⅠ和BamHⅠ酶切后插入經(jīng)同樣酶切的pFastBac1，XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定，結(jié)果出現(xiàn)約580 bp和4 800 bp的2條條帶（圖2），與預(yù)期結(jié)果相符。

2.3重組Bacmid的篩選與鑒定

用M13引物對重組Bacmid進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果rBacmid-3C的擴(kuò)增條帶大小約為2 900 bp，與預(yù)期片段大小相符（圖3），說明3C基因轉(zhuǎn)座成功。

2.4表達(dá)產(chǎn)物的間接免疫熒光檢測

以鴨抗全病毒血清為一抗對昆蟲細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行間接免疫熒光檢測，從圖4可以看出，rBac-3C感染的昆蟲細(xì)胞胞漿內(nèi)有大量特異性熒光出現(xiàn)，而野生型桿狀病毒感染的細(xì)胞內(nèi)則未觀察到。

3討論

鴨甲型肝炎病毒屬于小RNA病毒科禽肝炎病毒屬。3C蛋白是小RNA病毒的自身蛋白水解酶之一，能夠正確水解多種前體蛋白，從而保證了衣殼的形成。3C蛋白酶不但能夠水解自身的前體多聚蛋白，還能水解宿主細(xì)胞內(nèi)的蛋白，包括一些細(xì)胞的骨架蛋白、翻譯因子、固有免疫信號分子等，從而抑制宿主蛋白的功能發(fā)揮，保證了病毒蛋白有效逃避固有免疫的監(jiān)控，在病毒顆粒的穿入和釋放中發(fā)揮重要的作用[7]。

Bac-to-Bac系統(tǒng)作為桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)己被廣泛使用，且己被商業(yè)化。Bac-to-Bac系統(tǒng)主要利用Luckow等研發(fā)的基因轉(zhuǎn)座技術(shù)而形成[8]。該系統(tǒng)優(yōu)點是可以高效獲得重組桿狀病毒，效率可達(dá)100%，避免了以前采用同源重組機制獲得重組桿狀病毒效率較低的問題。與原核表達(dá)系統(tǒng)相比，該系統(tǒng)具有蛋白質(zhì)翻譯后修飾所必需的酶系統(tǒng)，能對外源蛋白進(jìn)行糖基化、磷酸化和信號肽切除等翻譯后加工修飾，從而保留表達(dá)蛋白的生物學(xué)活性[9]。

本研究利用桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)成功制備了表達(dá)3C蛋白的重組桿狀病毒，間接免疫熒光結(jié)果顯示，陽性鴨抗全病毒血清能與重組蛋白3C發(fā)生特異性結(jié)合，說明重組蛋白3C具有良好的反應(yīng)原性，由于是首次利用該系統(tǒng)表達(dá)3C蛋白，后續(xù)將從優(yōu)化密碼子角度出發(fā)提高重組蛋白的表達(dá)量，為3C功能的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Wang L，Pan M，F(xiàn)u Y，et al. Classification of duck hepatitis virus into threegenotypesbased on molecular evolutionary analysis[J]. Virus

Genes，2008，37（1）：52-59.

[2]Tseng C H，Knowles N J，Tsai H J. Molecular analysis of duck hepatitis virus type 1 indicates that it should be assigned to a new genus[J]. Virus Research，2007，123（2）：190-203.

[3]Kim M C，Kwon Y K，Joh S J，et al. Recent korean isolates of duck hepatitis virus reveal the presence of a new geno- and serotype when compared to duck hepatitis virus type 1 type strains[J]. Archives of Virology，2007，152（11）：2059-2072.

[4]Kim M C，Kwon Y K，Joh S J，et al. Differential diagnosis between type-specific duck hepatitis virus type 1 （DHV-1） and recent Korean DHV-1-like isolates using a multiplex polymerase chain reaction[J]. Avian Pathology，2008，37（2）：171-177.

[5]Ding C Y，Zhang D B. Molecular analysis of duck hepatitis virus type 1[J]. Virology，2007，361（1）：9-17.

[6]張艷芳，羅薇，劉內(nèi)生，等. 鴨肝炎病毒的研究進(jìn)展[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2011，38（7）：171-175.

[7]劉艷，李冰清，孟紅. 小RNA病毒3C蛋白酶及其裂解底物[J]. 生物技術(shù)通報，2014（8）：46-51.

[8]Luckow V A，Lee S C，Barry G F，et al. Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli[J]. Journal of Virology，1993，67（8）：4566-4579.

[9]Altmann F，Staudacher E，Wilson I B，et al. Insect cells as hosts for the expression of recombinant glycoproteins[J]. Glycoconjugate Journal，1999，16（2）：109-123.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)2017年第45卷第23期王蘭萍，崔悅，馬蕊，等. 灘羊群體產(chǎn)羔性狀相關(guān)基因位點的遺傳變異分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（23）：35-37.endprint