高效離子交換色譜法分析青枯雷爾氏菌Tn5轉(zhuǎn)座子突變菌株的異質(zhì)性

鄭雪芳，劉波，朱育菁，陳德局，陳小強

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高效離子交換色譜法分析青枯雷爾氏菌Tn5轉(zhuǎn)座子突變菌株的異質(zhì)性

鄭雪芳，劉波，朱育菁，陳德局，陳小強

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所， 福州 350003）

【目的】研究青枯雷爾氏菌（）Tn5轉(zhuǎn)座子突變菌株的異質(zhì)性，篩選出無致病力高效生防菌株?！痉椒ā坷靡褬?gòu)建的青枯雷爾氏菌致病力參考指標(biāo)“弱化指數(shù)（attenuation index，AI）”和接種番茄植株的生物測定法對60株供試的青枯雷爾氏菌Tn5轉(zhuǎn)座子突變菌株進行致病力測定；利用高效離子交換色譜法研究不同致病力突變菌株的色譜行為異質(zhì)性；構(gòu)建色譜效價指數(shù)（chromatography titer index, CTIi），CTIi=Si/（S1+S2+S3）×100%（i=1、2或3；S1、S2和S3分別對應(yīng)P1、P2和P3的峰面積），測定不同致病力青枯雷爾氏菌突變菌株的CTIi值，用皮爾遜相關(guān)系數(shù)（Pearson correlation coefficient，PCC）分析色譜效價指數(shù)與突變菌株的致病力和青枯病害防治效果的相互關(guān)系?！窘Y(jié)果】基于AI值和生物測定結(jié)果，青枯雷爾氏菌Tn5轉(zhuǎn)座子突變菌株具有3種不同致病力類型：強致病力、無致病力和中間型。強致病力菌株共33株，其AI值介于0.49—0.63，接種番茄15 d，植株發(fā)病率為66.33%—100%；無致病力菌株共有20株，其AI值介于0.78—0.89，接種番茄15 d，植株發(fā)病率為0；中間型菌株共有7株，其AI值介于0.68—0.73，接種番茄15 d，植株發(fā)病率為24.17%—45.92%。20株無致病力突變菌株對番茄青枯病的防治效果測定結(jié)果顯示，防治效果介于16.68%—92.45%，菌株T831防治效果最好，達91.74%，其次是菌株T780，防治效果為87.51%，菌株T497防治效果最差，為16.68%。不同致病力青枯雷爾氏菌的高效離子交換色譜分離結(jié)果顯示，青枯雷爾氏菌經(jīng)高效離子交換色譜可以分離出P1（出峰時間為0.6 min）、P2（出峰時間為4.4或4.5 min）和P3峰（出峰時間為5.9或6.0 min）；強致病力菌株和無致病力菌株均具有3種不同峰類型：單峰、雙峰和3個峰，強致病力菌株的主峰為P3峰，無致病力菌株的主峰為P1峰，中間型菌株有雙峰和3個色譜峰兩種類型；強致病力菌株中CTI3為100%的菌株，致病力最強，誘導(dǎo)番茄植株發(fā)病率均達85%以上，CTI3＜100%的菌株，接種后番茄植株發(fā)病率介于66.33%—84.14%；無致病力菌株中CTI1達100%的菌株，其防治效果高，均達到80%以上，CTI1＜90%的菌株，其防治效果低，介于16.68%—63.62%；CTI3與突變菌株致病力呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)PCC值為0.62；CTI1與無致病力突變菌株的防治效果呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)PCC值為0.80?！窘Y(jié)論】青枯雷爾氏菌Tn5轉(zhuǎn)座子突變菌株具有3種致病力類型，不同致病力菌株的色譜行為不同。構(gòu)建的色譜效價指數(shù)CTI1可用于快速篩選出無致病力高效生防菌株，CTI3可作為青枯雷爾氏菌致病力的參考指標(biāo)。

