薛凱+王榮+王友富+李良智+胡翠英+扶教龍

摘要：為獲得轉(zhuǎn)化底物植物甾醇為9-羥基-雄烯二酮（簡(jiǎn)稱9-OH-AD）的高產(chǎn)穩(wěn)定菌株，將出發(fā)菌株分枝桿菌制備成原生質(zhì)體，并對(duì)其原生質(zhì)體進(jìn)行定向紫外誘變篩選。結(jié)果表明，NaCl為最佳的分枝桿菌原生質(zhì)體滲透穩(wěn)定劑，最適濃度為0.5 mol/L，在此條件下獲得的原生質(zhì)體數(shù)量為3.1×108個(gè)/mL，且最終獲得1株比出發(fā)菌株9-OH-AD生產(chǎn)量提高84.7%的菌株MS23，經(jīng)傳代3次，9-OH-AD的積累量分別為37.32、41.64、38.77 mg/L，具有良好的遺傳穩(wěn)定性。產(chǎn)品通過液相色譜進(jìn)行確證，同時(shí)在5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行轉(zhuǎn)化制備9-OH-AD的初步研究。經(jīng)原生質(zhì)體紫外誘變獲得的遺傳性穩(wěn)定的9-OH-AD高產(chǎn)菌株可用于進(jìn)一步的轉(zhuǎn)化制備條件優(yōu)化研究。

關(guān)鍵詞：分枝桿菌；原生質(zhì)體誘變；9-OH-AD；菌種選育；液相色譜

中圖分類號(hào)： S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2017）23-0288-04

收稿日期：2016-09-16

國(guó)內(nèi)外以甾醇為原料、利用分枝桿菌等微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)9-OH-AD已成為研究熱點(diǎn)。例如Shtratnikova等已測(cè)出能夠轉(zhuǎn)化植物甾醇為9-OH-AD的分枝桿菌VKM Ac-1817D的完整基因序列[4]；姚抗深入研究了微生物降解甾醇中與 9-OH-AD的合成和降解相關(guān)的2個(gè)關(guān)鍵酶（3-甾酮-9α-羥基化酶與3-甾酮-Δ1-脫氫酶）[5]；袁家代等通過構(gòu)建kshA和kshB基因共表達(dá)的重組菌對(duì)3-甾酮-9α-羥基化酶編碼基因進(jìn)行異源表達(dá)，成功對(duì)分枝桿菌生物轉(zhuǎn)化特性進(jìn)行了改造，制備獲得了9-OH-AD[6]；范書玥等從土壤中篩選出具備甾醇降解能力的分枝桿菌（Mycobacterium sp. NwIB-01），對(duì)該菌的3-甾酮-9α-羥基化酶進(jìn)行了基因克隆、異源表達(dá)與分離純化，為進(jìn)一步利用基因工程手段改造分枝桿菌菌株，提高其轉(zhuǎn)化甾醇的能力從而為利用基因工程菌進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)9-OH-AD等奠定了基礎(chǔ)[7-8]。此外，Sukhodolskaya等研究表明，主產(chǎn)9-OH-AD的同時(shí)由于殘余的3-甾酮-Δ1-脫氫酶的存在，也會(huì)有部分的降解發(fā)生[9]。因此，田琳等通過同源重組用體外突變失活的3-甾酮-Δ1-脫氫酶基因代替分枝桿菌染色體上正常的3-甾酮-Δ1-脫氫酶基因，導(dǎo)致整個(gè)3-甾酮-Δ1-脫氫酶基因失活，以讓3-甾酮-Δ1-脫氫酶無(wú)法表達(dá)，從而使9-OH-AD得以積累[10]。另一方面，9-OH-AD的生產(chǎn)存在甾醇水溶性差、傳質(zhì)效率低、底物毒害、產(chǎn)物抑制以及產(chǎn)物降解等問題，許多研究者也做了大量相關(guān)的研究[11-14]?？傮w而言，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)生物法制備9-OH-AD的工業(yè)生產(chǎn)，篩選并獲得制備9-OH-AD的高效菌株具有重要的工業(yè)意義。

為此，本研究對(duì)實(shí)驗(yàn)室已有的分枝桿菌進(jìn)行原生質(zhì)體紫外誘變系統(tǒng)研究，確定分枝桿菌原生質(zhì)體的制備條件，并比較篩選得到的菌株制備生產(chǎn)9-OH-AD的能力，獲得1株生產(chǎn)轉(zhuǎn)化能力較好的菌株，最后用該菌株在5-L生物反應(yīng)器中進(jìn)行轉(zhuǎn)化制備9-OH-AD的初步研究。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1試驗(yàn)菌株出發(fā)菌株分枝桿菌（Mycobacterium sp.）于筆者所在實(shí)驗(yàn)室4 ℃冰箱中斜面保藏。

