李 周,賀富強(qiáng),楊惠敏,文 章,胡 承

(四川大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 成都 610064)

黃水是濃香型固態(tài)白酒發(fā)酵過程中營養(yǎng)物質(zhì)在微生物作用下形成的副產(chǎn)物,即糟醅淋漿與窖泥浸出物積淀到發(fā)酵池底,形成的黃色或者棕黃色具有特殊氣味的黏稠液體。黃水中含有大量可利用的營養(yǎng)物質(zhì),除含有醇、酸、醛、酯類等物質(zhì)外,還含有部分糖類物質(zhì)、含氮化合物和少量的單寧及色素等有機(jī)物。在以往的研究和生產(chǎn)中,黃水并未得到充分利用,且由于黃水的化學(xué)需氧量(chemical oxygen demand,COD)較高,通?？蛇_(dá)25 000～40 000 mg/L,其豐富的有機(jī)質(zhì)存在利用價值,若不充分利用則有造成環(huán)境污染的風(fēng)險[1]。

細(xì)菌纖維素(bacterial cellulose,BC)是由木醋桿菌(Acetobacter xylinum)、葡糖醋桿菌(Gluconacetobacter)等微生物發(fā)酵而來的。BC的結(jié)構(gòu)單位與植物纖維素相同,但BC具有高純度、高結(jié)晶度、高拉伸強(qiáng)度和較強(qiáng)的生物相容性等優(yōu)良特性[2]。近年來,BC已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品、造紙、生物醫(yī)學(xué)材料、生物吸附材料等領(lǐng)域,是BC生產(chǎn)成本高、產(chǎn)量低等問題成為了其工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)的瓶頸。如何利用較為廉價的資源來發(fā)酵產(chǎn)生更多的BC成為了目前研究的重點(diǎn)。

馬霞等[3]利用酒糟浸出液生產(chǎn)細(xì)菌纖維素,經(jīng)優(yōu)化后產(chǎn)量可提高140.6%,產(chǎn)量可達(dá)到14.44 g/L。陳慧慧等[4]利用楊木水解液生產(chǎn)BC,產(chǎn)量為3.14 g/L。KESHK S M[5]則發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加維生素C可以將BC的產(chǎn)量提高88%。ZENG X等[6]發(fā)現(xiàn)部分有機(jī)酸添加到HS培養(yǎng)基中可以顯著提高BC的產(chǎn)量。已有的研究表明[7],黃水中含有乙酸、檸檬酸等有利于BC生產(chǎn)的營養(yǎng)成分。本實(shí)驗(yàn)為探究葡糖醋桿菌利用黃水發(fā)酵產(chǎn)BC的可行性,將黃水按照不同體積比添加到HS培養(yǎng)基中,再將葡糖醋桿菌接種至50 mL發(fā)酵液中30℃靜置培養(yǎng)7 d后,測定BC產(chǎn)量和還原糖含量、總酸含量、pH值等指標(biāo),從而得到最佳的黃水體積比,再進(jìn)一步檢測最適黃水體積比下發(fā)酵過程中葡糖醋桿菌BC產(chǎn)量以及理化指標(biāo)的變化趨勢。以期為葡糖醋桿菌利用黃水發(fā)酵生產(chǎn)BC提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡糖醋桿菌(Gluconacetobacter)G29:由本實(shí)驗(yàn)室篩選和保藏；黃水:采樣于水井坊公司水井街基地窖池,4℃冰箱保存沉降,取上層液體。

葡萄糖、胰蛋白胨、酵母粉、檸檬酸、Na2HPO4·12H2O、瓊脂、氫氧化鈉、鹽酸(均為分析純):成都市科隆化學(xué)品有限公司。

對羥基苯甲酸酰肼(4-hydroxybenzoic acid hydrazide,PAHBAH)[8]:

