長期施肥和灌溉對土壤細(xì)菌數(shù)量、多樣性和群落結(jié)構(gòu)的影響

楊亞東，王志敏，曾昭海

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長期施肥和灌溉對土壤細(xì)菌數(shù)量、多樣性和群落結(jié)構(gòu)的影響

楊亞東，王志敏，曾昭海

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 北京 100193）

【目的】通過對華北地區(qū)一年兩熟種植模式下冬小麥生長季不同施肥和灌溉處理下土壤細(xì)菌群落的研究，揭示長期不同施肥和灌溉制度下土壤細(xì)菌數(shù)量、多樣性和群落結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律。為科學(xué)施肥和灌溉，提高農(nóng)田地力和維持土壤微生物多樣性等提供依據(jù)。【方法】依托中國農(nóng)業(yè)大學(xué)吳橋?qū)嶒炚?，選取長期施肥和灌溉定位試驗的6個處理冬小麥?zhǔn)斋@后耕層土壤為研究對象，分別為化肥+不灌溉（CI0）、化肥+拔節(jié)期灌溉（CI1）、化肥+拔節(jié)期灌溉+灌漿期灌溉（CI2）、有機肥+不灌溉（MI0）、有機肥+拔節(jié)期灌溉（MI1）和有機肥+拔節(jié)期灌溉+灌漿期灌溉（MI2）。借助熒光定量PCR技術(shù)和Illumina Miseq高通量測序平臺，以16S rRNA基因為標(biāo)靶，研究長期不同施肥和灌溉制度對土壤細(xì)菌數(shù)量、多樣性和群落結(jié)構(gòu)的影響，并分析細(xì)菌數(shù)量、多樣性和群落結(jié)構(gòu)變化與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性?！窘Y(jié)果】灌溉顯著提高了土壤含水量和土壤pH，施有機肥比施化肥顯著提高了土壤有機碳含量。不同處理細(xì)菌16S rRNA基因拷貝數(shù)為每克干土4.34×109—1.39×1010。灌溉顯著提高了細(xì)菌數(shù)量，化肥和有機肥處理分別提高了1.17—1.60和0.76—1.93倍。多樣性指數(shù)結(jié)果表明灌溉顯著影響細(xì)菌群落多樣性指數(shù)，施肥對細(xì)菌群落多樣性指數(shù)的影響均不顯著。門水平上，18個樣品共獲得39個類群，其中變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、酸桿菌門（Acidobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）為優(yōu)勢類群，相對豐度共占77.22%—86.28%。不同處理間放線菌門（11.09%—27.01%）、擬桿菌門（5.45%—12.13%）和Saccharibacteria（2.41%—3.77%）的相對豐度差異顯著。灌溉顯著降低了放線菌門和Saccharibacteria的相對豐度，化肥和有機肥處理分別降低了36.48%—48.03%、22.17%—33.67%和15.21%—45.54%、13.40%—23.97%。層次聚類和主成分分析結(jié)果顯示施肥和灌溉對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)都產(chǎn)生影響，相同灌溉次數(shù)處理的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似，而相同施肥處理間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異較大，表明灌溉對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響強于施肥。此外，土壤含水量、土壤pH、全氮含量和有機碳含量與細(xì)菌數(shù)量、多樣性指數(shù)和群落結(jié)構(gòu)存在一定的顯著相關(guān)關(guān)系。【結(jié)論】灌溉顯著改變了細(xì)菌數(shù)量、多樣性和群落結(jié)構(gòu)，施肥對細(xì)菌數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)的影響較小。土壤含水量和土壤pH是造成土壤細(xì)菌數(shù)量、多樣性和群落結(jié)構(gòu)差異的主要原因。

有機肥；灌溉；細(xì)菌群落多樣性；高通量測序；華北地區(qū)

