喬 慧,韓廷玉,張慶芳*

(1.大連大學 生命科學與技術學院,遼寧 大連 116622；2.遼寧省海洋微生物工程技術研究中心,遼寧 大連 116622)

浩瀚的海洋是地球上生命的搖籃,海洋特有的環(huán)境造就了海洋微生物種類的多樣性、獨特性以及其代謝產(chǎn)物的多樣性。海洋微生物種類多達100萬種以上,而目前所研究和鑒定的海洋微生物還不到總量的5%[1],已發(fā)現(xiàn)的活性物質(zhì)只占總數(shù)的1%[2]。且目前獲得的產(chǎn)酶菌株普遍存在著產(chǎn)酶成本高、酶活性不穩(wěn)定等問題,因此尋找更高效、具有市場競爭力的菌種資源是當務之急。從一些特殊和極端環(huán)境中(如海洋、極地、鹽湖、溫泉、火山口附近等)篩選出的產(chǎn)酶活性菌株,一般都具有獨特的酶學性質(zhì),如耐高溫、耐寒、耐高鹽、耐強酸強堿等特性,可擴大所需酶的應用范圍。其中海洋環(huán)境作為新型生物活性物質(zhì)的源泉[3],海洋真菌作為主要的產(chǎn)酶微生物[4],由于對其特殊生長環(huán)境(高壓、無光照、低溫、低營養(yǎng)及局部高溫等極限環(huán)境)的適應,形成了獨特的遺傳特性和代謝類型,因此可產(chǎn)生不同于陸源真菌的生物活性物質(zhì)[5-7]。了解海洋真菌產(chǎn)酶情況對了解其生物性質(zhì)和生產(chǎn)次級代謝物的機理有重要意義,也可利用海洋真菌造福人類、保護環(huán)境,所以VRIJMOED教授(1982年)首次報道南海海域木生海洋真菌的種類、分布、季節(jié)動態(tài)變化對木生海洋真菌的影響后[8-10],我國陸續(xù)開展了對海洋真菌的研究。目前,我國對海洋微生物的研究多是對南海海域生物種類調(diào)查及海洋天然物的研究,而且多集中在海洋細菌上,僅涉及少量的海洋真菌[11-19],限制了對海洋真菌資源的利用。

本研究從渤海海洋環(huán)境中進行真菌的分離和篩選,并對其產(chǎn)酶能力進行初步研究,旨在發(fā)掘具有產(chǎn)酶活性的海洋真菌資源,考察渤海海洋微生物真菌資源的產(chǎn)酶潛能,以期為渤海海洋中真菌的進一步開發(fā)利用提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

海水、海藻:采集自大連麗嬌灣和金石灘,于滅菌的試管(錐形瓶)內(nèi)4℃冷藏備用。

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)分離培養(yǎng)基[20]:取去皮馬鈴薯200 g,切成小塊或片狀,加適量陳海水煮沸30min,濾去馬鈴薯塊,將濾液補足至1000mL,加葡萄糖20 g,瓊脂20 g,溶解后分裝,pH自然。

淀粉酶篩選培養(yǎng)基[21]:將可溶性淀粉代替PDA分離培養(yǎng)基中的葡萄糖,其他成分同PDA分離培養(yǎng)基,pH自然。

纖維素酶篩選培養(yǎng)基[22-23]:10 g羧甲基纖維素鈉,4 g(NH4)2SO4,2 g KH2PO4,0.5 g MgSO4·7H2O,0.5 g NaCl,1 g蛋白胨,20 g瓊脂,1 000 mL陳海水,pH 5.5。

蛋白酶篩選培養(yǎng)基[24]:4.0g干酪素,20g瓊脂,用0.1mol/L,pH 7.0的磷酸鹽緩沖液配制成1 000 mL培養(yǎng)基。

脂肪酶篩選培養(yǎng)基[25-26]:3.0 g NaNO3,1.0 g K2HPO4,0.5gKCl,0.5gMgSO4·7H2O,0.01gFeSO4·7H2O,20g瓊脂,24 g香油,0.016 g中性紅,1 000 mL陳海水,pH值自然。