高效離子交換色譜；青枯雷爾氏菌；青枯??；Tn5轉(zhuǎn)座子；突變菌株

0 引言

【研究意義】由青枯雷爾氏菌（）[1]引起的青枯病堪稱植物“癌癥”，一旦發(fā)病，難以防治，造成植物大面積枯萎死亡[2]。生產(chǎn)上主要依靠化學(xué)農(nóng)藥[3]、抗性品種[4]、輪作[5]、土壤修復(fù)劑[6]等防治方法，但由于各種條件限制，均未能達到預(yù)期的防治效果。青枯雷爾氏菌的無致病力菌株可以侵染植株，不引起寄主植物產(chǎn)生病害，可在導(dǎo)管及相鄰組織內(nèi)廣泛分布，利用生態(tài)位點競爭和營養(yǎng)競爭阻止或延遲強致病力病原菌的侵入，或者激發(fā)植物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗病反應(yīng)，從而防止或延遲植株發(fā)病[7]。利用青枯雷爾氏菌的無致病力菌株研發(fā)植物疫苗，在作物苗期預(yù)先接種（類似動物的疫苗接種），可對青枯病防治起到良好作用[8]。【前人研究進展】利用無致病力青枯雷爾氏菌防治作物青枯病已有許多成功的報道。Frey等[9-11]利用基因工程法獲得的無致病力-突變體防治番茄青枯病，均取得良好的防病效果；肖田等[12]從茄子、番茄、辣椒、煙草青枯病株中分離出116株無致病力青枯雷爾氏菌，其中有2株菌具有較好的溫室控病效果，20 d后的相對防治效果分別為58.4%和97%；此外，Trigalet等[13-15]分別通過轉(zhuǎn)座子Tn5插入誘變、紫外誘變法、生防菌致弱等途徑獲得青枯雷爾氏菌無致病力突變菌株防治青枯病，均取得較好的防治效果。然而，在自然狀態(tài)下，青枯雷爾氏菌致病力分化嚴(yán)重[16-18]，存在不同致病力菌株混雜現(xiàn)象[19]，經(jīng)繼代培養(yǎng)和回接植株也會出現(xiàn)菌株致病力分化現(xiàn)象[20-21]。鄭雪芳等[22]研究發(fā)現(xiàn)，青枯雷爾氏菌無致病力突變菌株對番茄青枯病的防治效果差異大（8.3%—100%），可能與青枯雷爾氏菌存在不同致病力菌株混雜現(xiàn)象有關(guān)。利用青枯雷爾氏菌無致病力菌株研發(fā)植物疫苗，要求菌株必須具有高純度，才能保證其在生防應(yīng)用中生物學(xué)特性和防治效果都具有很好的穩(wěn)定性。傳統(tǒng)的平板劃線、稀釋培養(yǎng)、毛細管電泳等分離方法，很難鑒定出高純度的青枯雷爾氏菌[23-25]?！颈狙芯壳腥朦c】青枯雷爾氏菌在致病力分化過程中，不同致病力菌株的細胞表面特性會發(fā)生相應(yīng)改變[19]。林娟等根據(jù)青枯雷爾氏菌單細胞表面化學(xué)組成和所帶電荷的不同，以強陰離子交換樹脂為介質(zhì)，利用高效離子交換色譜成功實現(xiàn)對不同致病力的青枯雷爾氏菌的快速分離[19,26]。目前已對青枯雷爾氏菌高效離子交換色譜分離條件進行優(yōu)化，縮短了分離時間（分離一個樣品僅需15 min），提高了分離效率[27]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】筆者前期利用Tn5插入誘變獲得一批不同致病力的青枯雷爾氏菌突變菌株，本研究利用高效離子交換色譜對不同致病力突變菌株進行色譜行為分析，進而分析青枯雷爾氏菌突變菌株的色譜行為與其致病力和病害防治效果的相互關(guān)系，為青枯雷爾氏菌的致病力快速鑒別和高防治效果無致病力菌株的篩選提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