0 引言

【研究意義】土壤微生物是土壤肥力的重要組成部分，在維持土壤生態(tài)功能中扮演著重要角色[1]，同時也是評價土壤質(zhì)量和生產(chǎn)力的重要指標(biāo)[2]。施肥和灌溉是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中最主要的農(nóng)業(yè)管理措施，具有促進作物生長和提高產(chǎn)量的作用，同時也對土壤微生物產(chǎn)生影響。土壤微生物數(shù)量、群落結(jié)構(gòu)和生物活性的變化直接或間接影響土壤肥力和可持續(xù)生產(chǎn)力[3]。華北地區(qū)是中國重要的糧食生產(chǎn)基地，以冬小麥-夏玉米種植模式為主。冬小麥生長季需要大量施肥和抽取地下水灌溉，導(dǎo)致地下水污染和地下水水位持續(xù)下降[4]，使該地區(qū)面臨嚴(yán)峻的水資源危機。研究不同施肥和灌溉處理土壤細(xì)菌數(shù)量、多樣性和群落結(jié)構(gòu)的變化，揭示土壤微生物對施肥和灌溉的響應(yīng)機制，為改進施肥和灌溉制度，提高土壤肥力和生產(chǎn)力，緩解地下水資源危機提供依據(jù)。因此，開展施肥結(jié)合灌溉對土壤細(xì)菌數(shù)量、多樣性和群落結(jié)構(gòu)影響的研究具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】施肥改變了土壤微生物的數(shù)量、群落結(jié)構(gòu)和活性，引起土壤生物肥力差異，進而影響土壤結(jié)構(gòu)、肥力和可持續(xù)生產(chǎn)力[5]。長期施用化肥顯著提高了水稻土壤中細(xì)菌數(shù)量[6]，并改變了細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性[6-7]。施用有機肥能顯著改變微生物的群落結(jié)構(gòu)及多樣性[8-9]，提高微生物的生物量和代謝活性[10]。此外，土壤水分管理也對土壤微生物的數(shù)量、群落結(jié)構(gòu)和活性產(chǎn)生影響[11]。土壤含水量通過影響土壤營養(yǎng)物質(zhì)運輸、底物可用性和土壤其他特性，改變土壤微生物的群落組成和活性[12-13]。近年來，隨著測序技術(shù)的快速發(fā)展，新一代測序技術(shù)被廣泛應(yīng)用到環(huán)境微生物群落的研究中。高通量測序技術(shù)具有測序深度深和獲得數(shù)據(jù)量大等優(yōu)點，能更真實地揭示微生物群落的復(fù)雜性和多樣性，加快了環(huán)境中不可培養(yǎng)和痕量微生物的研究[14]。前人利用Roche 454和Illumina Miseq測序平臺探討了施肥和灌溉等農(nóng)業(yè)管理措施對不同類型土壤中微生物群落多樣性和結(jié)構(gòu)組成的影響[8, 15-17]，并取得了一定進展?！颈狙芯壳腥朦c】由于冬小麥生長季長期施用化肥和抽取地下水灌溉，造成了華北地區(qū)土壤氮素淋溶、生產(chǎn)力降低和嚴(yán)峻的地下水資源危機[4,18]。施用有機肥能改善土壤質(zhì)量、改變土壤微生物組成，提高土壤生產(chǎn)力[19]。同時，減少冬小麥生長季灌溉用水是緩解華北地區(qū)地下水超采壓力的重要措施。先前的研究多集中在施肥或灌溉等單一措施對土壤細(xì)菌群落的研究，缺乏施肥與灌溉結(jié)合管理對土壤細(xì)菌群落影響的系統(tǒng)研究。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究以中國農(nóng)業(yè)大學(xué)吳橋?qū)嶒炚鹃L達(dá)11年的冬小麥-夏玉米種植模式定位試驗為平臺，以冬小麥?zhǔn)斋@后耕層土壤為研究對象，以16S rRNA基因為標(biāo)靶，借助熒光定量PCR技術(shù)和Illumina MiSeq高通量測序平臺，探討不同肥料類型和灌溉次數(shù)處理土壤細(xì)菌數(shù)量、多樣性和群落組成的變化及其與土壤理化性質(zhì)的關(guān)系，為優(yōu)化該地區(qū)農(nóng)田施肥和灌溉制度，提高土壤肥力，維護土壤微生物生態(tài)系統(tǒng)和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展等方面提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

試驗在中國農(nóng)業(yè)大學(xué)吳橋?qū)嶒炚痉锻袜l(xiāng)姚莊村（北緯37°41'，東經(jīng)106°37'）進行。試驗區(qū)位于滄州地區(qū)最南端，海河平原黑龍港流域中部，屬暖溫帶半濕潤大陸性季風(fēng)氣候，全年光照2 724.8 h，年平均氣溫12.9 ℃，無霜期201 d，歷年平均年降水量562 mm，小麥季平均降雨量127.3 mm。土壤為沖積型鹽化潮土，壤質(zhì)底黏。