A:0.5 mol/L HCl溶解的5%對羥基苯甲酸酰肼溶液,配好后4℃冰箱保存。

B:0.5 mol/L NaOH溶液

使用時將A與B按1∶9體積比混合即為對羥基苯甲酸酰肼試劑。

HS培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L,蛋白胨5 g/L,酵母粉5 g/L,檸檬酸1 g/L,Na2HPO45 g/L[9],pH值調(diào)為5.8,115℃滅菌30 min[9]。

1.2 儀器與設(shè)備

SQPPRACTUM224-1CN電子天平:賽多利斯科學(xué)儀器；PHS-2C筆式pH計:上?？祪x儀器有限公司；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱、HWS-150恒溫恒濕培養(yǎng)箱:北京中興偉業(yè)儀器有限公司；UV-2450紫外可見分光光度計:日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 不同黃水體積比對BC產(chǎn)量及發(fā)酵液理化性質(zhì)的影響

將黃水添加到HS培養(yǎng)基中,配制50 mL黃水-HS培養(yǎng)基,且使最終黃水所占體積比分別為:10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%,裝入250 mL錐形瓶中,pH值調(diào)節(jié)為5.8,115℃滅菌30 min。以HS培養(yǎng)基為對照,按照10%的接種量將經(jīng)過3次傳代的葡糖醋桿菌G29分別接種到黃水-HS培養(yǎng)基,30℃靜置培養(yǎng)7 d,測定發(fā)酵液的總酸含量、還原糖消耗量、糖轉(zhuǎn)化效率、pH值和BC產(chǎn)量[10]。

1.3.2 發(fā)酵過程中BC產(chǎn)量以及理化指標(biāo)的變化

選擇1.3.1節(jié)中BC產(chǎn)量最高時的黃水體積比,配制50mL培養(yǎng)基,裝入250 mL錐形瓶中。按照10%的接種量將葡糖醋桿菌G29接種到黃水-HS培養(yǎng)基中,以HS培養(yǎng)基作對照,30℃靜置培養(yǎng)7 d,每隔1 d進(jìn)行取樣,測定其總酸含量、還原糖消耗量、糖轉(zhuǎn)化效率、pH值和BC產(chǎn)量。

1.3.3 擴(kuò)大淺圓盤發(fā)酵對BC產(chǎn)量以及糖轉(zhuǎn)化效率的影響

選擇1.3.1節(jié)中BC產(chǎn)量最高時的黃水體積比,配制成500mL黃水-HS培養(yǎng)基,置于特制淺圓盤(直徑295mm)中,以HS培養(yǎng)基作對照,按照10%的接種量將葡糖醋桿菌G29接種到黃水-HS培養(yǎng)基中,30℃靜置培養(yǎng)7 d,測定其糖轉(zhuǎn)化效率和其BC產(chǎn)量。

1.3.4 分析方法

還原糖含量的測定[8]:采用對羥基苯甲酸酰肼(PAHBAH)試劑法。還原糖消耗量的計算公式如下:

還原糖消耗量=發(fā)酵前還原糖含量(g/L)-發(fā)酵后還原糖量(g/L)

單日還原糖消耗量N=還原糖含量N-1(g/L)-還原糖含量N(g/L)(N代表第N天,下同)

BC產(chǎn)量的測定[11]:將生成的BC膜用自來水多次沖洗浸泡除去其表面的雜質(zhì),至顏色較淡,再將膜置于80℃氫氧化鈉(1 mol/L)溶液中浸泡90 min,然后置于80℃蒸餾水中洗滌至中性,洗滌過程重復(fù)兩次,于烘箱中75℃烘干至恒質(zhì)量,稱質(zhì)量。BC產(chǎn)量計算公式如下:

總酸含量(以乙酸計)的測定參考GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》中的方法；pH值的測定參考GB 5009.237—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品pH值的測定》中的方法；乙醇含量的測定參考GB 5009.225—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)酒中乙醇濃度的測定》中的方法。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS22.0單因素方差分析(P＜0.05),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差,圖表分析由Excel2007完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃水的成分分析