植酸酶篩選培養(yǎng)基[27]:3 g植酸鈣,30 g葡萄糖,5 g NH4NO3,0.5gKCl,0.03gMgSO4·7H2O,0.03gFeSO4·7H2O,20 g瓊脂,1 000 mL陳海水,pH 5.5。

以上培養(yǎng)基均在0.1 MP、121℃滅菌20 min。

1.1.3 試劑

多增氧：溶氧決定產(chǎn)量，多開增氧機增氧，曝氣、調(diào)水的效果好。使用羅茨風機加納米管或納米盤增氧，功率可達10瓦/立方水體，產(chǎn)量也可達10斤/立方水體。

羧甲基纖維素鈉、(NH4)2SO4、MgSO4·7H2O、NaCl、FeSO4·7H2O(均為分析純)、蛋白胨、瓊脂(均為生物試劑):生工生物(上海)股份工程有限公司；干酪素、NaNO3、K2HPO4、植酸鈣(均為分析純):大連凱美化工工程配套有限公司。

1.2 儀器與設備

HD-1360型超凈工作臺:北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；HZP-250全溫振蕩培養(yǎng)箱、DK-S26電熱恒溫水浴鍋:上海精宏實驗設備有限公司；LTI-700低溫恒溫培養(yǎng)箱:上海愛朗儀器有限公司；DHG-9070電熱恒溫鼓風干燥箱:上海一恒科技有限公司；UV-2102C紫外可見分光光度計:龍尼柯儀器有限公司；LDZX-40BI立式壓力蒸汽滅菌器:上海審安醫(yī)療器械廠；CX21FS1顯微鏡:日本奧林巴斯株式會社。

1.3 方法

1.3.1 海洋真菌的分離、純化及保藏

稱取1.0g樣品,在無菌條件下加入裝有9 m L無菌水的小三角瓶中,搖勻,25℃預培養(yǎng)3 d,備用。分別取100 μL預培養(yǎng)的懸浮液涂布于PDA分離培養(yǎng)基上,于25℃恒溫倒置培養(yǎng)4～7 d,對平板上生長且形態(tài)不同的菌落進行編號并記錄。將分離得到的真菌菌株用點種法接種到新的PDA分離培養(yǎng)基中,25℃培養(yǎng)4 d后,劃線接種進行純化,以得到純種的單菌落。

將形成單菌落的菌種劃線接種到PDA斜面上,編號,25℃培養(yǎng)4～6 d,待菌長滿斜面時轉(zhuǎn)移到4℃冰箱中保藏。

1.3.2 特定產(chǎn)酶真菌的篩選

采用篩選培養(yǎng)基法對分離得到的海洋真菌進行產(chǎn)酶能力的篩選,將純化后的單菌落點接至5種酶篩選培養(yǎng)基上,每個菌落在平板上點接3個重復,25℃恒溫培養(yǎng)4～7 d,通過特征反應判斷真菌是否產(chǎn)生此種酶,本研究中主要判斷各種真菌是否產(chǎn)淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶、脂肪酶和植酸酶。

(1)將接種的淀粉酶篩選培養(yǎng)基于25℃培養(yǎng)4 d后,用盧戈氏碘液染色,以菌落周圍是否出現(xiàn)水解透明圈及其大小為評價指標,篩選產(chǎn)淀粉酶真菌。

(2)將接種的纖維素酶篩選培養(yǎng)基于25℃培養(yǎng)6 d后,用2 mg/mL剛果紅染液染色2 h,棄去染液,用1 mol/L NaCl溶液脫色1 h,以菌落周圍是否出現(xiàn)水解透明圈及其大小為評價指標,篩選產(chǎn)纖維素酶真菌。

(3)將接種的蛋白酶篩選培養(yǎng)基于25℃培養(yǎng)3 d,以菌落周圍是否出現(xiàn)水解透明圈及其大小為指標,篩選產(chǎn)蛋白酶真菌。

(4)將接種的脂肪酶篩選培養(yǎng)基于25℃培養(yǎng)3 d,以菌落周圍是否出現(xiàn)水解透明圈及其大小為評價指標,篩選產(chǎn)脂肪酶真菌。

(5)將接種的植酸酶篩選培養(yǎng)基于25℃培養(yǎng)3 d,以菌落周圍是否出現(xiàn)水解透明圈及其大小為評價指標,篩選產(chǎn)植酸酶真菌。