施肥和灌溉長期定位試驗起始于2005年，設(shè)2種肥料類型和3個灌溉梯度，共6個處理。分別為：化肥+不灌溉（CI0）、化肥+拔節(jié)期灌溉（CI1）、化肥+拔節(jié)期灌溉+灌漿期灌溉（CI2）、有機肥+不灌溉（MI0）、有機肥+拔節(jié)期灌溉（MI1）和有機肥+拔節(jié)期灌溉+灌漿期灌溉（MI2）。小區(qū)面積為66.7 m2，3次重復(fù)。冬小麥播種前澆足底墑水，灌溉量為750 m3·hm-2，之后每次灌溉量均為750 m3·hm-2。冬小麥生長季氮、磷、鉀肥施用量分別為尿素150 kg·hm-2、磷酸二銨300 kg·hm-2和硫酸鉀225 kg·hm-2；有機肥為雞糞，施用量為22.5 m3·hm-2。所有肥料均作為基肥一次性施入。田間管理同常規(guī)大田生產(chǎn)。試驗開始前耕層（0—20 cm）土壤的基本理化性質(zhì)：pH 7.43，有機碳11.10 g·kg-1，全氮1.05 g·kg-1，有效磷49.10 mg·kg-1，速效鉀123.75 mg·kg-1。

1.2 土壤樣品采集

于2016年6月，取冬小麥?zhǔn)斋@后耕層（0—20 cm）土壤。每個小區(qū)隨機取5個樣點混合成1個樣品，用冰盒保存土樣，運輸至實驗室。將土壤樣品過2 mm篩，去除小麥根系殘體和雜物后分為兩部分。一部分凍存于-80℃冰箱中，用于土壤微生物分析。另一部分鮮土樣用于測定土壤銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和含水量，余下部分自然風(fēng)干后測定土壤pH、全氮和有機碳。

1.3 試驗方法

1.3.1 土壤理化性質(zhì)測定 土壤含水量采用烘干法測定，土壤pH采用電位法測定（水土比=2.5﹕1），土壤全氮含量采用半微量凱氏定氮法測定，土壤總有機碳測定采用濃硫酸-重鉻酸鉀消煮-硫酸亞鐵滴定法[20]。土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮用2 mol·L-1KCl溶液浸提鮮土樣后，采用流動分析儀測定（SAN++，Skalar，Holland）。

1.3.2 土壤微生物總DNA提取和PCR擴增 土壤總DNA使用美國OMEGA公司的E.Z.N.A.?Soil DNA Kit（Omega, GA, USA）試劑盒，每個樣品稱取約0.5 g新鮮土壤，按照試劑盒提取步驟進行。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取DNA的純度和完整性，用核酸定量儀（NanoDrop ND-1000）檢測提取DNA的濃度和純度。

用引物BACT1369F（5′-CGG TGA ATA CGT TCY CGG-3′）和PROK1541R（5′-AAG GAG GTG ATC CRG CCG CA-3′）[21]擴增細(xì)菌16S rRNA基因。PCR體系為：10×緩沖液 5.0 μL，dNPT（2.5 μmol·L-1）4.0 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各1.0 μL，DNA模板2.0 μL（1-10 ng），（5 U·μL-1）1.0 μL（TaKaRa，大連，中國），最后用超純水（ddH2O）補至50.0 μL。PCR擴增條件為：95℃ 3 min；94℃ 45 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s，30個循環(huán)；72℃ 5 min。將PCR產(chǎn)物回收，連接至pMD18-T載體（TaKaRa，大連，中國），轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)中，篩選陽性克隆測序，并提取含16S rRNA基因的質(zhì)粒，用核酸定量儀（NanoDrop ND-1000）測定質(zhì)粒濃度，計算16S rRNA基因拷貝數(shù)，按10倍梯度稀釋至每微升8.75×108—8.75×103拷貝數(shù)，共6個梯度，用于制備16S rRNA基因標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 熒光定量PCR 采用SYBR Green定量PCR法測定細(xì)菌16S rRNA基因豐度，反應(yīng)在ABI 7500熒光定量PCR儀（ABI，CA，USA）上進行。反應(yīng)體系為：SYBR?Premix Ex Taq Ⅱ（Thi RNaseH Plus）12.5 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各0.25 μL，ROX Reference Dye（50×）0.5 μL，DNA模板1.0 μL（1—10 ng），最后用超純水（ddH2O）補至25.0 μL。熒光定量PCR采用兩步法進行，條件為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s；60 ℃ 1 min，40個循環(huán)。熒光定量PCR擴增效率為94.4%，2為0.999。