試驗于2016—2017年在福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所完成。

1.1 儀器及材料

高效液相色譜儀（Agilent HPLC 1100，美國Agilent公司）、紫外-可見分光光度計（UV-2550，日本島津公司）、Leica體式顯微鏡（Leica DMI3000，德國Leica公司）、高速冷凍離心機（Eppendorf 5418R，德國Eppendorf公司）、恒溫培養(yǎng)箱（BI250AG，施都凱儀器設(shè)備有限公司）、超凈工作臺（SW-CJ-1F，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）。

不同致病力青枯雷爾氏菌突變菌株是以青枯雷爾氏菌強致病力菌株FJAT-91為出發(fā)菌株，利用轉(zhuǎn)座子EZ-Tn5插入誘變獲得，供試菌株信息詳見表1。番茄種苗購自廈門如意情集團開發(fā)有限公司，品種為金石王1號。青枯雷爾氏菌鑒別培養(yǎng)基為TTC（1%蛋白胨、0.1%水解酪蛋白、0.5%葡萄糖、1.8%瓊脂和0.05% 2,3,5-氯化三苯基四氮唑），液體培養(yǎng)基為SPA培養(yǎng)基（2%蔗糖、0.5%蛋白胨、0.05% KH2PO4和0.0025% MgSO4）。色譜分離所需平衡緩沖液（A液）：0.02 mol·L-1哌嗪-HCl，洗脫緩沖液（B液）：0.02 mol·L-1哌嗪-HCl+1 mol·L-1NaCl。

1.2 試驗方法

1.2.1 青枯雷爾氏菌突變菌株的致病力鑒定

（1）形態(tài)鑒定：供試菌株在TTC平板上活化，30℃、48 h后，在Leica M165FC體視顯微鏡觀察菌落形態(tài)。參照劉波等[15]方法，用弱化指數(shù)（attenuation index，AI）作為青枯雷爾氏菌致病性力的鑒別指標(biāo)，AI為青枯雷爾氏菌菌落的紅斑直徑與菌落直徑的比值，AI＜0.65為強致病力菌株，AI＞0.75為無致病力菌株，AI介于0.65—0.75為中間型菌株。在TTC平板上，每個菌株隨機選取10個單菌落，在Leica M165FC電動熒光體視顯微鏡下測量并計算弱化指數(shù)，取平均值。

（2）生物測定：供試菌株在TTC平板活化后，接種SPA培養(yǎng)基中，170 r/min、30℃振蕩培養(yǎng)48 h，菌液稀釋至1×108CFU/mL，采用傷根灌注法接種至2—3葉齡的番茄盆栽苗（80 mL/盆），以清水為對照，每處理10盆（4株/盆），3次重復(fù)，每天觀察植株發(fā)病情況，計算發(fā)病率。

1.2.2 無致病力突變菌株的防治效果試驗 將無致病力突變菌株在TTC平板活化后，接種SPA培養(yǎng)基中，30℃、170 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，菌液稀釋至1×108CFU/mL，接種2—3葉齡的番茄盆栽苗（80 mL/盆），3 d后再接種強致病力青枯雷爾氏菌FJAT-91（接種濃度1×108CFU/mL，接種量80 mL/盆），單接種FJAT-91作為對照，每處理10盆（4株/盆），3次重復(fù)，每天觀察植株發(fā)病情況，計算防治效果。

1.2.3 青枯雷爾氏菌的高效離子交換色譜分析

（1）樣品制備：供試菌株經(jīng)TTC培養(yǎng)基活化后，轉(zhuǎn)接于SPA液體培養(yǎng)基中，30℃、170 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后，取1 mL菌液，8 000 r/min離心10 min，用雙蒸水洗滌沉淀物2次，加入200 μL雙蒸水溶解，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）色譜體系及分離方法：色譜分離材料采用的是強陰離子交換樹脂，色譜柱規(guī)格200 mm×4.6 mm i.d，流速2 mL·min-1，溫度范圍23—28℃。色譜分離方法：樣品（20 μL）上樣后，在0—3 min時用A液進行平衡；在3—8 min時進行線性梯度洗脫，洗脫梯度為0—75%的B液；在8—12 min時，為100%洗脫緩沖液（B液）；在12—15 min時轉(zhuǎn)換為平衡緩沖液（100% A液）以平衡系統(tǒng)，從而為下一次試驗做準(zhǔn)備。

