張 宇，唐志鵬，秦榮耀 ，孫寧靜，徐石蘭 ，焦丁華

（1. 廣西大學 農(nóng)學院，廣西 南寧 530004；2. 廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所，廣西 南寧 530001；3.遂川縣果業(yè)局，江西 吉安 343900）

金柑Fortunella swingle又稱金橘，屬蕓香科Rutaceae金柑屬Fortunella藥食兼用植物。金柑原產(chǎn)于中國，栽培歷史近1 700 a，栽培地區(qū)遍布廣西、江西、浙江、福建、湖南、廣東等省（區(qū)），其中廣西種植面積及產(chǎn)量居第1位，其次是江西、福建和湖南等地。主要產(chǎn)地為廣西的融安和陽朔、江西的遂川、福建的尤溪和上杭、湖南的瀏陽和藍山、寧波北侖等地[1]。金柑清香味美、營養(yǎng)豐富，同時具有維護心血管功能、防治血管硬化和高血壓等疾病的藥用價值[2]。隨著我國政府對果樹品種資源的保護與開發(fā)越來越重視，許多金柑品種資源的調(diào)查采集工作取得了積極的研究成果。調(diào)查結果表明，金柑的種類較少，金柑品種主要來源于實生變異、無性變異種的芽變。同時，分子生物技術也被運用在金柑品種資源研究中，黃桂香等[3]和施維屬等[4]利用ISSR技術分別得出了越南金柑可能是寬皮柑橘與金柑雜交的后代和該標記可以將金柑屬和柑橘屬區(qū)分開來的結論；張連峰等[5]利用SSR技術得出了寧波羅浮與寧波紋具有極其相近的親緣關系。以上研究結果的獲得均是以獲取高質(zhì)量的總DNA為基礎，但較詳盡獲取金柑總DNA的方法報道較少。本文中研究了獲取高質(zhì)量金柑總DNA的方法，旨在為分子標記輔助選擇在金柑育種中得到實際應用打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料為融安金柑、滑皮金柑、脆密金柑。2016年7月6日，在廣西融安縣雅瑤鄉(xiāng)分別采取3個金柑品種的嫩葉和果實，各收集葉片15張，果實6枚，放進冰壺，迅速運回廣西大學農(nóng)學院實驗室，用雙蒸水清洗葉片和果實并濾干水分，置于-30 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆肹6-9]。

1.2 方 法

1.2.1 DNA提取試劑

① CTAB抽 提 液：115 mmol/L Tris-HCl，1.5 mol/L NaCl，20 g/L CTAB，20 mmol/L EDTA，4% β-巰基乙醇，20 g/L PVP-40（聚乙烯吡咯烷酮）（pH8.0）；②飽和酚、氯仿、異戊醇提取液，各溶液體積比25∶24∶1；③SDS抽提液：115 mmol/L Tris-HCl，0.8 mol/L NaCl，質(zhì)量濃度5%的SDS，55 mmol/L EDTA，2% β-巰基乙醇，20 g/L PVP-40（pH8.0）。

1.2.2 DNA提取流程

CTAB提取法：參考張宇等[10]的方法并進行適當?shù)男薷?。?.5 g鮮樣，液氮中研磨成粉末（金柑果實用經(jīng)75%酒精消毒過的刀片切割成1 cm3大小后研磨成粉末），放入10 mL離心管中；加入65 ℃預熱的6 mL提取試劑①，上下顛倒混勻，65 ℃溫浴1 h，期間不時晃動離心管幾次，常溫下11 500 r/min離心11 min，留清液；加入等體積提取試劑②，震蕩混勻，靜置5 min，4 ℃下11 500 r/min離心11 min；取上清液，加1/10體積3 mol/L NaAc和上清液等體積預冷的異丙醇，混勻，-30 ℃靜置1 h，4 ℃下11 500 r/min離心18～20 min；棄上清，75%乙醇洗滌沉淀2～3次，超凈臺上風干，用100 μL ddH2O溶解，-25 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