記錄產(chǎn)酶菌株編號,測定菌落直徑(r)(cm)和透明圈直徑(R)(cm),以透明圈直徑與菌落直徑的比值(R/r)表示酶活大小,R/r值越大,表明酶活越強。

1.3.3 產(chǎn)酶真菌的鑒定

將篩選出產(chǎn)酶真菌接種到PDA平板上,25℃培養(yǎng),觀察平板中菌株從開始生長到長出大量孢子這個過程中的菌落生長狀況、菌落顏色、形態(tài)、大小,以及菌落在PDA平板正反面的顏色差別、菌落邊緣和表面的質(zhì)地、紋飾、滲出物、氣味、菌絲的粗細高矮、生長密度、孢子顏色等[28,18]。并通過對菌株菌落特征的觀察,參考有關真菌鑒定文獻[30],同時結(jié)合《真菌鑒定手冊》[29]對分離菌株進行鑒定,判斷其種屬。

2 結(jié)果與分析

2.1 海洋真菌的分離及純化

利用PDA分離培養(yǎng)基自渤海局部海域的海水、海藻樣品中經(jīng)過多次分離、純化,并根據(jù)菌落形態(tài)和顯微形態(tài)的觀察排除重復的菌株,共篩選分離出32株海洋真菌。

2.2 產(chǎn)酶海洋真菌的篩選、鑒定

將以上32株海洋真菌菌株接種在5種產(chǎn)酶篩選培養(yǎng)基上產(chǎn)酶菌株種屬分類統(tǒng)計結(jié)果見圖1。

圖1 產(chǎn)酶海洋真菌屬種分類單元統(tǒng)計結(jié)果Fig.1 Statistical results of genus and species taxon of enzyme-producing marine fungi

由圖1可知,這些產(chǎn)酶菌株分布于4個屬,其中6株菌歸為青霉屬(Penicilliumsp.),占總篩選產(chǎn)酶菌株數(shù)的33.33%；6株菌歸為曲霉屬(Aspergillussp.)及其亞屬,其中包括泡波曲霉屬(Emericellasp.)、堅壁曲霉屬(Carpentelessp.)、黃絲曲霉屬(Talaromycessp.)各有1株,占總篩選產(chǎn)酶菌株數(shù)的33.35%；4株菌歸為酵母屬(Saccharomycessp.),占總篩選產(chǎn)酶菌株數(shù)的22.22%；2株菌歸為毛霉屬(Mucorsp.),占總篩選產(chǎn)酶菌株數(shù)的11.10%；未產(chǎn)酶的真菌菌株有14株,可能是菌株不產(chǎn)以上5種酶,或者是菌株本身不具有產(chǎn)酶活性,也可能是菌株長期保藏傳代而失去活性。

2.3 產(chǎn)酶活性大小的研究

對照真菌鑒定手冊[29]和《常見及常用真菌》[30],按菌落形態(tài)、大小、顏色變化及菌絲的顯微結(jié)構等對32株海洋真菌菌株進行逐一比對,產(chǎn)酶菌株的篩選結(jié)果及其分類學地位見表1。

由表1可知,從32株海洋真菌菌株中共篩選出產(chǎn)酶菌株18株,其中有1株菌同時產(chǎn)4種酶,3株菌同時產(chǎn)3種酶,8株菌同時產(chǎn)2種酶。將18株產(chǎn)酶菌株分別點接于淀粉酶篩選培養(yǎng)基,篩選出6株產(chǎn)淀粉酶菌株,占產(chǎn)酶菌株的33.33%；其中優(yōu)勢菌群為酵母屬(Saccharomycessp.),含海洋真菌4株,占產(chǎn)淀粉酶真菌的66.67%。比較菌株的R/r值,結(jié)果顯示除菌株7外,其余5株菌的R/r均＞1.50,產(chǎn)淀粉酶能力較高,其中菌株31產(chǎn)淀粉酶能力最高,R/r為1.83。