（3）檢測系統(tǒng)：整個系統(tǒng)采用紫外檢測器進行檢測，檢測波長為260 nm。

1.2.4 青枯雷爾氏菌色譜效價指數(shù)的構(gòu)建 前期研究發(fā)現(xiàn)[24]，青枯雷爾氏菌經(jīng)高效離子交換色譜分離出3個特征譜峰：P1、P2和P3，其中P1和P3分別是無致病力菌株和強致病力菌株的特征峰。構(gòu)建青枯雷爾氏菌色譜效價指數(shù)（chromatography titer index，CTIi），CTIi=Si/（S1+S2+S3）×100%（i=1、2或3；S1、S2和S3分別對應(yīng)P1、P2和P3的峰面積），i=1且CTI1為100%時，只有P1峰；i=3且CTI3為100%時，只有P3峰；i=1、2或3且0＜CTIi＜100%時，有2個或3個色譜峰。

1.2.5 青枯雷爾氏菌色譜效價指數(shù)與其致病力和病害防治效果的相互關(guān)系 用皮爾遜相關(guān)系數(shù)（Pearson correlation coefficient，PCC）分析青枯雷氏菌強致病力菌株的色譜效價指數(shù)CTI3與其致病力的相互關(guān)系，無致病力菌株CTI1與病害防治效果的相互關(guān)系。（1）將強致病力菌株的色譜效價值CTI3和其致病力（以接種后番茄植株發(fā)病率為致病力指標(biāo)）構(gòu)成矩陣，以CTI3和致病力為指標(biāo)，以不同強致病力菌株為樣本計算PCC；（2）將無致病力菌株的色譜效價值CTI1和其病害防治效果構(gòu)成矩陣，以CTI1和病害防治效果為指標(biāo)，以不同無致病力菌株為樣本，計算PCC。PCC計算公式如下[28]：

其中，變量表示強致病力菌株的CTI3或無致病力菌株的CTI1，分別表示強致病力菌株的致病力或無致病力突變菌株的防治效果值，表示樣本總數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 青枯雷爾氏菌突變菌株的致病力鑒別

供試青枯雷爾氏菌突變菌株在TTC平板上呈現(xiàn)3種菌落形態(tài)：強致病力菌株的菌落表面濕潤、流動性強、中間為粉紅色、白邊較寬（圖1-A）；無致病力菌株的菌落表面干燥、無流動性、中間為暗紅色，白邊窄（圖1-B）；過度型菌株菌落表面濕潤、中間為暗紅色，白邊比較窄（圖1-C）。

圖1 青枯雷爾氏菌突變菌株在TTC平板上的菌落形態(tài)

供試的60株不同致病力青枯雷爾氏菌突變菌株的弱化指數(shù)測定結(jié)果如表1所示，AI介于0.49—0.89。番茄盆栽試驗表明，不同致病力青枯雷爾氏菌突變菌株接種15 d后，番茄植株發(fā)病率為0—100%，7株菌株在接種15 d后植株發(fā)病率達100%，20株菌株接種15 d后植株發(fā)病率為0，繼續(xù)觀察至60 d植株發(fā)病率仍然為0。根據(jù)AI值和番茄盆栽試驗鑒定為強致病力菌株共有33株，AI介于0.49—0.63，植株發(fā)病率為66.33%—100%；無致病力菌株共有20株，AI介于0.78—0.89，植株發(fā)病率為0；中間型菌株共有7株，AI介于0.68—0.73，植株發(fā)病率為24.17%—45.92%。

2.2 青枯雷爾氏菌無致病力突變菌株的防治效果測定

對20株經(jīng)鑒定為無致病力的菌株進行番茄青枯病的防治效果測定。不同無致病力突變菌株的防治效果差異明顯，介于16.68%—92.45%，菌株T831防治效果最好，達91.74%，其次是菌株T780，防治效果為87.51%，菌株T497防治效果最差，為16.68%（表2）。