1.1.2試劑植物甾醇，由浙江省神洲藥業(yè)有限公司提供；玉米漿，購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；溶菌酶，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酵母粉為生化試劑；甘油、K2HPO4、MgSO4·7H2O、NH4Cl、NaNO3、（NH4）2HPO4、無(wú)水乙醇、Na2HPO4、NaH2PO4、乙二胺四乙酸（EDTA）、NaCl、KCl、MgSO4、蔗糖、甘露醇、乙酸乙酯等試劑均為分析純。

預(yù)處理液：0.8% EDTA、0.1%巰基乙醇，用pH值為6.0的磷酸緩沖液配制。

原生質(zhì)體滲透穩(wěn)定劑：0.5 mol/L蔗糖、10.0 mmol/L MgCl2，用pH值為6.0的磷酸緩沖液溶解。

分枝桿菌去壁酶液：含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的溶菌酶的原生質(zhì)體滲透穩(wěn)定劑，微孔濾膜過濾除菌。

1.1.3儀器SPX-250BSH-II生化培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）；高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫科技公司）；BIOTECH-5JG-7000A 5 L發(fā)酵罐（上海保興生物設(shè)備工程有限公司）；PHS-3TC pH電極（上海天達(dá)儀器有限公司）；YXQ-LS-50SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器滅菌鍋（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）；TS2102搖床（上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司）；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）；SA224S電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]、TGL-20M離心機(jī)（上海盧湘離心機(jī)儀器有限公司）。

1.1.4培養(yǎng)基固體/斜面培養(yǎng)基：酵母粉5.0 g/L、甘油10.0 g/L、磷酸氫二鉀0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、氯化銨1.0 g/L、瓊脂20.0 g/L，pH值為7.4。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖6.0 g/L、甘油2.0 g/L、硝酸鈉 5.4 g/L，磷酸氫二銨0.6 g/L，酵母粉 15.0 g/L，pH值為 7.5～8.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米漿20.0 g/L，硝酸鈉5.4 g/L，磷酸氫二銨0.6 g/L，無(wú)水乙醇10.0 mL/L，植物甾醇5.0 g/L，pH值為8.0～8.5。

再生高滲培養(yǎng)基：酵母粉5.0 g/L，甘油10.0 g/L，磷酸氫二鉀0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，氯化銨1.0 g/L，蔗糖 0.8 mol/L，瓊脂20.0 g/L，pH值為7.4。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1原生質(zhì)體滲透穩(wěn)定劑的選擇分別配制NaCl、KCl、MgSO4、蔗糖、甘露醇濃度為0.7 mol/L的再生高滲培養(yǎng)基，將誘變菌株分別涂于各再生高滲培養(yǎng)基上，每個(gè)處理3個(gè)平行，于30 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后，根據(jù)高滲培養(yǎng)基中原生質(zhì)體的制備數(shù)確定最佳原生質(zhì)體滲透穩(wěn)定劑。endprint

1.2.2原生質(zhì)體滲透穩(wěn)定劑NaCl濃度的確定配制NaCl濃度分別為0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mol/L的再生高滲培養(yǎng)基，將誘變菌株分別涂于各濃度再生高滲培養(yǎng)基上，每個(gè)濃度3個(gè)平行，于30 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后，根據(jù)各高滲培養(yǎng)基中原生質(zhì)體的制備數(shù)確定最適NaCl濃度。

1.2.3細(xì)胞懸液制備及原生質(zhì)體的制備與再生用接種環(huán)在斜面培養(yǎng)基上刮取1環(huán)菌體，接種于種子培養(yǎng)基上，于 30 ℃、200 r/min搖床上振蕩培養(yǎng)48 h后，取 10 mL 種子液，4 000 r/min 離心10 min，用滲透壓穩(wěn)定劑洗滌2次，將菌體懸浮于10 mL滲透壓穩(wěn)定劑中制備成細(xì)胞懸液。取1 mL細(xì)胞懸液稀釋至10-6，用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)細(xì)胞懸液濃度。原生質(zhì)體誘變參考相關(guān)文獻(xiàn)[15]并加以改進(jìn)。取5 mL細(xì)胞懸液，4 000 r/min 離心10 min，棄上清液，加入5 mL預(yù)處理液，靜置15 min，用滲透壓穩(wěn)定劑洗滌2 次，離心10 min棄上清液，然后加入5 mL 1%溶菌酶液，30 ℃振蕩保溫2 h，2 000 r/min 離心10 min后，加入5 mL滲透穩(wěn)定劑懸浮原生質(zhì)體。取 0.5 mL 原生質(zhì)體懸液，加入4.5 mL滲透穩(wěn)定劑稀釋至10-6，涂布于再生高滲培養(yǎng)基培養(yǎng)計(jì)數(shù)。另取0.5 mL原生質(zhì)體懸液，加入4.5 mL無(wú)菌水，稀釋至10-6后，用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)計(jì)數(shù)。