SDS提取法：參考井趙斌等[11]方法。選0.5 g鮮樣，液氮中研磨成粉末（鮮樣研磨前處理同CTAB提取法），放入10 mL離心管；加入65 ℃預熱的6 mL提取試劑③，上下顛倒混勻，65 ℃溫浴0.5 h，期間不時晃動離心管3～5次，常溫下11 800 r/min離心10 min，留上清液；加入與上清液同體積提取試劑②，震蕩混勻，靜置5 min，4 ℃下11 800 r/min離心10 min，取上清液，加1/10體積3 mol/L NaAc和1/3體積LiCl，混勻，-25 ℃靜置0.5 h，4℃下11 800 r/min離心18～20 min；棄上清，80%酒精洗沉淀2～3次，超凈臺上風干，用100 μL ddH2O溶解，-25 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

試劑盒提取法：選0.2 g鮮嫩樣品，液氮中研磨成粉末（鮮樣研磨前處理同CTAB提取法），選用天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)的DNA secure plant Kit（DP320）新型植物基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）進行提取，提取流程嚴格遵照產(chǎn)品說明書操作。

1.2.3 所提取DNA質(zhì)量檢驗及濃度計算

取DNA樣品10 μL，用ddH2O緩沖液稀釋至20倍，用紫外分光光度計測定230、260及280 nm波長的吸光度值（A），依據(jù)A260計算金柑總DNA的濃度，1個單位的吸光度值相當于50 μg/mL雙鏈DNA，對照為ddH2O，依據(jù)260 nm的吸光值分別與230 nm和280 nm的吸光值的比值A260/230和A260/280計算DNA純度。取5 μL稀釋20倍的DNA樣品，加入1 μL溴酚藍指示劑，用1%瓊脂糖凝膠，110 V恒壓電泳，20 min后，EB染色后拍照，分析基因組DNA的質(zhì)量。

1.2.4 SCoT分子標記驗證提取效果

以3種提取方法所獲得的DNA為模板，采用SCoT引物SCoT22進行PCR擴增，以檢測3種DNA提取方法的效果。SCoT22序列信息來自LUO C等[12]的文獻，金柑的SCoT-PCR擴增反應體系參照LUO C等[13]的方法。擴增反應結束后，取10 μL擴增產(chǎn)物，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳、染色、拍照分析。

2 結果與分析

2.1 紫外分光光度計檢測結果

用3種方法提取金柑葉片和果實總DNA的結果表明（見表1），3種方法均可有效獲取金柑葉片和果實總DNA，但在純度和產(chǎn)率上有差異。采用CTAB法和試劑盒法提取的金柑葉片和果實總DNA其A260/280比值分別在1.87～1.90和1.82～1.84區(qū)間內(nèi)，表明RNA和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的干擾極少，2種方法均可以較好地去除大分子物質(zhì)，DNA純度較高；采用SDS提取法所提取DNA的A260/280比值在1.85～1.94區(qū)間內(nèi)，部分比值大于1.9，且金柑果實DNA的A260/280比值在1.87～1.94區(qū)間內(nèi)，說明仍有RNA等大分子殘留，且金柑果實DNA中殘留的RNA等大分子物質(zhì)多于金柑葉片DNA。采用CTAB法和試劑盒法提取的金柑葉片和果實總DNA，其A260/230比值在1.99～2.03和2.01～2.04區(qū)間內(nèi)，表明試劑盒提取法和CTAB提取法除去小分子、鹽和酚類物質(zhì)等雜質(zhì)的能力較理想，且試劑盒提取法提取效果更好；采用SDS提取法其A260/230比值在1.89～2.03區(qū)間內(nèi)，采用SDS提取法所提取金柑葉片DNA的A260/230比值在2.00～2.03區(qū)間內(nèi)，而提取金柑果實DNA的A260/230比值在1.89～1.95區(qū)間內(nèi)。整體而言，SDS提取法除去小分子、鹽和酚類物質(zhì)等雜質(zhì)的能力比CTAB提取法和試劑盒提取法弱，SDS提取法除去金柑葉片DNA中小分子、鹽和酚類物質(zhì)干擾的能力比除去金柑果實DNA中小分子、鹽和酚類物質(zhì)干擾的能力強；就總DNA的得率而言，SDS提取法提取總DNA得率最高，試劑盒提取法提取總DNA得率最低。盡管CTAB提取法提取DNA得率不是最高，卻是能夠從金柑葉片和果實中提取到符合純度標準總DNA的較好方法。