1.3.4 高通量測序分析 用引物338F（5′-ACT CCT ACG GGA GGC AGC A-3′）[22]和806R（5′-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3′）[23]擴增細(xì)菌16S rRNA基因V3-V4區(qū)，擴增體系和程序同1.3.2所示。每個樣品的上游引物5′端添加一段長度為8 bp的特異性多肽（barcode），用于區(qū)分樣品?；厥誔CR產(chǎn)物并測定濃度，將同一處理的多個樣品混勻，使各處理用于測序的樣品DNA濃度一致，采用Illumina MiSeq測序平臺進行雙末端（Paired-end）測序。測序服務(wù)委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.4 測序數(shù)據(jù)處理

對下機原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制，用軟件QIIME 1.8.0對原始序列進行過濾、拼接、去除嵌合體[24]，并對序列長度進行篩選。根據(jù)特異性多肽將序列確定為最終的樣品序列。按照以下要求進行。（1）過濾read尾部質(zhì)量值20以下的堿基，設(shè)置50 bp的窗口，如果窗口內(nèi)的平均質(zhì)量值低于20，從窗口開始截去后端堿基，過濾質(zhì)控后50 bp以下的read；（2）根據(jù)PE reads之間的重疊（overlap）關(guān)系，將成對reads拼接（merge）成一條序列，最小重疊長度為10 bp；（3）拼接序列的重疊區(qū)允許的最大錯配比率為0.2，篩選不符合序列；（4）根據(jù)序列首尾兩端的特異性多肽和引物區(qū)分樣品，并調(diào)整序列方向，特異性多肽允許的錯配數(shù)為0，最大引物錯配數(shù)為2，最后獲得用于后續(xù)分析的高質(zhì)量序列。

采用UPARSE 7.1軟件將優(yōu)質(zhì)序列聚類成操作分類單元（Operational Taxonomic Unit，OTU），閾值設(shè)置為97%[25]。采用RDP-classifier貝葉斯算法[26]對97%相似水平的OTU代表序列進行注釋，得到每個OTU的分類學(xué)信息。將不能聚類在任何分類水平已知類群的序列定義為未分類。利用Mothur 1.30.1軟件在97% 相似水平上進行α多樣性指數(shù)分析[27]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

細(xì)菌16S rRNA基因拷貝數(shù)取對數(shù)后，用Sigma Plot 12.5軟件制圖。土壤理化性質(zhì)、細(xì)菌16S rRNA基因拷貝數(shù)和α多樣性指數(shù)等數(shù)據(jù)的多重比較、方差分析和相關(guān)性分析用SPSS 20.0軟件完成。細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主成分分析和冗余分析用R 3.3.2軟件完成。

2 結(jié)果

2.1 不同處理土壤理化性質(zhì)

長期不同施肥和灌溉處理顯著影響土壤理化性質(zhì)（表1）。方差分析結(jié)果表明，施肥顯著改變了不同處理間土壤所有理化性質(zhì)，灌溉顯著改變了不同處理間除C/N比（=1.06，0.377）外的其他理化性質(zhì)，施肥和灌溉的交互作用顯著改變了不同處理間除有機碳（=0.467，0.638）外的其他理化性質(zhì)（表1）。有機肥處理中，灌溉顯著提高了土壤含水量（＜0.001）和全氮含量（＜0.01），分別提高了2.2—6.6個百分點和6.0%—11.0%；化肥處理中，灌溉顯著提高了土壤含水量（＜0.001）、土壤pH（＜0.001）和銨態(tài)氮含量（＜0.001），分別提高了1.1—4.2個百分點、0.37—0.41個單位和2.7—5.1倍。灌溉次數(shù)相同時，施有機肥顯著提高了土壤全氮（＜0.001）和有機碳含量（＜0.001），分別提高了17.8%—27.8%和7.8%—11.7%。

表1 不同施肥和灌溉處理土壤理化性質(zhì)

數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（=3）；同列數(shù)值后不同小寫字母表示差異顯著（＜0.05）。CI0，化肥+不灌溉；CI1，化肥+拔節(jié)期灌溉；CI2，化肥+拔節(jié)期灌溉+灌漿期灌溉；MI0，有機肥+不灌溉；MI1，有機肥+拔節(jié)期灌溉；MI2，有機肥+拔節(jié)期灌溉+灌漿期灌溉。*表示＜0.05，**表示＜0.01，***表示＜0.001，ns表示差異不顯著。下同