將黃水靜置后取上層液體,檢測其總酸含量、pH值、還原糖含量、乙醇含量,結(jié)果見表1。

表1 黃水的理化指標(biāo)檢測結(jié)果Table 1 Detection results of physical and chemical indexes of"yellow water"

由表1可知,黃水中含有8.2 g/L的還原糖、4.73 g/L的總酸含量以及2.6%的乙醇。這些成分可以作為混合碳源被葡糖醋桿菌利用,而HS培養(yǎng)基組分中只有葡萄糖作為主要碳源,陳華美等[12]研究結(jié)果表明,多種混合碳源更有有利于菌株發(fā)酵。且黃水中含有的乙酸、乙醇等物質(zhì)已被張麗平等[13]研究證明有利于葡糖醋桿菌產(chǎn)生BC。因此,黃水具有發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的價值。

2.2 不同黃水體積比對BC產(chǎn)量以及發(fā)酵液理化性質(zhì)的影響

不同黃水體積比對葡糖醋桿菌的BC產(chǎn)量和發(fā)酵液中還原糖消耗量的影響如圖1所示。由圖1可知,隨著黃水體積比的增加BC產(chǎn)量呈先增后減的趨勢,當(dāng)黃水體積比為40%時,BC產(chǎn)量最高,可達(dá)5.93 g/L,比對照組的BC產(chǎn)量(2.20 g/L)提高了169.5%；繼續(xù)增加黃水體積比,發(fā)酵液中BC產(chǎn)量開始減少；當(dāng)黃水體積比分別為90%和100%時,混合培養(yǎng)基中基本不產(chǎn)生BC,原因可能是黃水雖然含有乙醇、乙酸等有利于葡糖醋桿菌產(chǎn)生BC的物質(zhì),但同樣也含有少量有毒物質(zhì)如糠醛等[14],抑制葡糖醋桿菌生長,此外黃水中還原糖含量較少,也可能是當(dāng)黃水體積比過高時制約BC產(chǎn)生的原因之一。當(dāng)黃水體積比＜50%時,還原糖消耗量均維持在10 g/L左右,比對照組略有提高；當(dāng)黃水體積比＞50%時,還原糖消耗量減少至8 g/L左右,當(dāng)黃水體積比至90%及以上時,還原糖消耗量接近零。結(jié)果表明,添加適量的黃水到HS培養(yǎng)基中能夠提高BC產(chǎn)量。

圖1 黃水體積比對細(xì)菌纖維素產(chǎn)量和還原糖消耗量的影響Fig.1 Effect of volume ratio of"yellow water"on bacterial cellulose yield and reducing sugar consumption

檢測不同黃水體積比的黃水-HS培養(yǎng)基發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液的pH值、總酸含量以及糖轉(zhuǎn)化效率,結(jié)果如表2所示。由表2可知,黃水-HS培養(yǎng)基發(fā)酵液的pH值在4.73～5.58之間,相比于對照組的pH值(3.38),有顯著的提高(P＜0.05),由于葡糖醋桿菌最適發(fā)酵pH值為4.0～6.0[5],因此黃水-HS培養(yǎng)基發(fā)酵液的pH更有利于BC的產(chǎn)生?？偹岷慨?dāng)黃水體積＞70%時有顯著提高(P＜0.05)；同時黃水的添加可以顯著提高葡糖醋桿菌的糖轉(zhuǎn)化效率(P＜0.05),當(dāng)黃水體積比為40%時,糖轉(zhuǎn)化效率達(dá)到最大為57.86%,相比對照組(23.25%)提高了148.9%,這可能是因?yàn)槠咸烟亲鳛樘荚磿r會產(chǎn)生副產(chǎn)物葡萄糖酸,降低培養(yǎng)基的pH[15],而黃水中的還原糖、有機(jī)酸、乙醇豐富了碳源,減少了葡萄糖酸的產(chǎn)生,這樣不僅可以維持pH的穩(wěn)定,也可以促使培養(yǎng)基中的葡萄糖更多地轉(zhuǎn)化為BC生物合成的基質(zhì),進(jìn)而提高糖轉(zhuǎn)化率[16],糖轉(zhuǎn)化效率高表明葡糖醋桿菌可以消耗相同的還原糖產(chǎn)生更多的BC。結(jié)果表明,黃水的添加可以使發(fā)酵液的pH維持在4.61～5.58之間,有利于BC的產(chǎn)生,同時能提高糖轉(zhuǎn)化效率。當(dāng)黃水體積比為40%時,葡糖醋桿菌的BC產(chǎn)量和糖轉(zhuǎn)化效率均為最高,因此選擇最佳黃水體積比為40%。

