趙曉寧，王煥香，羅飛，商華，李磊，朱光華，尹甜，傅曉方，邢姍姍，邊可欣，高大威*

（1. 燕山大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，河北秦皇島 066000；2. 中國長城葡萄酒有限公司，河北懷來 075499）

葡萄酒是以葡萄為原料經(jīng)微生物發(fā)酵的產(chǎn)物，葡萄酒釀造已經(jīng)有五、六千年的歷史，早在人們認識微生物之前，已經(jīng)不自覺的利用微生物進行葡萄酒的釀造[1]。隨著顯微鏡的發(fā)明及應(yīng)用，人們對微生物的認識越來越深刻。1968年Amerine等[2]發(fā)現(xiàn)成熟的葡萄漿果表面存在許多不同屬的酵母菌，這些酵母菌都有一定的發(fā)酵能力。隨后的葡萄酒研究領(lǐng)域中，酵母菌成為研究熱點之一。酵母品種種類及性能直接決定所釀果酒品質(zhì)的優(yōu)劣[3-4]，因此揭示釀酒葡萄中酵母菌的組成對提高葡萄酒的質(zhì)量及進一步弄清酵母菌對葡萄酒品質(zhì)的影響有重要意義。

葡萄酒的釀造過程是利用酵母菌將葡萄內(nèi)的大部分糖轉(zhuǎn)化為酒精和CO2，同時生成甘油、高級醇、酯類、醛類等代謝產(chǎn)物，直接影響葡萄酒的色澤、香氣及口感，也決定了葡萄酒的質(zhì)量和風(fēng)格。葡萄品種和質(zhì)量一旦確定，要獲得能夠充分反映葡萄品種特色和優(yōu)良品質(zhì)的葡萄酒所選酵母至關(guān)重要，可以說酵母菌是葡萄酒品質(zhì)的靈魂[5-6]。由于受環(huán)境因素的影響，某些酵母菌屬、種在形態(tài)學(xué)及生理生化特性方面的差異極不顯著，采用傳統(tǒng)方法對它們進行分類相當(dāng)困難，而通過分子手段對酵母菌進行鑒定的準確性很高[7-9]。本研究對河北昌黎和沙城兩地所產(chǎn)的釀酒葡萄中的酵母菌株進行分離，根據(jù)其在WL培養(yǎng)基上的菌落顏色及形態(tài)進行初步分類，并進行生理生化鑒定，最后運用RAPD聚類分析對這些菌株進行分類以探討河北地區(qū)葡萄酒相關(guān)酵母菌的種類多樣性，為該地釀酒酵母的應(yīng)用提供基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 原料

本研究于2010年9～10月從河北昌黎和沙城兩地的主要釀酒葡萄產(chǎn)區(qū)采集不同品種成熟的葡萄果粒，葡萄品種包括‘赤霞珠’‘玫瑰香’‘龍眼’‘霞多麗’‘蛇龍珠’作為菌株分離源，從葡萄表面分離純化共得到73株酵母菌，隨機抽取出其中的30株進行后續(xù)研究。

1.1.2 主要試劑和儀器

dNTP mix（10 mmol/L，北京艾德萊生物科技有限公司）；隨機引物（20 μmol/L，北京恒博和泰生物科技有限公司）；MgCl2（25 mmol/L）、Taq酶（5 U/μL）、10×Reaction Buffer購于上海Promega公司；溫度梯度PCR儀購于德國Whatman Biometra公司，穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀購于北京六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng)購于美國Gene Company Limited公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

（1）YPD 固體培養(yǎng)基。葡萄糖20 g，酵母膏 10 g，蛋白胨 20 g，瓊脂 20 g，溶于1 L蒸餾水中，115 ℃滅菌30 min。

（2）酵母菌保藏培養(yǎng)基。YPD液體培養(yǎng)基，分離出的菌種保藏在YPD液體培養(yǎng)中，于-80 ℃凍存。

（3）WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。酵母浸粉4.0 g，蛋白胨5.0 g，葡萄糖50.0 g，瓊脂20.0 g，磷酸二氫鉀0.55 g，氯化鉀0.425 g，氯化鈣0.125 g，硫酸鎂0.125 g，氯化鐵0.0025 g，硫酸錳0.0025 g，溴甲酚綠0.022 g，溶于1 L蒸餾水中，115 ℃滅菌30 min。pH6.5。