Data are means±standard deviation (n=3); Different small letters mean significant differences (＜0.05). CI0, chemical fertilizer + no irrigation; CI1, chemical fertilizer + irrigated at the jointing stage; CI2, chemical fertilizer + irrigated at the jointing and filling stages; MI0, manure fertilizer + no irrigation; MI1, manure fertilizer + irrigated at the jointing stage; MI2, manure fertilizer + irrigated at the jointing and filling stages. *＜0.05, **＜0.01, ***＜0.001, ns: not significant difference. The same as below

2.2 不同處理細(xì)菌16S rRNA基因豐度

不同施肥和灌溉處理中土壤細(xì)菌16S rRNA基因拷貝數(shù)為每克干土4.34×109—1.39×1010（圖1）。方差分析結(jié)果表明，灌溉（=137.74，＜0.01）及施肥與灌溉的交互作用（=8.92，＜0.05）顯著影響細(xì)菌16S rRNA基因拷貝數(shù)（表2）。灌溉顯著增加了細(xì)菌16S rRNA基因拷貝數(shù)（＜0.05），其中處理MI2和MI1比MI0分別提高了192.6%和75.9%，處理CI2和CI1比CI0分別提高了160.0%和126.8%。灌溉相同時，處理MI2中細(xì)菌16S rRNA基因拷貝數(shù)顯著高于CI2（＜0.05），處理MI1和CI1、MI0和CI0間差異則不顯著（＞0.05）。

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，細(xì)菌16S rRNA基因拷貝數(shù)與土壤含水量（=0.856，＜0.001）、土壤pH（=0.675，＜0.01）和全氮含量（=0.723，＜0.01）均呈顯著正相關(guān)關(guān)系（表3）。

數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n=3）；不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）

表2 施肥、灌溉及施肥與灌溉的交互作用對細(xì)菌16S rRNA基因拷貝數(shù)和群落α多樣性指數(shù)的影響

表3 細(xì)菌16S rRNA基因豐度、群落α多樣性指數(shù)與土壤理化性質(zhì)的Pearson相關(guān)性分析

2.3 測序結(jié)果和多樣性指數(shù)

利用Illumina MiSeq平臺對細(xì)菌16S rRNA基因V3-V4區(qū)測序，共得到有效序列707 759條，平均長度為438.16 bp。經(jīng)抽平篩選后，每個樣品得到21 230條高質(zhì)量序列，包含2 336—2 671個操作分類單元（OTU），各樣品的測序覆蓋度為0.9657—0.9698（表4）。樣品OTU稀釋性曲線均趨于平坦，表明測序深度包括了樣品中的絕大多數(shù)細(xì)菌類型，測序數(shù)據(jù)量合理。

不同處理的ACE指數(shù)為2 999—3 178，Chao1指數(shù)為3 016—3 168，香濃指數(shù)為6.84—6.98，辛普森指數(shù)為0.0019—0.0025（表4）。方差分析結(jié)果表明，灌溉顯著影響ACE指數(shù)（=10.484，＜0.05）、Chao1指數(shù)（=4.216，＜0.05）、香濃指數(shù)（=14.298，＜0.01）和辛普森指數(shù)（=5.137，＜0.05）（表2）。與不灌溉相比，灌溉處理中ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)和香濃指數(shù)分別提高了3.0%—5.9%、2.3%—5.1%和1.2%—2.0%，辛普森指數(shù)降低了7.1%—22.7%（表4）。

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，ACE指數(shù)與土壤含水量（=0.732，＜0.01）、土壤pH（=0.664，＜0.01）、銨態(tài)氮含量（=0.497，＜0.05）和有機碳含量（=0.529，＜0.05）均呈顯著正相關(guān)關(guān)系。Chao1指數(shù)與土壤含水量（=0.569，＜0.05）、土壤pH（=0.605，＜0.01）、銨態(tài)氮含量（=0.525，＜0.05）和有機碳含量（=0.550，＜0.05）均呈顯著正相關(guān)關(guān)系。香濃指數(shù)與土壤pH（=0.629，＜0.01）和有機碳含量（=0.471，＜0.05）均呈顯著正相關(guān)關(guān)系（表3）。

表4 不同施肥和灌溉處理細(xì)菌高通量測序結(jié)果統(tǒng)計

2.4 不同處理細(xì)菌的群落組成

在門水平上，共獲得39個類群。將平均相對豐度＜1%類群歸類為其他，得到17個類群（圖2-a）。其中，變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、酸桿菌門（Acidobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）為主要優(yōu)勢類群，相對豐度分別為22.82%—39.94%、11.09%—27.01%、8.93%—19.86%、5.01%—17.81%和5.45%—12.13%，合計為77.22%—86.28%。不同處理間放線菌門（＜0.001）、擬桿菌門（＜0.01）和Saccharibacteria（＜0.05）的相對豐度差異顯著。施肥顯著改變了放線菌門（=6.617，＜0.05）的相對豐度，灌溉顯著改變了放線菌門（=40.946，＜0.001）、擬桿菌門（=15.649，＜0.001）和Saccharibacteria（=9.772，＜0.01）的相對豐度。

