楊亞晉 ， 張日俊， 趙 麗， 郭愛(ài)偉

(1.西南林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650224；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，北京 100193)

1965年Lilly等[1]首次提出細(xì)菌素是微生物產(chǎn)生的能抑制其他微生物生長(zhǎng)的物質(zhì)，是某些細(xì)菌在生長(zhǎng)過(guò)程中由質(zhì)粒編碼核糖體合成的一類(lèi)具有抗菌活性的多肽或蛋白質(zhì)復(fù)合物，產(chǎn)生菌對(duì)其產(chǎn)生的細(xì)菌素具有自身免疫性[2-3]。與廣譜抗生素相比，細(xì)菌素的抑菌譜相對(duì)較窄，不易產(chǎn)生耐藥性、無(wú)殘留[4]，因此細(xì)菌素可以在一定情況下減少或取代抗生素的使用。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)細(xì)菌素的研究主要集中在乳酸菌和芽胞桿菌上，已經(jīng)從乳酸菌的產(chǎn)物中分離到上百種細(xì)菌素，根據(jù)其分子量大小、化學(xué)結(jié)構(gòu)分為四類(lèi)：ClassⅠ羊毛硫抗生素，ClassⅡ不含羊毛硫氨酸細(xì)菌素[5]，ClassⅢ大分子熱不穩(wěn)定蛋白[6]，ClassⅣ蛋白質(zhì)和脂類(lèi)或碳水化合物的復(fù)合細(xì)菌素[7]。不同乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素分子量大小、結(jié)構(gòu)組成、作用機(jī)理及基因定位等方面存在較大差別。絕大多數(shù)革蘭陽(yáng)性細(xì)菌素分子量均小于10 kDa，一般是帶正電荷30～60 AA蛋白，Nisin是目前研究最成熟的羊毛硫抗生素，含有34個(gè)氨基酸，分子量大約為 3 500 Da。由于含有蛋白質(zhì)或肽的特性，因此細(xì)菌素對(duì)不同的蛋白酶敏感性也不一樣。細(xì)菌素對(duì)熱和酸堿的耐受性跟其結(jié)構(gòu)有很大關(guān)系，分子量小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的細(xì)菌素對(duì)熱和酸穩(wěn)定性較好。大部份小分子蛋白(<10 kDa)具有較好的耐熱和耐酸能力，如Nisin、片球菌素等;而大分子蛋白細(xì)菌素(>30 kDa)在100 ℃、20 min加熱之后失活，如helveticin J，lacticin B等[8]。乳酸菌細(xì)菌素在pH 3.0～8.0下的活力較強(qiáng)[9]，pH較低時(shí)活力更強(qiáng)[10]。一般而言，由于細(xì)菌素是細(xì)菌的代謝產(chǎn)物，其產(chǎn)生與菌體生長(zhǎng)同步，細(xì)菌素活性和產(chǎn)量除了菌體自身因素外，還受培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件如pH、溫度、刺激因子等影響。本研究對(duì)分離得到的兩株乳酸菌SN4、CN4產(chǎn)生的乳酸菌素進(jìn)行生物學(xué)特性的研究，以期對(duì)這兩種高效乳酸菌素進(jìn)一步研究打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株 植物乳桿菌SN4、糞腸球菌CN4(實(shí)驗(yàn)室分離)。

1.1.2 指示菌 金黃色葡萄球菌(ATCC26003/CVCC 1887/ATCC 43300)，藤黃八疊微球菌(CMCC 28001)，單增李斯特菌(CVCC 1599)，產(chǎn)氣莢膜梭菌C型(CVCC 65)，枯草芽胞桿菌(實(shí)驗(yàn)室)，大腸埃希菌(CVCC 245)鼠傷寒沙門(mén)氏菌(CVCC 541)，沙門(mén)氏菌(CVCC 2212)；指示菌用BPY、LB培養(yǎng)基，乳酸菌用MRS培養(yǎng)基。

1.1.3 試劑 蛋白酶k、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶(Sigma，USA，純度>99%)、葡萄糖、蛋白胨、NaOH等(國(guó)產(chǎn)分析純)。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌素初提液和指示菌的制備 將SN4和CN4制備種子液，種子液按2%的接種量37 ℃靜置培養(yǎng)24 h制備發(fā)酵液，使發(fā)酵液終濃度為1011～1012cfu/mL，然后8 000 r/min離心10 min，取上清備用[11]。各指示菌活化后接種擴(kuò)培，使菌液稀釋后濃度約為107～108cfu/mL，備用。