1.2 葡萄果粒表皮酵母菌多樣性分析方法

1.2.1 生理生化鑒定

本研究參照《酵母菌的特征與分類鑒定手冊》，部分鑒定方法略有改進。

（1）發(fā)酵糖類試驗。鑒定所用發(fā)酵糖類包括葡萄糖、D-果糖、麥芽糖、乳糖和蔗糖。將上述糖分別加入到含有杜氏發(fā)酵管的生理生化培養(yǎng)基中，使之含量達到50 mmol/L，經(jīng)過濾除菌。將活化后的酵母菌分別接入到上述培養(yǎng)基中，培養(yǎng)一周后觀察，以杜氏小管中有氣泡計為陽性，無氣泡為陰性，同時記錄發(fā)酵液表面菌醭生成情況。

（2）硝酸鹽還原試驗。將生長旺盛的酵母菌菌株接種在硝酸鹽培養(yǎng)基中，25 ℃下培養(yǎng)7 d，將甲、乙兩混合液按1∶1混合（甲液：對氨基苯磺酸0.8 g＋5 mol/L醋酸l00 mL；乙液：α-奈胺0.5 g＋5 mol/L醋酸l00 mL），每5 mL培養(yǎng)液加入混合液0.1 mL后，觀察結(jié)果呈現(xiàn)紅色為陽性，若無紅色出現(xiàn)，應(yīng)進一步檢查。向上述試管中加少許鋅粉，若出現(xiàn)紅色，表示硝酸鹽仍存在，為陰性反應(yīng)；若不產(chǎn)生紅色，表示硝酸鹽已被還原為氨和氮，仍為陽性反應(yīng)。

（3）生成類淀粉化合物試驗。將培養(yǎng)基倒平板，接種已活化好的酵母，于28 ℃培養(yǎng)1～2周后，在平板長菌處周圍滴加盧格氏碘液，觀察酵母菌落周圍是否呈現(xiàn)藍色。

（4）同化肌醇試驗。采用固體培養(yǎng)法，將酵母菌接種到含有肌醇的碳源同化基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，置于28 ℃溫度下培養(yǎng)7 d，每天觀察一次生長情況。

（5）尿素分解試驗。將供試酵母菌接種于尿素酶試驗基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)5 d，其間每天觀察一次，出現(xiàn)深紅色者為陽性反應(yīng)。

表1 WL培養(yǎng)基上酵母菌形態(tài)特征Table 1 Yeasts morphology characteristics in WL medium

（6）放線菌酮素抗性試驗。在12 mm口徑試管中每管加入3.6 mL蒸餾水，115 ℃滅菌30 min，加入0.4 mL放線菌素酮母液。接種、培養(yǎng)、結(jié)果記錄和判定方法皆與肌醇同化試驗相同。

1.2.2 形態(tài)學(xué)鑒定

稱取葡萄果皮1.0 g，加入50 mL滅菌的液體YPD培養(yǎng)基（加30 mg/L亞硫酸鈉）中，25 ℃搖床培養(yǎng)48 h。將富集液用生理鹽水進行不同梯度稀釋后涂布平板，25 ℃培養(yǎng)48 h，轉(zhuǎn)接并經(jīng)多次劃線純化，獲得純化菌株。取分離得到的酵母菌株劃線接種于WL培養(yǎng)基[10]，28 ℃培養(yǎng)5 d，觀察菌落的顏色，形態(tài)，表面是否光滑，邊緣是否整齊等特征。同時，在顯微鏡下觀察酵母的細胞形態(tài)以此對分離到的酵母菌株進行初步的形態(tài)分類。