表2 不同黃水-HS培養(yǎng)基發(fā)酵結(jié)束后pH、總酸含量以及糖轉(zhuǎn)化效率的比較Table 2 Comparison of pH,total acid content and sugar conversion rate after fermentation of different"yellow water"-HS medium

2.3 發(fā)酵過程中BC產(chǎn)量以及理化指標(biāo)變化

圖2 發(fā)酵過程中單日還原糖消耗量和細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量Fig.2 Daily reducing sugar consumption and bacterial cellulose yield during fermentation

將葡糖醋桿菌分別接種于40%黃水-HS培養(yǎng)基和HS培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),每天取樣測定其單日還原糖消耗量和BC產(chǎn)量,結(jié)果如圖2所示。由圖2可知,40%黃水-HS培養(yǎng)基的單日BC產(chǎn)量呈先增后減的趨勢,且除第1天的BC產(chǎn)量較低外,從第2天起均保持較高水平(＞0.7 g/L),HS培養(yǎng)基的單日BC產(chǎn)量也呈先增加后減少的趨勢,但前兩天產(chǎn)細(xì)菌纖維素較少,第3天開始BC產(chǎn)量增加,且僅有第4天的BC產(chǎn)量較高(1.11 g/L),其余天數(shù)較低(＜0.6 g/L),說明40%黃水-HS培養(yǎng)基中的葡糖醋桿菌能更快地產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物BC,且能長時間的保持較高的BC產(chǎn)量,這可能是因?yàn)辄S水含有豐富的營養(yǎng)成分,促進(jìn)葡糖醋桿菌的快速繁殖,使培養(yǎng)基中的BC產(chǎn)量快速達(dá)到一個較高的水平；同時整個發(fā)酵過程中40%黃水-HS培養(yǎng)基的單日還原糖消耗量均在1.4g/L左右,而HS培養(yǎng)基中的單日還原糖消耗量波動較大,最大值為2.96 g/L,最小值為0.4 g/L,說明40%黃水-HS培養(yǎng)基中的葡糖醋桿菌代謝較為穩(wěn)定。

表3 40%黃水-HS培養(yǎng)基單日pH、總酸含量以及糖轉(zhuǎn)化效率的變化Table 3 Changes of daily pH,total acid content and sugar conversion rate of 40%"yellow water"-HS medium

表4 HS培養(yǎng)基單日pH、總酸含量以及糖轉(zhuǎn)化效率的變化Table 4 Changes of daily pH,total acid content and sugar conversion rate of HS medium