1.2.2 蛋白酶敏感性 將SN4和CN4的發(fā)酵上清液做以下處理：①發(fā)酵上清；②發(fā)酵上清調(diào)pH為7.2；③發(fā)酵上清調(diào)pH為7.2+不同蛋白酶處理(蛋白酶濃度均為1 mg/mL)，37 ℃溫育2 h。取終濃度約107～108cfu/mL的金黃色葡萄球菌150 μL均勻涂板，各處理發(fā)酵上清200 μL加入牛津杯，3個(gè)重復(fù)/樣，置于37 ℃培養(yǎng)24 h測(cè)定抑菌圈直徑[12]。

1.2.3 酸堿穩(wěn)定性 將SN4和CN4的發(fā)酵上清液做以下處理：①發(fā)酵上清；②用1 mol/L的NaOH和HCl調(diào)節(jié)發(fā)酵上清pH為3、4、…11、12不同水平[12]；同上用牛津杯法測(cè)定抑菌活性。

1.2.4 熱穩(wěn)定性 參考Guo等[13]的方法將SN4和CN4的發(fā)酵上清液做以下處理：①發(fā)酵上清；②發(fā)酵上清分別于25、40、60、80、100 ℃水浴處理20 min，120 ℃處理5 min。同上用牛津杯法測(cè)定抑菌活性。

1.2.5 乳酸菌生長(zhǎng)曲線和乳酸菌素合成曲線 用SN4和CN4的種子液按2%的接種量制備發(fā)酵液，靜置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。從接種開(kāi)始每小時(shí)取4 mL；其中2 mL發(fā)酵液上清用牛津杯法測(cè)定抑菌活性，另2 mL用于測(cè)定pH和600 nm可見(jiàn)光下的OD值。制作各乳酸菌的生長(zhǎng)曲線和乳酸菌素合成曲線。

1.2.6 乳酸菌素抑菌譜的測(cè)定 將指示菌菌株活化并制備終濃度為107～108cfu/mL的指示菌發(fā)酵液，同上用牛津杯法測(cè)定發(fā)酵液對(duì)不同指示菌的抑菌活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶對(duì)乳酸菌素抑菌活性的影響

SN4、CN4菌株發(fā)酵液的抑菌活性通過(guò)蛋白酶處理后對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性見(jiàn)表1，發(fā)酵液對(duì)金黃色葡萄球菌有較好的抑菌效果，發(fā)酵液上清調(diào)節(jié)為pH 7.2后抑菌活性分別保留了90%和89%，說(shuō)明發(fā)酵液中主要的抑菌物質(zhì)不是乳酸乙酸。蛋白酶K、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶處理發(fā)酵液上清后抑菌活性均消失，而胰蛋白酶處理后發(fā)酵液抑菌活性分別保留了55%和84%，說(shuō)明了菌株代謝產(chǎn)物抑菌成分乳酸菌素的蛋白質(zhì)特性。李亞玲等[14]研究也表明乳酸菌素對(duì)大部分蛋白酶較敏感。

表1 不同蛋白酶處理后乳酸菌素的抑菌活性(抑菌圈mm)

注：“*”表示無(wú)抑菌活性或抑菌圈< 8 mm

2.2 酸堿/熱環(huán)境下乳酸菌素的抑菌活性

菌株發(fā)酵上清通過(guò)不同pH值處理后抑菌活性如圖1A。可見(jiàn)兩乳酸菌素在pH 4～10之間仍保持著80%的抑菌活性，與大部分乳酸菌素的研究相似表現(xiàn)為較好的酸堿穩(wěn)定性。其中乳酸菌素BSN4抑菌活性明顯高于BCN4，乳酸菌素在pH 5～7時(shí)抑菌活性均表現(xiàn)下降，而隨著pH升高抑菌活性又呈恢復(fù)趨勢(shì)，當(dāng)pH 11～12時(shí)抑菌活性顯著降低；說(shuō)明兩乳酸菌素有較好的酸堿耐受性。李琳等[15]在研究中發(fā)現(xiàn)嗜熱鏈球菌產(chǎn)生一種新型嗜熱鏈球菌素ST9在pH 2.0～9.0之間均有較好的活性。