1.2.4紫外誘變將制備好的原生質(zhì)體用滲透壓穩(wěn)定劑稀釋至10-6，取0.2 mL涂布于再生高滲培養(yǎng)基表面，置于已預(yù)熱30 min 20 W紫外燈下，照射距離為30 cm。磁力攪拌下分別照射20、40、60、80、100、120、140、160、180 s，每個(gè)時(shí)間3個(gè)平行，30 ℃下倒置遮光培養(yǎng)1周。觀察菌落形態(tài)，統(tǒng)計(jì)平板中的菌落數(shù)量，計(jì)算致死率，以未經(jīng)誘變處理的菌懸液涂布平板作對(duì)照。

1.2.5固體斜面培養(yǎng)將菌株活化擴(kuò)培于30 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d，紫外誘變?cè)偕鷿B透培養(yǎng)基中菌株生長(zhǎng)培養(yǎng)7 d。

1.2.6搖瓶轉(zhuǎn)化試驗(yàn)挑取1環(huán)菌種接種于裝發(fā)酵培養(yǎng)基50 mL的250 mL搖瓶中進(jìn)行種子液培養(yǎng)，在30 ℃、200 r/min搖床上培養(yǎng)3 d后，取5 mL種子液接入裝有0.25 g甾醇的 50 mL 發(fā)酵液中，于30 ℃、200 r/min搖瓶中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化植物甾醇制備9-OH-AD，培養(yǎng)時(shí)間為120 h。

1.2.75-L發(fā)酵罐轉(zhuǎn)化試驗(yàn)將活化培養(yǎng)3 d的種子液按10%接種量接至裝有12.5 g甾醇的2.5 L發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30 ℃、400 r/min培養(yǎng)，pH值維持在8.2～8.7。每隔12 h取1次樣，測(cè)樣品中9-OH-AD的濃度。

1.2.8高效液相色譜（HPLC）分析方法轉(zhuǎn)化120 h后，按體積比1 ∶1加入乙酸乙酯，于30 ℃、200 r/min提取30 min后，4 000 r/min 離心10 min，取乙酸乙酯有機(jī)相層，用 0.22 μm 有機(jī)膜過濾后超聲脫氣進(jìn)行高效液相色譜測(cè)定。色譜條件：二極管陣列檢測(cè)器（DAD檢測(cè)器），波長(zhǎng)254 nm；色譜柱為Thermo：ODS-2 HYPERSIL（5 μm×250 mm×4.6 mm）；柱溫40 ℃；流動(dòng)相 ∶甲醇與水體積比為 7 ∶3，流速1 mL/min，進(jìn)樣量為30 μL。

2結(jié)果與分析

2.1原生質(zhì)體滲透穩(wěn)定劑的選擇

在再生高滲培養(yǎng)基配制中分別選用5種濃度為 0.7 mol/L 的滲透壓穩(wěn)定劑，考察這些穩(wěn)定劑對(duì)分枝桿菌原生質(zhì)體制備的影響。由圖1可知，以KCl和蔗糖作為原生質(zhì)體滲透壓穩(wěn)定劑對(duì)原生質(zhì)體制備效果的影響較小，而以NaCl作為滲透穩(wěn)定劑的再生高滲培養(yǎng)基中所制備的原生質(zhì)體數(shù)量較其他4種高，達(dá)到5.85×108 個(gè)/mL。其原因主要在于NaCl可能更符合菌體的外界液體環(huán)境，菌體外圍的Na+與菌體的滲透壓有關(guān)，能夠更好地維持菌體的滲透壓使原生質(zhì)體不被外界破壞且能促進(jìn)細(xì)胞壁的生成，從而獲得較多的原生質(zhì)體。因此，本研究選用NaCl作為分枝桿菌原生質(zhì)體的滲透壓穩(wěn)定劑來(lái)進(jìn)行原生質(zhì)體的制備。