由表3和表4可知,在整個發(fā)酵過程中,40%黃水-HS培養(yǎng)基的pH值呈先減后增的趨勢,且維持在4.60～5.50之間,僅在第2天、第4天比初始pH值有顯著降低(P＜0.05),HS培養(yǎng)基的pH值則不斷降低,從第2天起均顯著低于未發(fā)酵培養(yǎng)基(P＜0.05),最后降為3.75,說明40%黃水-HS培養(yǎng)基的pH值更加穩(wěn)定；40%黃水-HS培養(yǎng)基的總酸含量從第2天開始相比于初始值有顯著增加(P＜0.05),最高可達(dá)0.480 g/L,但發(fā)酵結(jié)束時又回到初始值,而HS培養(yǎng)基的總酸含量從第3天起,均為0.200 g/L左右,顯著高于未發(fā)酵培養(yǎng)基(P＜0.05)；40%黃水-HS培養(yǎng)基和HS培養(yǎng)基的單日糖轉(zhuǎn)化效率均呈先增后減的趨勢,但40%黃水-HS培養(yǎng)基單日糖轉(zhuǎn)化效率均比同天數(shù)HS培養(yǎng)基高。這可能是因?yàn)殡m然在BC的合成過程中葡萄糖酸等酸性物質(zhì)會不斷積累,但黃水中的有機(jī)酸在培養(yǎng)基初始pH值的調(diào)整過程中會由于氫氧化鈉的添加而產(chǎn)生大量的弱酸鹽,能夠起到一定的緩沖作用；葡萄糖合成的多聚物是合成纖維素的主要原料,而黃水中的糖類物質(zhì)也可以作為葡糖醋桿菌的能源物質(zhì),這樣更多的葡萄糖可以用來合成纖維素,糖轉(zhuǎn)化效率也就提高了[17]。綜合發(fā)酵過程中BC產(chǎn)量、pH和糖轉(zhuǎn)化效率來看,40%黃水-HS培養(yǎng)基要優(yōu)于HS培養(yǎng)基,其黃水組分起到了良好的緩沖作用。

2.4 擴(kuò)大淺圓盤發(fā)酵對BC產(chǎn)量以及糖轉(zhuǎn)化效率的影響

由表5可知,擴(kuò)大淺圓盤發(fā)酵的40%黃水-HS培養(yǎng)基中BC產(chǎn)量為3.48 g/L,較對照組(1.62 g/L)提高了114.8%,較錐形瓶發(fā)酵(5.93 g/L)降低了41.4%；糖轉(zhuǎn)化效率為22.70%,較對照組(8.10%)提高了180.2%,較錐形瓶發(fā)酵(22.7%)降低了60.8%。說明發(fā)酵體系的擴(kuò)大后,40%黃水-HS培養(yǎng)基的BC產(chǎn)量和糖轉(zhuǎn)化效率仍顯著優(yōu)于對照組(P＜0.05),但相比于錐形瓶發(fā)酵時,葡糖醋桿菌的BC產(chǎn)量和糖轉(zhuǎn)化效率有所降低。原因可能是與錐形瓶發(fā)酵相比,擴(kuò)大淺圓盤發(fā)酵中表面積/發(fā)酵空間增大,液面上空間減少,氧氣總量降低,導(dǎo)致葡糖醋桿菌供氧不足,BC產(chǎn)量下降,這與KUO C H等[18]的研究結(jié)果一致。結(jié)果表明,40%黃水-HS培養(yǎng)基在擴(kuò)大發(fā)酵中仍優(yōu)于HS培養(yǎng)基。

表5 擴(kuò)大淺圓盤發(fā)酵細(xì)菌纖維素產(chǎn)量和糖轉(zhuǎn)化效率Table 5 Bacterial cellulose yield and sugar conversion rate during expanded shallow disk fermentation

3 結(jié)論

將黃水以不同體積比添加到HS培養(yǎng)基中進(jìn)行葡糖醋桿菌發(fā)酵生產(chǎn)BC,測定發(fā)酵7 d后發(fā)酵液中BC產(chǎn)量和還原糖消耗量等指標(biāo)。結(jié)果表明,黃水最佳體積比為40%,在此條件下,BC產(chǎn)量為5.93g/L,相比對照組(HS培養(yǎng)基)提高了169.5%；糖轉(zhuǎn)化效率為57.86%,相比對照組提高了148.9%。進(jìn)一步檢測發(fā)酵過程中葡糖醋桿菌BC產(chǎn)量以及理化指標(biāo)變化,40%黃水-HS培養(yǎng)基單日BC產(chǎn)量均保持較高水平,最大值為1.14 g/L；單日糖轉(zhuǎn)化效率均高于同時期的對照組；pH值維持在4.60～5.50之間。在擴(kuò)大淺圓盤發(fā)酵中,40%黃水-HS培養(yǎng)基中BC產(chǎn)量為3.48 g/L,糖轉(zhuǎn)化效率為22.70%,與對照組相比,也均有顯著提高(P＜0.05)。黃水作為HS培養(yǎng)基的補(bǔ)充不僅提高了BC產(chǎn)量,也為開發(fā)利用黃水這一白酒工業(yè)副產(chǎn)物提供了新的途徑。

[1]徐傳鴻,余有貴,張文武.黃水的理化分析及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報,2014,5(12):4011-4017.