1.2.3 酵母菌RAPD聚類分析

RAPD反應(yīng)選用隨機引物5'-AGGGAACGAG-3'進行擴增，反應(yīng)體系的總體積為25 μL，包括1 μL基因組DNA，2.5 μL 10×PCR緩沖液，2 μL 25 mmol/L MgCl2，0.5 μL 10 mmol/L dNTPs，0.5 μL 5 U Taq DNA聚合酶，2 μL 20 μmol/L隨機引物和16.5 μL ddH2O。每個反應(yīng)為35個循環(huán)，每個循環(huán)包括94 ℃ 30 s，36 ℃ 30 s，72 ℃1 min。循環(huán)前在94 ℃預(yù)變性3 min，循環(huán)結(jié)束后在72 ℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物在1%瓊脂糖中電泳，EB染色后經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)檢測并拍照。利用RAPD-PCR-RFLP program進行酵母菌的聚類分析。將所得電泳圖譜輸入DSP軟件中，按步操作，得出菌株間的遺傳相似系數(shù)。

表2 30株酵母菌糖發(fā)酵試驗結(jié)果Table 2 Results of 30 yeast strains sugar fermentation test

2 結(jié)果與分析

2.1 利用WL培養(yǎng)基對酵母菌初步形態(tài)分類

從沙城的玫瑰香葡萄表面分離所得酵母編號為B1～B3，霞多麗葡萄表面分離所得酵母編號為C1～C3，龍眼葡萄表面所得酵母編號為D1～D4，蛇龍珠葡萄表面所得酵母編號為E1～E4；從昌黎十里鋪的赤霞珠葡萄表面分離所得酵母編號為赤1、赤2、赤4、赤5、赤8、赤11、赤12、赤14、赤16，玫瑰香葡萄表面所得酵母編號為玫1、玫2、玫3，龍眼葡萄表面所得酵母編號為龍1～龍4。用WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基， 根據(jù)菌落的顏色和形態(tài)將其聚類，共分為5種形態(tài)類型[11]，如表1。

由此可見，菌落顏色有灰綠色帶藍色、深綠色、奶油色帶綠色、奶油色等，菌落質(zhì)地粘稠，菌落有的平伏，有的中間隆起，表面有的光滑反光，有的光滑黯淡，菌落邊緣形態(tài)各異。

2.2 生理生化鑒定

2.2.1 發(fā)酵糖類試驗結(jié)果

不同的含糖培養(yǎng)基對所分離的菌株進行糖發(fā)酵試驗結(jié)果見表2。碳源是微生物生長必需的含碳營養(yǎng)物，約占酵母菌體干重的50%，因此碳源是僅次于水分的菌株生長需求量的一大類營養(yǎng)物質(zhì)。碳源是組成其結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，同時對異氧微生物來說，碳源為其生命活動提供所需要的能量[12]。碳源的種類不同，對酵母菌的生長也有不同的影響，酵母菌對各種碳源的利用因種類不同而存在差異，本試驗中所用碳源分別為葡萄糖、D-果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖。由表2可知，編號為B1、E1、龍1、龍2、龍4、玫3的酵母菌株可發(fā)酵3種以上糖類；酵母菌株C1、D1、赤8、赤12、赤16不能發(fā)酵這5種糖[13]。

2.2.2 其他生理生化試驗結(jié)果

由表3可知，所有供試菌株均不能產(chǎn)生類淀粉化合物，也不能分解尿素；只有酵母菌D2、E2、玫1、玫3可以還原硝酸鹽；編號為B1、D4、龍4、玫1、玫3的酵母菌可以同化肌醇；赤4、赤11、龍2、龍3和龍4具有抗放線菌酮的特性。

表3 30株酵母菌菌株生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical characteristics of 30 yeast strains