將18株菌株分別點接于纖維素酶篩選培養(yǎng)基,篩選出10株產(chǎn)纖維素酶菌株,占產(chǎn)酶菌株的55.56%,其中優(yōu)勢菌群為曲霉屬(Aspergillussp.),含海洋真菌6株,占產(chǎn)纖維素酶真菌的60%,其次為酵母屬(Saccharomycessp.)和青霉屬(Penicilliumsp.),各占產(chǎn)纖維素酶真菌的20%。比較菌株的R/r值,結(jié)果顯示,菌株2、9、16、25、27的R/r均≥1.50,而菌株9、27的R/r值甚至超過3.00,其中又以菌株27的產(chǎn)纖維素酶能力最高,R/r值為3.12。

表1 產(chǎn)酶海洋真菌的篩選及其分類學地位Table 1 Screening and taxonomic status of enzyme-producing marine fungi

將18株產(chǎn)酶菌株點接于蛋白酶篩選培養(yǎng)基,篩選出5株產(chǎn)蛋白酶菌株,占產(chǎn)酶菌株的27.78%,其中優(yōu)勢菌群為酵母屬(Saccharomycessp.)和青霉屬(Penicilliumsp.),各占產(chǎn)蛋白酶真菌的40%。比較菌株的R/r值,結(jié)果顯示菌株9、29、30產(chǎn)酶能力較高,R/r值在1.50以上,其中又以菌株9產(chǎn)蛋白酶能力最強,R/r值為2.80。

將18株產(chǎn)酶菌株點接于脂肪酶篩選培養(yǎng)基,篩選出3株產(chǎn)脂肪酶菌株,占產(chǎn)酶菌株的16.67%,其中優(yōu)勢菌群為曲霉屬(Aspergillussp.),含海洋真菌2株,占產(chǎn)脂肪酶真菌的67.67%。比較菌株的R/r值,結(jié)果顯示菌株29,產(chǎn)脂肪酶能力最強,R/r值為1.75。

將18株產(chǎn)酶菌株點接于植酸酶篩選培養(yǎng)基,篩選出11株產(chǎn)植酸酶菌株,占產(chǎn)酶菌株的61.11%,其中優(yōu)勢菌群為曲霉(亞)屬(Aspergillussp.),含海洋真菌5株,占產(chǎn)植酸酶真菌的45.45%,其次為青霉屬(Penicilliumsp.),含海洋真菌3株,占產(chǎn)植酸酶菌株的27.27%。比較菌株的R/r值,結(jié)果顯示11株產(chǎn)植酸酶菌株的產(chǎn)酶能力均較高,R/r值均在1.5以上,其中有9株菌株的R/r值在2.0以上,菌株26的產(chǎn)酶能力最強,R/r值為3.47。

3 結(jié)論

本研究從三個地區(qū)海水、海藻中分離得到32株海洋真菌,產(chǎn)酶菌株18株,分布于4個屬。其中優(yōu)勢屬為曲霉屬(Aspergillussp.)和青霉屬(Penicilliumsp.),各6株,占總篩選產(chǎn)酶菌株數(shù)的33.33%,其次為酵母屬(Saccharomyces sp.),占總篩選產(chǎn)酶菌株數(shù)的22.22%。在6株產(chǎn)淀粉酶菌株中,菌株31(屬于Penicilliumsp.)產(chǎn)淀粉酶能力最高；10株產(chǎn)纖維素酶菌株中,菌株27(屬于Aspergillussp.)產(chǎn)纖維素酶能力最高；5株產(chǎn)蛋白酶菌株中,菌株9(屬于Saccharomyces sp.)產(chǎn)蛋白酶能力最強；3株產(chǎn)脂肪酶菌株中,菌株29(屬于Penicilliumsp.)產(chǎn)脂肪酶能力最強；11株產(chǎn)植酸酶菌株中,菌株26(屬于Aspergillussp.)的產(chǎn)酶能力最強。本研究還發(fā)現(xiàn)有1株同時產(chǎn)4種酶,3株同時產(chǎn)3種酶,8株同時產(chǎn)2種酶,結(jié)果表明,同一屬的不同種,其產(chǎn)酶特性存在很大的差別,體現(xiàn)了海洋真菌的產(chǎn)酶多樣性。本研究為后續(xù)渤海海域產(chǎn)酶真菌資源的開發(fā)和應用研究奠定理論基礎。

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