表1 不同方法提取不同金柑品種葉片及果實DNA的結果比較?Table1 Comparison of extracted DNA in different cultivars of F. swingle leaves and fruits by different methods

2.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測結果

DNA的完整性、純度和DNA產(chǎn)率是判斷DNA質(zhì)量的主要標準。將提取液稀釋20倍，取8 μL DNA稀釋液，進行瓊脂糖凝膠電泳（見圖1）。3種DNA提取方法均可以獲得完整性較好的DNA，SDS提取法和CTAB提取法所提取的DNA條帶亮度遠大于試劑盒提取法所獲得DNA條帶亮度，這與表1中產(chǎn)率結果相一致（產(chǎn)率越高，亮度越大），說明SDS提取法和CTAB提取法提取金柑葉片和果實總DNA可以獲得較高的DNA產(chǎn)率；SDS提取法提取的金柑果實總DNA點樣孔存留少量雜質(zhì)，說明有蛋白質(zhì)存留，還存在少量RNA；3種方法提取的金柑葉片和果實DNA，帶型清晰整齊，表明其質(zhì)量較高，可用于開展后續(xù)的試驗，但哪種方法更理想，還須采用SCoT-PCR進一步檢驗。

2.3 SCoT擴增反應檢測結果

分別用SDS提取法、CTAB提取法和試劑盒提取法提取的金柑葉片和果實總DNA為模板，用SCoT22進行SCoT-PCR擴增（見圖2）。采用3種方法所提取的金柑葉片和果實總DNA均可以擴增出多態(tài)性豐富、層次感分明的多態(tài)性條帶，但以試劑盒提取法提取的總DNA模板進行SCoTPCR擴增所得瓊脂糖電泳圖譜多態(tài)性條帶亮度偏低，背景色淺，SDS提取法和CTAB提取法提取的總DNA進行SCoT-PCR擴增效果比較理想，多態(tài)性高，凝膠電泳圖譜清晰，多態(tài)性強，易于統(tǒng)計分析。對3種提取總DNA方法進行比較分析可知，SDS提取法和CTAB提取法提取總DNA效果較好。

3 結 論

圖1 3種方法提取金柑葉片和果實DNA的電泳結果比較Fig.1 Comparison of electrophoretic results of extracted DNA in F. swingle leaves and fruits by different methods

圖2 3種方法提取的DNA為模板的SCoT-PCR電泳結果比較Fig.2 Comparison of electrophoretic results of SCoT-PCR with the extracted DNA by three methods as templates

由A值和DNA得率可知：3種提取方法中，試劑盒提取法除去雜質(zhì)的能力最強；就總DNA的得率而言，SDS提取法提取總DNA得率最高；3種提取方法的綜合比較結果表明，盡管CTAB提取法提取DNA得率不是最高，卻是能夠從金柑葉片和果實中提取到符合純度標準總DNA的較好方法。SCoT擴增效果顯示：SDS提取法和CTAB提取法提取總DNA的SCoT-PCR擴增效果較好。分析比較3種檢測方法可以得出，CTAB提取法是提取金柑葉片和果實組織總DNA的最優(yōu)選擇。