菌株發(fā)酵上清通過(guò)不同溫度處理(25～120 ℃)后抑菌活性如圖1B。乳酸菌素BSN4抑菌效果顯著高于BCN4；兩乳酸菌素在25～100 ℃處理20 min后仍能分別保留89.1%和74.4%以上的活性(SN4抑菌圈均>24 mm，CN4抑菌圈>19 mm)，120 ℃處理5 min后BSN4和BCN4抑菌活性仍分別能保留約65%、55.8%活性。說(shuō)明兩乳酸菌素具有較好的耐熱性，陳靜等[16]研究分離的嗜酸乳桿菌素在120 ℃和pH 2～9也有較好的穩(wěn)定性。

圖1 不同pH/溫度處理下乳酸菌素的抑菌活性Fig.1 Effects of vanous pH/TM on the bacteriocin antimicrobial activityA：不同pH處理時(shí)乳酸菌素的抑菌活性；B：不同溫度處理時(shí)乳酸菌素的抑菌活性；C：不同pH處理時(shí)BSN4的抑菌圈(mm)A: Effects of different pH on the bacteriocin antimicrobial activity (mm); B: Effects of different temperature on the bacteriocin antimicrobial activity (mm); C: Effects of different pH on the BSN4 inhibition zone(mm)

2.3 菌體生長(zhǎng)曲線和乳酸菌素合成曲線

兩菌株0～24 h發(fā)酵液的pH值和細(xì)菌生長(zhǎng)曲線(600 nmOD值)如圖2，可見(jiàn)菌株生長(zhǎng)過(guò)程中pH值和OD值成對(duì)應(yīng)反比的趨勢(shì)，隨著菌體不斷生長(zhǎng)繁殖，其發(fā)酵液的pH值不斷下降，SN4在2 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)期，16 h左右進(jìn)入穩(wěn)定期；CN4在3 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)期，18 h左右進(jìn)入穩(wěn)定期。相比之下，SN4比CN4更早進(jìn)入穩(wěn)定期并達(dá)到較低的pH值(SN4 pH達(dá)3.8；CN4 pH達(dá)到4.5)，說(shuō)明SN4菌株的產(chǎn)酸性能和生產(chǎn)效率較好。此外，細(xì)菌素活性曲線如圖3，細(xì)菌素BSN4 4 h后開(kāi)始表現(xiàn)出抑菌活性(抑菌圈達(dá)11 mm)，在穩(wěn)定期16 h抑菌活性達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。24 h測(cè)定SN4和CN4活菌數(shù)分別達(dá)到6.17×109cfu/mL和3.5×109cfu/mL。與細(xì)菌素BCN4相比，BSN4分泌效率和抑菌活性也較好。

圖2 SN4、CN4菌株發(fā)酵液24 h內(nèi)的pH值和生長(zhǎng)曲線(OD600) Fig.2 The pH and growth curves of SN4、CN4 strains in 24 hours(OD600)

圖3 SN4、CN4菌株24 h代謝產(chǎn)細(xì)菌素BSN4和BCN4的抑菌活性Fig.3 The antimicrobial activity of bacteriocin BSN4 and BCN4 in 24 hours

2.4 抑菌譜測(cè)定

從抑菌譜表2可知，兩種乳酸菌素對(duì)金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、單增李斯特菌等一類(lèi)革蘭陽(yáng)性致病菌具有較好的抑菌作用。而對(duì)革蘭陰性菌如大腸埃希菌和沙門(mén)氏菌抑菌效果不明顯，其中SN4的抑菌范圍比CN4大。Klaenhammer等[17]表明不同乳酸菌產(chǎn)生細(xì)菌素抑菌譜范圍差別很大，多數(shù)乳酸桿菌細(xì)菌素的抑菌作用范圍較窄，只對(duì)近緣菌株產(chǎn)生抑制作用。

表2 乳酸菌素抑菌譜

注：“+”表示抑菌圈>16 mm，“-”表示抑菌圈<12 mm；ATCC：美國(guó)模式菌種收集中心；CMCC：中國(guó)醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心；CVCC：中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心