表1 供試菌株致病力鑒定

2.3 青枯雷爾氏菌突變菌株的色譜行為分析

在色譜柱飽和吸附范圍內(nèi)，60株不同致病力突變菌株經(jīng)過高效離子交換色譜分離得到3種不同峰類型：單峰、雙峰和3個峰（表3、圖2）。33株強致病力菌株中單峰（只有P3）16株，占48.5%，CTI3為100%；雙峰（P1和P3）10株，占30.30%，CTI1介于0.6%—5.9%，CTI3介于94.1%—99.4%；3個峰（P1、P2和P3）7株，占21.2%，CTI1介于1.4%—6.3%，CTI2介于2.0%—15.6%，CTI3介于79.2%—95.9%。20株無致病力菌株中單峰（只有P1）6株，占30.0%，CTI1為100%；雙峰（P1和P2）7株，占35.0%，CTI1介于52.5%—97.7%，CTI2介于3.6%—47.5%；3個峰（P1、P2和P3）7株，占35.0%，CTI1介于46.4%—90.7%，CTI2介于4.0%—35.0%，CTI3介于3.7%—31.0%。中間型菌株中只有雙峰和3個峰類型，菌株T278有P1和P2兩個峰，CTI1和CTI2分別為39.7%和60.3%；菌株T322有P1和P3兩個峰，CTI1和CTI3分別為12.0%和88.0%；3個峰的菌株共有5株，CTI1值介于36.5%—52.6%，CTI2值介于22.6%—35.0%，CTI3值介于13.0%—28.5%。

表2 青枯雷爾氏菌無致病力突變菌株對番茄青枯病的防治效果

2.4 青枯雷爾氏菌色譜效價指數(shù)與其致病力和病害防治效果的相互關(guān)系

供試的強致病力菌株中CTI3為100%的菌株，致病力最強，誘導(dǎo)番茄植株發(fā)病率均達85%以上，CTI3＜100%的菌株，接種后番茄植株發(fā)病率介于66.33% —84.14%（表1、表3），分析青枯雷爾氏菌強致病力突變菌株色譜效價值CTI3與其致病力的相互關(guān)系，結(jié)果表明二者呈極顯著正相關(guān)（＜0.01），PCC為0.62（表4）。

表3 不同青枯雷爾氏菌突變菌株的色譜行為異質(zhì)性

圖2 青枯雷爾氏菌強致病力（A-C）、無致病力（D-H）和中間型突變菌株（G-I）色譜圖

青枯雷爾氏菌無致病力突變菌株色譜效價值CTI1達100%的菌株，其防治效果高，均＞80%，CTI1值＜90%的菌株，其防治效果低，介于16.68%—63.62%（表2、表3）。分析青枯雷爾氏菌無致病力突變菌株CTI1值與病害防治效果的相互關(guān)系，結(jié)果表明，二者呈極顯著正相關(guān)（＜0.01），相關(guān)系數(shù)為0.80（表5）。

表4 青枯雷爾氏菌強致病力突變菌株的色譜效價值與其致病力的皮爾遜相關(guān)系數(shù)

**＜0.01。表5同 The same as table 5

表5 青枯雷爾氏菌無致病力突變菌株的色譜效價值與其病害防治效果的皮爾遜相關(guān)系數(shù)

3 討論

對于青枯雷爾氏菌的致病力鑒定，Lemessa等[29-31]均采用鑒別寄主植物方法。劉波等[15]根據(jù)青枯雷爾氏菌在TTC平板上菌落紅斑直徑與菌落直徑的比值，提出了弱化指數(shù)（AI），為青枯菌的致病力鑒定提供了參考指標(biāo)，將青枯雷爾氏菌分為3種致病力類型：強致病力菌力（AI＜0.65）、無致病力菌株（AI＞0.75）、中間型菌株（AI介于0.65—0.75）。本研究結(jié)合AI和接種番茄寄主法，將供試的60株青枯雷爾氏菌突變菌株分為強致病力、無致病力和中間型。以AI為指標(biāo)對青枯雷爾氏菌的致病力劃分結(jié)果與其接種番茄盆栽苗的致病性測定結(jié)果相吻合，說明AI作為青枯雷爾氏菌致病力判別指標(biāo)是可行的。