在綱水平上，共獲得97個類群。將平均相對豐度＜1%類群歸類為其他，得到17個類群（圖2-b）。其中，放線菌綱（Actinobacteria）、-變形菌綱（Alphaproteobacteria）、酸桿菌綱（Acidobacteria）、-變形菌綱（Gammaproteobacteria）和厭氧繩菌綱（Anaerolineae）為主要優(yōu)勢類群，相對豐度分別為11.09%—27.01%、8.83%—17.42%、5.01%—17.81%、6.02%—11.92%和3.24%—9.20%，合計為48.04%—61.65%。不同處理間放線菌綱（＜0.001）、-變形菌綱（＜0.01）、-變形菌綱（Deltaproteobacteria）（＜0.01）、-變形菌綱（Betaproteobacteria）（＜0.01）、纖維菌綱（Cytophagia）（＜0.05）、Saccharibacteria_norank（＜0.05）、KD4-96（＜0.05）、黃桿菌綱（Flavobacteriia）（＜0.001）、熱微菌綱（Thermomicrobia）（＜0.001）和Phycisphaerae（＜0.001）的相對豐度差異顯著。施肥顯著改變了放線菌綱（=6.617，＜0.05）和黃桿菌綱（F=6.166，＜0.05）的相對豐度，灌溉顯著改變了放線菌綱（=40.946，＜0.001）、-變形菌綱（=15.465，＜0.001）、-變形菌綱（=14.427，＜0.01）、-變形菌綱（=21.22，＜0.001）、纖維菌綱（=10.287，＜0.01）、Saccharibacteria_norank（=9.772，＜0.01）、KD4-96（=8.36，＜0.01）、黃桿菌綱（=88.045，＜0.001）、熱微菌綱（=30.1，＜0.001）和Phycisphaerae（=10.213，＜0.01）的相對豐度，施肥與灌溉的交互作用顯著改變了可熱微菌綱（=7.172，＜0.01）的相對豐度。

2.5 不同處理細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)及其與環(huán)境因子的關(guān)系

基于OTU的層次聚類分析結(jié)果顯示，不同施肥和灌溉處理細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異明顯，除MI2_2外，其他處理的3個重復(fù)都聚類在一起。其中，不灌溉處理（CI0和MI0）、灌溉一次處理（CI1和MI1）和灌溉兩次處理（CI2和MI2）距離較近（圖3-a）。主成分分析進一步證實了不同處理細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異明顯，第一、二主成分軸對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變異的解釋量分別為35.44%和15.33%。其中，灌溉條件相同處理（CI0和MI0，CI1和MI1，CI2和MI2）聚集在一起，而肥料類型相同處理（CI0、CI1和CI2，MI0、MI1和MI2）相距較遠(yuǎn)（圖3-b）。這些結(jié)果表明灌溉次數(shù)對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響強于肥料類型。

標(biāo)星號表示不同處理中的相對豐度差異顯著。*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001

圖3 不同施肥和灌溉處理細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的層次聚類樹（a）和主成分分析（b）

為進一步分析不同土壤理化性質(zhì)對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)進行冗余分析（圖4）。結(jié)果顯示，土壤含水量（＜0.001）、土壤pH（＜0.001）、全氮含量（＜0.01）、銨態(tài)氮含量（＜0.001）和有機碳含量（＜0.01）均顯著影響了細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)。