2.2原生質(zhì)體滲透穩(wěn)定劑NaCl濃度的確定

在再生高滲培養(yǎng)基中加入不同濃度的NaCl溶液，考察其對(duì)分枝桿菌原生質(zhì)體數(shù)量的影響。由圖2可知，當(dāng)NaCl濃度為0.5 mol/L時(shí)原生質(zhì)體個(gè)數(shù)達(dá)到最大值，為3.1×108個(gè)/mL。隨著NaCl濃度的進(jìn)一步增大，原生質(zhì)體的數(shù)量逐漸減少，原因可能是NaCl濃度為0.5 mol/L時(shí)使原生質(zhì)體的滲透壓恰好與外界液體環(huán)境平衡，這個(gè)濃度能夠維持細(xì)胞穩(wěn)定并促進(jìn)細(xì)胞壁的生成，隨著NaCl濃度的增大，外界液體環(huán)境的滲透壓易使原生質(zhì)體脫水死亡從而導(dǎo)致原生質(zhì)體制備率降低。

2.3原生質(zhì)體制備率和再生率

由表1可知，通過公式原生質(zhì)體制備率=（酶解前菌落數(shù)-固體培養(yǎng)基上菌落數(shù)）/酶解前菌落數(shù)×100%，原生質(zhì)體再生率=（再生高滲固體培養(yǎng)基上菌落數(shù)-固體培養(yǎng)基上菌落數(shù)）/（酶解前菌落數(shù)-固體培養(yǎng)基上菌落數(shù)）×100%計(jì)算得原生質(zhì)體的制備率和再生率分別為98.3%、52.6%。表明以0.5 mol/L NaCl作為滲透壓穩(wěn)定劑，分枝桿菌原生質(zhì)體在經(jīng)紫外誘變后可獲得較高的原生質(zhì)體制備率和再生率。

2.4菌株生長(zhǎng)曲線及誘變條件確定

2.4.1分枝桿菌生長(zhǎng)曲線將分枝桿菌用接種環(huán)接于裝有 50 mL 種子液的250 mL搖瓶中，于30 ℃、200 r/min搖床中培養(yǎng)，每隔6 h測(cè)定菌液600 nm處的吸光度。由圖3可知，分枝桿菌在0～48 h時(shí)處于停滯期，在48～96 h期間為對(duì)數(shù)期，96 h之后步入平穩(wěn)期。48～96 h的對(duì)數(shù)期是分枝桿菌生長(zhǎng)代謝最旺盛的時(shí)期，也是分枝桿菌對(duì)外界環(huán)境最敏感的時(shí)期，在此時(shí)間段對(duì)其進(jìn)行誘變處理易獲得理想突變株。endprint

2.4.2紫外誘變對(duì)菌株的致死率由圖4可知，致死率隨紫外照射時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，140 s左右達(dá)到99%，之后基本穩(wěn)定。當(dāng)紫外照射時(shí)間為60～74 s時(shí)，致死率為70%～80%，此時(shí)回復(fù)突變株的出現(xiàn)率較低，因此確定紫外誘變的最佳時(shí)間為65 s。

2.5突變菌株搖瓶轉(zhuǎn)化制備9-OH-AD分析

經(jīng)過紫外誘變篩選獲得了143株突變株，挑取其中的63株進(jìn)行初篩，經(jīng)過初篩后獲得11株轉(zhuǎn)化積累9-OH-AD效果優(yōu)于出發(fā)菌株的突變株。由表2可知，菌株MS5的 9-OH-AD積累量為 62.31 mg/L，與出發(fā)菌株相比，提高了134.25%。11株菌株中，MS13菌株的9-OH-AD積累量最低，但與出發(fā)菌株相比提高了32.89%。對(duì)11株菌株進(jìn)行復(fù)篩和遺傳穩(wěn)定性研究，各菌株傳代3次產(chǎn)9-OH-AD的結(jié)果如圖5所示，MS23菌株經(jīng)過3次連續(xù)傳代，其9-OH-AD積累量基本保持穩(wěn)定，3次傳代后其9-OH-AD產(chǎn)量分別為37.32、41.64、38.77 mg/L，表明該菌株相對(duì)來(lái)說具有良好的遺傳穩(wěn)定性。采用HPLC對(duì)所得到的發(fā)酵液樣品進(jìn)行液相色譜分析。由圖6可知，出發(fā)菌株、突變菌株、9-OH-AD標(biāo)準(zhǔn)品均在3.03 min出現(xiàn)吸收峰，說明所獲得的樣品在這一時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)的吸收峰即為9-OH-AD的峰，所獲得的MS23突變菌株轉(zhuǎn)化制備獲得的對(duì)應(yīng)產(chǎn)物為9-OH-AD。