[2]WUJM,LIURH.Thinstillagesupplementationgreatlyenhancesbacterial cellulose production byGluconacetobacter xylinus[J].Carbohyd Polym,2012,90(1):116-121.

[3]馬 霞,董炎炎,于海燕.酒糟浸出液發(fā)酵產(chǎn)細(xì)菌纖維素工藝優(yōu)化[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報,2015,31(8):302-307.

[4]陳慧慧,劉 玉,王慧梅.利用楊木水解液制備細(xì)菌纖維素[J].生物技術(shù)通報,2017,33(3):144-150.

[5]KESHK S M.Vitamin C enhances bacterial cellulose production in Gluconacetobacter xylinus[J].Carbohyd Polym,2014,99(1):98-100.

[6]ZENG X,SMALL D P,WAN W.Statistical optimization of culture conditions for bacterial cellulose production byAcetobacter xylinum BPR2001frommaplesyrup[J].Carbohyd Polym,2011,85(3):506-513.

[7]馮興壵,鄧 杰,謝 軍,等.白酒釀造副產(chǎn)物黃水綜合利用現(xiàn)狀淺析[J].中國釀造,2017,36(2):6-9.

[8]LEVER M.Carbohydrate determination with 4-hydroxybenzoic acid hydrazide(PAHBAH):Effect of bismuth on the reaction[J].Anal Biochem,1977,81(1):21-27.

[9]SCHRAMM M,HESTRIN S.Factors affecting production of cellulose at the air/liquid interface of a culture ofAcetobacter xylinum[J].J Gen Microbiol,1954,11(1):123-129.

[10]王海波,關(guān)鳳梅,馬 霞,等.改性細(xì)菌纖維素的發(fā)酵生產(chǎn)及性能測定[J].食品科技,2009,34(5):28-31.

[11]張勝潮,曾祥勇,董雅舒,等.神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和遺傳算法優(yōu)化細(xì)菌纖維素培養(yǎng)參數(shù)[J].四川大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2014,51(2):371-377.

[12]陳華美,劉四新,李從發(fā).細(xì)菌纖維素的生物合成與發(fā)酵研究進(jìn)展[J].熱帶作物學(xué)報,2016,37(8):1651-1657.

[13]張麗平,盧紅梅,戴 銳,等.乙醇及有機(jī)酸對木醋桿菌合成細(xì)菌纖維素的影響[J].食品工業(yè)科技,2014,35(4):161-165.

[14]王傳榮,沈洪濤.黃水在新型白酒生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].中國釀造,2005,24(2):26-28.

[15]KESHK S,SAMESHIMA K.Influence of lignosulfonate on crystal structure and productivity of bacterial cellulose in a static culture[J].Enzyme Microbial Technol,2006,40(1):4-8.

[16]馬 霞,王瑞明,關(guān)鳳梅,等.非碳水化合物對木醋桿菌合成細(xì)菌纖維素影響規(guī)律的初探[J].中國釀造,2003,22(4):15-17.

[17]TODA K,ASAKURA T,FUKAYA M,et al.Cellulose production by acetic acid-resistantAcetobacter xylinum[J].J Ferment Bioeng,1997,84(3):228-231.

[18]KUO C H,CHEN J H,LIOU B K,et al.Utilization of acetate buffer to improve bacterial cellulose production byGluconacetobacter xylinus[J].Food Hydrocolloid,2016,53(1):98-103.