3 討論

3.1 不同施肥和灌溉處理對細(xì)菌數(shù)量的影響

本研究利用熒光定量PCR分析了不同施肥和灌溉處理土壤細(xì)菌數(shù)量，不同處理中細(xì)菌16S rRNA基因豐度在109—1010個拷貝數(shù)，低于長期施肥水稻土中的細(xì)菌數(shù)量[6]，與長期種植小麥的相似類型旱地土壤中細(xì)菌數(shù)量級一致[28]。袁紅朝等[6]研究表明水稻土有機碳含量高（19.56—22.65 g·kg-1），可為微生物提供充足的碳源，具有較高的微生物數(shù)量。本研究中與施化肥相比，施有機肥顯著提高了土壤有機碳含量，但細(xì)菌數(shù)量和有機碳含量卻無顯著相關(guān)關(guān)系（=0.41，=0.091）。CHEN等[29]研究表明土壤類型顯著影響了水稻土氨氧化微生物的數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)，因此，土壤類型可能是引起細(xì)菌在旱地土壤和水稻土中數(shù)量差異的原因。灌溉顯著增加了細(xì)菌數(shù)量（＜0.001），與劉方春等[30]對不同干旱處理的研究結(jié)果相似。原因可能是灌溉提高了土壤含水量和土壤pH，增加了氮元素的可利用性，為細(xì)菌生長提供了充足的氮源，促進了細(xì)菌繁殖。細(xì)菌數(shù)量與土壤含水量（=0.856，＜0.001）、土壤pH（=0.675，＜0.01）和全氮含量（=0.723，＜0.01）均呈顯著正相關(guān)關(guān)系，進一步證實這些土壤理化性質(zhì)顯著影響了細(xì)菌的數(shù)量。此外，施肥（=1.657，=0.22）對細(xì)菌數(shù)量的影響不顯著，而灌溉（=137.74，＜0.01）顯著改變了細(xì)菌數(shù)量，表明灌溉對細(xì)菌數(shù)量的影響強于施肥。

圖4 環(huán)境因子對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響的冗余分析

3.2 不同施肥和灌溉處理對細(xì)菌多樣性的影響

多樣性指數(shù)是評價細(xì)菌群落多樣性的重要指標(biāo)，多樣性指數(shù)越高表明細(xì)菌群落的豐富度和多樣性越高。袁紅朝等[6]對不同施肥水稻土壤的研究表明施肥和秸稈還田均顯著增加細(xì)菌多樣性，徐永剛等[31]研究表明施有機肥玉米土壤細(xì)菌多樣性高于施化肥，而本研究中施有機肥和化肥處理細(xì)菌群落的ACE、Chao1和香濃指數(shù)均差異不顯著，可能是由于不同地區(qū)土壤性質(zhì)和作物品種差異造成。劉方春等[30]研究表明適當(dāng)?shù)母珊悼商岣邫烟覍嵣绺H土壤的細(xì)菌群落多樣性，但過高干旱持續(xù)時間過長或者土壤含水量導(dǎo)致細(xì)菌群落多樣性指數(shù)降低，本研究顯示灌溉顯著增加了細(xì)菌群落的ACE、Chao1和香濃指數(shù)，表明灌溉增加了細(xì)菌的豐富度和多樣性，可能是由于灌溉后，土壤含水量增加，在一定的范圍內(nèi)，土壤含氧量合適，氮、磷、鉀等無機元素和有機質(zhì)等可利用性增加，為更多的微生物提供了生長和繁殖的條件。此外，土壤pH是土壤微生物生物量和細(xì)菌群落多樣性的限制因素[32-33]，土壤養(yǎng)分和有機碳含量也是影響細(xì)菌多樣性的重要因素[33]。本研究中，細(xì)菌群落的ACE、Chao1和香濃指數(shù)與土壤含水量、pH和有機碳含量存在一定的顯著相關(guān)關(guān)系，表明了土壤含水量、pH和有機碳是影響細(xì)菌群落多樣性的重要因素。