3 討 論

細(xì)菌素在抑菌譜活力、作用模式、分子量大小、基因來(lái)源及生化特性等方面存在很大差異，而共性是含有必需的蛋白質(zhì)組分，容易被蛋白酶水解。不同的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和組分決定其對(duì)外界環(huán)境的耐受性[18]。不同的細(xì)菌素對(duì)不同的蛋白酶敏感性也有差異，呂燕妮等[19]研究表明α-淀粉酶可使戊糖乳桿菌素部分失活，酸性蛋白酶不能使其失活。在動(dòng)物添加劑的應(yīng)用中需要經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)墓に囂幚?，但與抗生素相比，乳酸菌素作為防腐劑隨著飼料進(jìn)入消化道時(shí)可被降解掉而不會(huì)有殘留或耐藥性等影響。

細(xì)菌素對(duì)熱和酸堿的耐受性跟其結(jié)構(gòu)有很大關(guān)系，分子量小(<10 kDa)、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的細(xì)菌素對(duì)熱和酸穩(wěn)定性較好，典型的小分子熱穩(wěn)定細(xì)菌素如Nisin、片球菌素等。乳酸菌素在pH 3～8活力較高，pH較低時(shí)活力更強(qiáng)，而有些乳酸菌素在酸性或中性條件下才有活性，或在pH高于8時(shí)會(huì)失活(如Nisin，lactostrpcins)，也有一些細(xì)菌素只在堿性條件下才具有抑菌效果[20]。有研究表明pH變化使得細(xì)菌素的蛋白結(jié)構(gòu)構(gòu)象發(fā)生改變或水環(huán)境改變而影響其活性，可能是弱酸性和弱堿性這個(gè)區(qū)間正好是大部分細(xì)菌素的等電點(diǎn)[21-22]。細(xì)菌素的熱穩(wěn)定性與其小球形結(jié)構(gòu)、高度疏水性區(qū)域(如IactacinF、lactococcinA、Nisin)，穩(wěn)定的交聯(lián)結(jié)構(gòu)(如Nisin、lacticin481、lactocinS)和高甘氨酸含量(如diplococcin、IactacinF、Iactocin27、lactococcinA)有關(guān)[23]。革蘭陽(yáng)性細(xì)菌素最初是以前體形式合成的，前體中的先導(dǎo)肽被切割后形成具有生物活性的分子；在某些革蘭陽(yáng)性細(xì)菌素結(jié)構(gòu)中，還可以形成幫助細(xì)菌素分子更穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)或起活性基團(tuán)作用的異常氨基酸(如羊毛硫氨酸和B-甲基羊毛硫氨酸)[24]。細(xì)菌素一般由ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和sec分泌途徑分泌到細(xì)胞外，從指數(shù)期到穩(wěn)定期的轉(zhuǎn)換階段產(chǎn)生，在穩(wěn)定期中期活力達(dá)到最高[25-26]。

不同的乳酸菌素通過(guò)不同的機(jī)制產(chǎn)生抑菌效果，大多數(shù)乳球菌素A、B、M僅能殺滅近緣菌株；也有些乳酸菌素的抑菌譜較寬，如nisin、mutacin B-Ny266等不僅能抑制放線菌、梭菌、腸球菌、鏈球菌、葡萄球菌等，也可殺滅一些致病菌的革蘭陰性菌包括彎曲桿菌、嗜血桿菌等[27]。因此不同的細(xì)菌素抑菌譜在實(shí)際應(yīng)用中有一定的指導(dǎo)作用。

本試驗(yàn)中兩種乳酸菌素BSN4和BCN4除了胰蛋白酶外對(duì)大部分蛋白酶較敏感；在pH 4～10之間和25～100 ℃處理20 min乳酸菌素均有著很好的酸堿耐受性和熱穩(wěn)定性，SN4在發(fā)酵16 h就能達(dá)到穩(wěn)定期并表現(xiàn)出較好的抑菌活性；菌株SN4較CN4有更好的產(chǎn)酸能力和發(fā)酵效率。抑菌譜測(cè)定表明乳酸菌素BSN4產(chǎn)生的抑菌蛋白對(duì)革蘭陰性菌無(wú)明顯抑菌效果而對(duì)大部分革蘭陽(yáng)性菌有較好的抑菌效果。BSN4和BCN4作為綠色抗生素替代品具有較大的潛力和進(jìn)一步深入研究的價(jià)值。

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