表2出發(fā)菌株及突變株搖瓶培養(yǎng)轉(zhuǎn)化制備9-OH-AD的情況

菌株9-OH-AD積累量（mg/L）出發(fā)菌株26.60MS237.88MS338.14MS562.31MS1135.46MS1335.35MS1942.25MS2349.13MS2746.16MS2835.57MS3039.92MS5258.22

2.65 L發(fā)酵罐中高產(chǎn)菌株MS23轉(zhuǎn)化制備9-OH-AD分析

考察菌株MS23在5 L發(fā)酵罐中轉(zhuǎn)化底物甾醇為9-OH-AD的情況。由圖7可知，在0～102 h，9-OH-AD的產(chǎn)量增加不明顯，而到102 h時(shí)，9-OH-AD的產(chǎn)量進(jìn)入對(duì)數(shù)期式的增長(zhǎng)，在124 h時(shí)達(dá)到50.41 mg/L，可能是由于在菌體轉(zhuǎn)化底物植物甾醇代謝途徑中產(chǎn)生了能夠促進(jìn)3-甾酮-9α- 羥基化酶活性的代謝物， 使得9-OH-AD的合成進(jìn)程

加速?gòu)亩鴮?dǎo)致9-OH-AD積累量的對(duì)數(shù)式增長(zhǎng)[16]。124 h之后9-OH-AD的產(chǎn)量逐漸減少，由124 h時(shí)的50.41 mg/L在143 h時(shí)降為48.66 mg/L，可能由于C1，2位脫氫酶的作用效果在124 h后開始大于3-甾酮-9α-羥基化酶，使得9-OH-AD的母核得以降解從而進(jìn)一步水解導(dǎo)致9-OH-AD的產(chǎn)量減少[17-18]。總之，發(fā)酵罐中生物轉(zhuǎn)化制備9-OH-AD，其積累量與搖瓶轉(zhuǎn)化相比提高了2.61%，今后將進(jìn)一步通過控制發(fā)酵罐中轉(zhuǎn)速、溫度、pH值及添加甾醇底物的促溶劑等其他發(fā)酵條件來(lái)提高9-OH-AD的產(chǎn)量。

3結(jié)論與討論

原生質(zhì)體誘變是通過去除菌體細(xì)胞壁以便更好地進(jìn)行誘變的一種誘變方法，可使紫外線作用更為直接，可增強(qiáng)誘變效果。姚笛等對(duì)1株產(chǎn)木糖醇季也蒙的畢赤酵母進(jìn)行原生質(zhì)體紫外誘變，獲得的木糖醇產(chǎn)量明顯提高，比出發(fā)菌株DQ11提高了186%，且具有良好的遺傳穩(wěn)定性[19]。胡基華等對(duì)1株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的黏質(zhì)沙雷氏菌進(jìn)行原生質(zhì)體紫外誘變，獲得比原始菌株提高4.3倍的幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量[20]。本研究通過原生質(zhì)體誘變?cè)囼?yàn)表明，NaCl為最佳的分枝桿菌原生質(zhì)體滲透穩(wěn)定劑，其最適濃度為0.5 mol/L。在此條件下制備的原生質(zhì)體通過紫外誘變，在搖瓶生物轉(zhuǎn)化中，獲得的高產(chǎn)穩(wěn)定菌株MS23比出發(fā)菌株轉(zhuǎn)化制備9-OH-AD的能力提高了847%。通過初步的發(fā)酵罐放大轉(zhuǎn)化，9-OH-AD積累量達(dá)到50.41 mg/L。張懷成等研究的分枝桿菌轉(zhuǎn)化甾醇產(chǎn) 9α-羥基雄甾烯酮促進(jìn)劑的篩選中，通過加入促進(jìn)劑聚醚改性硅油投入10 g/L底物，獲得的9-OH-AD大于 4 g/L[11]。高興強(qiáng)等研究的油水乳化體系中分枝桿菌轉(zhuǎn)化植物甾醇產(chǎn) 9α-羥基雄甾烯酮中，投入20 g/L底物獲得1.28 g/L 9-OH-AD[12]。因此，雖然相對(duì)于出發(fā)菌株來(lái)說MS23菌株轉(zhuǎn)化植物甾醇制備9-OH-AD的能力有所提高，但 9-OH-AD 的積累量還是相對(duì)較低，還不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)的要求。進(jìn)一步的研究將對(duì)轉(zhuǎn)化過程的工藝進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化，以期獲得更高的9-OH-AD制備率。

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