在一定條件下，細菌是一個帶電的顆粒，細菌細胞表面覆蓋著糖類、脂類、蛋白質(zhì)、肽聚糖等物質(zhì)，在不同pH條件下，這些物質(zhì)的電離狀態(tài)不同，從而使細菌表面帶上不同的電荷[32]，因此，可通過高效離子交換色譜將帶不同電荷的細菌進行分離。Daniels[33]利用強陰離子交換樹脂，通過控制緩沖液pH和鹽濃度來選擇性地吸附或洗脫，實現(xiàn)了對6種不同細菌的分離；Marquis等[34]利用陽離子交換色譜柱成功地對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌混合菌進行了分離，且回收率分別為87%和97%；謝俊斌[35]首次使用高效離子交換色譜對活的細菌進行了分離，成功地將木糖氧化無色桿菌、普通大腸桿菌、短小芽孢桿菌等不同屬的細菌進行色譜分離；林娟等[19]應(yīng)用高效離子交換色譜將青枯雷爾氏菌純培養(yǎng)物分離出3個致病力不同的特征峰，不同致病力青枯雷爾氏菌的色譜行為不同。本研究利用高效離子交換色譜對3種不同致病力青枯雷爾氏菌突變菌株的色譜行為進行分析，強致病力菌株的主峰為P3峰，出峰時間為5.9或6.0 min；無致病力菌株的主峰為P1峰，出峰時間為0.6 min，本研究結(jié)果與林娟等[19]研究結(jié)果相吻合，進一步證實可以利用高效離子交換色譜區(qū)分不同致病力的青枯雷爾氏菌。

程本亮等[36]研究表明，Tn5轉(zhuǎn)座子插入青枯雷爾氏菌，影響菌株的致病性，形成了菌株改造后致病力的多樣性，插入位點在和區(qū)域內(nèi)，菌株致病力就會發(fā)生變化，在這兩個基因區(qū)域之外不發(fā)生致病力變化，致病力多樣性機理有待進一步研究。本研究選取Tn5轉(zhuǎn)座子插入的60株青枯雷爾氏菌，存在著致病力的分化，表現(xiàn)出不同的色譜行為，反映在致病力強弱上，形成了3種色譜峰型，即單峰、雙峰和3個色譜峰。單峰型菌株中，強致病力菌株只有P3峰，無致病力菌株只有P1峰。Tn5轉(zhuǎn)座子插入的大多數(shù)菌株（63.33%）表現(xiàn)出雙峰或3個色譜峰。筆者根據(jù)菌株色譜分離的3個特征峰面積S1（指示無致病力菌株的P1峰面積）、S2（P1峰面積）和S3（指示強致病力菌株P(guān)3峰面積），建立色譜效價指數(shù)（CTIi），CTIi=Si/（S1+S2+S3）×100%， CTI1為100%的無致病力菌株，其對番茄青枯病的防治效果均＞80%，而CTI1值＜90%的菌株，其防治效果低，介于16.68%—63.62%；CTI3為100%的強致病力菌株，接種番茄青枯發(fā)病率均＞85%。分析無致病力菌株的CTI1與病害防治效果的相互關(guān)系，表明二者的PCC為0.80，呈極顯著正相關(guān)；分析強致病力菌株的CTI3與植株發(fā)病率的相互關(guān)系，表明二者的PCC為0.62，呈極顯著正相關(guān)。因此，CTI1可作為無致病力高效生防菌株篩選的關(guān)鍵指標(biāo)，CTI3可作為青枯雷爾氏菌致病力的參考指標(biāo)。

4 結(jié)論

基于弱化指數(shù)和生物測定將青枯雷爾氏菌Tn5轉(zhuǎn)座子突變菌株劃分為3種致病力類型：強致病力、無致病力和中間型。不同致病力突變菌株的色譜行為不同，存在3種色譜峰類型：單峰、雙峰和3個色譜峰。構(gòu)建了色譜效價指數(shù)CTIi，其中CTI1與無致病力突變菌株的防治效果呈極顯著正相關(guān)，可用于快速篩選出無致病力高效生防菌株；CTI3與突變菌株的致病力呈極顯著正相關(guān)，可作為青枯雷爾氏菌致病力的參考指標(biāo)。