2.3 PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測

采用SDS裂解法從供試酵母菌株中提取基因組DNA，經(jīng)核酸蛋白測定儀檢測純度和含量，OD260/OD280的值均接近1.8，所以其純度均能滿足PCR擴增反應(yīng)要求。將引物擴增后用于1%瓊脂糖凝膠電泳。對圖1的電泳結(jié)果分析，30株酵母菌進行RAPD擴增及電泳后，有20株酵母菌擴增出了相應(yīng)DNA條帶，擴增條帶數(shù)目在1～7條，其分子量在250～3000 bp。由圖譜可以看出，大多數(shù)酵母菌的擴增條帶數(shù)均在3條以上，說明此引物對菌株的多態(tài)性較好，重復(fù)2次結(jié)果一致，從而進一步說明此引物可以對大多數(shù)酵母菌進行鑒別與分類。

2.4 酵母菌株的聚類分析

以遺傳相似性為基礎(chǔ)，應(yīng)用RAPD-PCR-RFLP program軟件，和UPGMA（Unweighted Pair Group Method Using Average Linkage）算法將20株酵母菌進行聚類分析并建立遺傳進化樹狀圖，如圖2。從聚類結(jié)果可以看出，20株酵母菌被分成2組，第一組由19株酵母菌組成，遺傳相似系數(shù)從53.43%至100.00%，其中E3和E4、玫3和龍1、赤1和D3、赤8和赤16、B1和B2、D2和D4的遺傳相似系數(shù)分別達到100.00%；第二組只有玫1。與第一組比較，遺傳相似系數(shù)為10.79%。遺傳相似系數(shù)達到100.00%的菌株具有極高的同源性，可以認定為同一種菌。因此，經(jīng)過聚類后，成功地去除6株菌，剩余14株菌。再利用菌株的形態(tài)學(xué)特征、生理生化特點及其遺傳相似性進行種屬的分析。據(jù)生理生化特征，查閱《酵母菌的特征與分類鑒定手冊》，進一步確定各菌株所在屬是否符合此分類，并最終將菌株鑒定到種（表4）。

圖1 酵母菌株的PCR電泳圖Figure 1 PCR electrophoresis of yeast strains

圖2 20株酵母菌的RAPD聚類分析Figure 2 RAPD cluster analysis of 20 yeast strains

表4 不同產(chǎn)地不同葡萄品種所附酵母菌種屬Table 4 Different grape varieties attached yeast genera in different regions

3 討論與結(jié)論

從河北沙城、昌黎釀酒葡萄產(chǎn)地采集不同品種樣品，從葡萄表面共分離得到73株酵母菌，本次試驗隨機抽取了其中的30株進行相關(guān)研究。結(jié)果表明，所分離的菌株屬于7個不同的屬：酵母屬（Saccharomyces）、有孢漢遜酵母屬（Hanseniaspora）、畢赤氏酵母屬（Pichia）、酒香酵母屬（Brettanomyces）、克勒克酵母屬（Kloeckera）、假絲酵母屬（Candida）、隱球酵母屬（Cryptococcus）。各個菌株的形態(tài)學(xué)和生化特性都符合相應(yīng)的種屬，共分布于14個種。這一結(jié)果表明，釀酒葡萄果粒表皮上含有豐富的酵母菌資源，并可解釋因葡萄酒多年釀造，一些菌株在此環(huán)境中含量較高，并在葡萄表明形成優(yōu)勢生長的結(jié)果。與昌黎相比，沙城地區(qū)的晝夜溫差較大，總體氣溫偏低，所以初步推測兩地葡萄表面所附酵母菌種類差異可能與此有關(guān)。從鑒定結(jié)果可見，昌黎地區(qū)鑒定得到的種屬數(shù)要多于沙城地區(qū)，這可能由于昌黎的地理和氣候條件較為適宜酵母菌的生存，適合各類酵母菌的生長?？梢姡瑑傻叵嗤咸驯砻娼湍妇N存在很大差異。本研究對于葡萄果皮上所存在釀酒酵母種類、數(shù)量以及不同品種葡萄所附著的釀酒酵母的種類均具有重要的參考價值，為篩選適合該產(chǎn)區(qū)葡萄酒生產(chǎn)的優(yōu)良酵母菌種奠定了基礎(chǔ)。

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