4 討 論

金柑葉片和果實富含蛋白質(zhì)、糖類、酚類、單寧及色素等次生代謝物質(zhì)，這些物質(zhì)是影響提取高質(zhì)量總DNA的關鍵因素。因此，采用普通的SDS法和CTAB法提取金柑葉片和果實總DNA效果有可能不理想。筆者在SDS提取液和CTAB提取液中加入了PVP-40和β-巰基乙醇，在液氮中研磨樣品時，樣品經(jīng)過機械破壞，大量的植物細胞破碎，提取液中的PVP可以充分絡合干擾DNA提取純度的酚類物質(zhì)，阻止酚類物質(zhì)進行電位氧化還原反應生成醌類物質(zhì)，醌類物質(zhì)極易與氫鍵絡合，引起總DNA氧化褐變；β-巰基乙醇可以破壞蛋白質(zhì)的肽鏈，使得肽鏈斷裂，從而降解蛋白質(zhì)，同時抑制多種氧化酶的活性；多糖物質(zhì)常與總DNA同時沉淀形成白色膠粉，影響總DNA純度與后續(xù)試驗的進行，在CTAB提取法和SDS提取法操作流程中均使用了提取試劑②（飽和酚、氯仿、異戊醇體積比25∶24∶1），該提取試劑可有效去除多糖的干擾[14-16]。觀察圖1可知，SDS提取法點樣孔殘留微量蛋白質(zhì)，CTAB提取法和試劑盒提取法肉眼未觀察到蛋白質(zhì)殘留，這有可能是因為在進行65 ℃水浴時CTAB提取液與蛋白質(zhì)充分結合，不論從CTAB的濃度還是水浴時間來說，均滿足CTAB提取液與蛋白質(zhì)充分結合的條件，從而更大程度上抑制了PPO的活性，也有可能是因為提取試劑①（CTAB抽提液）較提取試劑③（SDS抽提液）能更徹底地去除蛋白質(zhì)。由表2可知，盡管理論計算中SDS提取法提取的總DNA得率較高，但是從A260/230、A260/280可以看出，SDS法提取金柑葉片和果實總DNA還是有少量蛋白質(zhì)殘留，圖1點樣孔上有少量蛋白質(zhì)殘留痕跡，也印證了這點。金柑果實總DNA有少量RNA和其他鹽類物質(zhì)殘留，但金柑葉片總DNA無殘留，很有可能是因為金柑葉片和果實中多糖、多酚、蛋白質(zhì)、單寧及色素含量以及比例組合不同而引起，因此推斷SDS提取法更適合金柑葉片組織總DNA的提取。將3種提取方法提取的總DNA通過SCoT擴增均可以得到適合后續(xù)PCR試驗要求的金柑葉片和果實總DNA，但SDS提取法和CTAB提取法所提取的總DNA的擴增效果圖譜清晰、多態(tài)性高；而試劑盒提取法所提取的金柑葉片和果實總DNA的擴增效果圖譜背景偏淺、條帶較模糊，這很可能是因為試劑盒提取法在較徹底除去雜質(zhì)干擾的同時也損失掉了較多的總DNA，由于總DNA濃度相對偏低，使得PCR擴增條帶不如其他2種提取方法所提取的總DNA擴增條帶明亮。筆者選用的3種方法均能夠提取出金柑葉片和果實總DNA，但3種方法所提取的總DNA產(chǎn)率和純度存在差異。其中CTAB法能夠較好地除去多糖、多酚、單寧、色素以及蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，提取的DNA純度最高，產(chǎn)量也較理想，可以獲得高質(zhì)量的金柑葉片和果實總DNA，可用于開展分子標記、品種鑒定、遺傳圖譜構建等分子生物學相關工作的研究[17-20]。但是本研究也存在一定的局限性，如：高產(chǎn)率和高質(zhì)量總DNA的提取不能集中在同一種方法上，效果較理想的方法卻存在需要消耗更多的時間成本等問題。要克服上述研究的局限性，需更精致的實驗設計、更多的研究工作量以及較大量的實驗數(shù)據(jù)支撐來解決。

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