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（責(zé)任編輯 岳梅）

heterogeneity Analysis ofmutantsby Tn5 transposon using high performance ion-exchangechromatography

ZHENG XueFang, LIU Bo, ZHU YuJing, CHEN DeJu, CHEN XiaoQiang

(Agricultural Bio-Resources Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350003)

【Objective】The objective of this study is to analyze the heterogeneity ofmutants by Tn5 transposon and screen out an avirulent mutant with high control efficiency. 【Method】The pathogenicity of sixtyTn5 transposon mutants was identified by using the attenuation index (AI, a quantitative index for calculating the pathogenicity of) and tomato plant inoculation bioassay. The chromatographic behavior heterogeneity of different pathogenic mutants ofwas analyzed by using high performance ion-exchange chromatography. A chromatography titer index (CTIi) was expressed as CTIi=Si/ (S1+S2+S3)×100% (i=1, 2 or 3; S1, S2and S3represent peak areas of P1, P2and P3, respectively), and the relationship of CTIiwith the pathogenicity and control efficiency of tested mutants was also analyzed based on Pearson correlation coefficient (PCC). 【Result】 Based on the value of AI and the results of bioassay, sixtymutants were divided into three pathogenic types: virulent, avirulent and interim. Thirty-three mutants belonged to virulent mutant with the value of AI ranged from 0.49 to 0.63 and disease incidence ranged from 66.33% to 100%(15 days after inoculation). Twenty mutants were avirulent with the value of AI ranged from 0.78 to 0.89 and the disease incidence was 0. There were only seven interim mutants with the value of AI ranged from 0.68 to 0.73 and disease incidence ranged from 24.17% to 45.92%. The control efficiency of twenty avirulent mutants against tomato bacterial wilt disease ranged from16.68% to 92.45%. The best control efficiency was obtained by T831 of 91.74%, followed by T780 (87.51%). The mutant of T497 had the worst control efficiency of 16.68%. Using high performance ion-exchange chromatography,mutants were successfully separated into three chromatographic peaks: P1(retention time of 0.6 min), P2(retention time of 4.4 or 4.5 min) and P3(retention time of 5.9 or 6.0 min). Both virulent and avirulent mutants had three different peaks: single peak, double and three peaks. However, the interim mutants only had double peaks and three peaks types. For virulent mutants, the intense peak is P3, while for avirulent mutants, P1is the majority. The virulent mutants with CTI3of 100% had high pathogenicity, which could induce tomato plant bacterial wilt with disease incidence up to 85%. The virulent mutants with CTI3less than 100% had the disease incidence ranged from 66.33% to 84.14%. The avirulent mutants with CTI1of 100% had high control efficiency which reached up to 80%, and the avirulent mutants with CTI1less than 90% had low control efficiency which ranged from 16.68% to 63.62%. The correlations of CTI3and the pathogenicity of virulent mutants were significantly positive (＜0.01), with PCC of 0.62. The relationships between CTI1and control efficiency against bacterial wilt disease of the avirulent mutants were also significantly positive (＜0.01), with PCC of 0.80.【Conclusion】mutants by Tn5 transposon have three pathogenic types, which resulted in different chromatographic behaviors. CTI1constructed in this study can be used for rapidly selecting an avirulent mutant with high control efficiency and CTI3can be used for calculating the pathogenicity of.

high performance ion-exchange chromatography;; bacterial wilt disease; Tn5 transposon; mutant strain

2017-07-03；

2017-08-18

國家重點研發(fā)計劃（2017YFD0201100）、國家自然科學(xué)基金（31701835）、福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年英才基金（YC2016-15）、福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新團隊（STIT2017-1-11）

鄭雪芳，e-mail：zhengxuefangfz@163.com。

劉波，e-mail：fzliubo@163.com