3.3 不同施肥和灌溉處理對群落組成和結(jié)構(gòu)的影響

細(xì)菌是土壤微生物的重要組成，參與了土壤養(yǎng)分循環(huán)，而且對維持整個土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性起著重要的作用[34]。本研究利用Illumina Miseq測序平臺對6個不同施肥和灌溉處理土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進行研究，得到39個門水平、97個綱水平和超過600個屬水平上的類群。結(jié)果表明，不同處理中優(yōu)勢的門和綱類群相似，但不同處理門和綱水平上的優(yōu)勢類群的相對豐度差異顯著（圖2-a，2-b）。各處理優(yōu)勢門類群（平均相對豐度＞5%）為變形菌門、放線菌門、綠彎菌門和酸桿菌門，與孫瑞波等[15]和LIU等[33]在不同類型農(nóng)田土壤中得到了細(xì)菌優(yōu)勢類群相似，但不同研究中各優(yōu)勢類群的相對豐度差異很大，這些結(jié)果表明農(nóng)田土壤中細(xì)菌的優(yōu)勢類群相似，但優(yōu)勢類群的相對豐度受土壤類型或質(zhì)地和種植作物品種的影響[8, 29, 35-36]。施肥和灌溉改變了土壤理化性質(zhì)，因此對土壤中細(xì)菌優(yōu)勢類群相對豐度也產(chǎn)生了一定的影響。灌溉顯著改變了放線菌門（＜0.001）、擬桿菌門（＜0.01）和Saccharibacteria（＜0.05）的相對豐度，但施肥沒有顯著改變各優(yōu)勢類群的相對豐度，這些結(jié)果表明本研究中灌溉對土壤細(xì)菌群落組成的影響強于肥料類型。放線菌門能夠促進土壤中動植物殘體的腐爛，同時在土壤氮素循環(huán)中也具有一定的作用[36]。王伏偉等[32]研究發(fā)現(xiàn)施肥和秸稈還田顯著提高了放線菌門的相對豐度，并且土壤全氮含量是提高其相對豐度的重要原因。本研究中，有機肥和化肥處理間放線菌門相對豐度差異不顯著，有機肥處理中，灌溉增加了土壤全氮含量卻降低了放線菌門的相對豐度。放線菌門相對豐度與全氮含量（=0.047，0.853）無顯著相關(guān)關(guān)系，而與土壤含水量（=-0.799，＜0.001）和土壤pH（=-0.570，＜0.05）顯著相關(guān)，表明放線菌門的相對豐度不僅受土壤全氮含量影響，還受到土壤含水量和土壤pH的影響。

前人研究表明施肥[15,28,32]和灌溉[37]等農(nóng)業(yè)管理措施對土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有一定影響。本研究發(fā)現(xiàn)施肥和灌溉均改變了細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)，但不同肥料類型和灌溉次數(shù)對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響存在差異（圖3-a，3-b）。灌溉條件相同的處理具有相似的群落結(jié)構(gòu)，表明灌溉對土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響強于肥料類型。大量研究也都證實土壤pH、全氮含量和有機碳含量顯著影響細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)[19,33,38]。本研究中，土壤含水量（＜0.001）、土壤pH（＜0.001）、全氮含量（＜0.01）和有機碳含量（＜0.01）與細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)顯著相關(guān)，并且土壤含水量與5個主要門類群（變形菌門、放線菌門、擬桿菌門、Saccharibacteria和浮霉菌門）的相對豐度存在顯著相關(guān)關(guān)系，表明土壤含水量是影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主要原因。此外，OTU水平上全氮含量與細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)顯著相關(guān)，但門水平上全氮含量與主要門類群相對豐度均無顯著相關(guān)關(guān)系，表明全氮含量對細(xì)菌不同分類學(xué)水平上的群落結(jié)構(gòu)影響存在差異。本研究中，灌溉對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響強于施肥，可能是由于灌溉提高了土壤含水量和土壤pH，這兩個因素都是影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的重要因素[6, 16, 38]。

不同施肥和灌溉制度對土壤細(xì)菌群落組成和結(jié)構(gòu)都有一定影響，本研究只分析了土壤細(xì)菌群落的整體變化，并未對特殊功能類群的微生物進行研究。由于這些特殊功能類群的微生物參與的土壤代謝途徑及功能的差異，不同施肥和灌溉制度引起的細(xì)菌數(shù)量、多樣性和群落結(jié)構(gòu)差異是否導(dǎo)致土壤肥力、健康狀況和生態(tài)系統(tǒng)功能變化有待于進一步研究。

4 結(jié)論

4.1 長期不同施肥和灌溉制度對土壤理化性質(zhì)產(chǎn)生了一定影響。在兩種施肥處理中，灌溉均顯著提高了土壤含水量和土壤pH，施有機肥比施化肥顯著提高了土壤有機碳含量。

4.2 灌溉次數(shù)增加顯著提高了土壤細(xì)菌數(shù)量，化肥和有機肥處理中分別提高了1.17—1.60和0.76—1.93倍；而除CI2和MI2外，不同施肥處理間細(xì)菌數(shù)量差異不顯著。灌溉顯著改變了細(xì)菌群落多樣性指數(shù)，而施肥對細(xì)菌群落多樣性指數(shù)影響均不顯著。

4.3 施肥和灌溉都改變了細(xì)菌群落組成和結(jié)構(gòu)，且灌溉的作用強于施肥。此外，土壤含水量和土壤pH與細(xì)菌數(shù)量、多樣性和群落結(jié)構(gòu)均存在顯著相關(guān)關(guān)系，是影響細(xì)菌群落變化的主要環(huán)境因子。

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（責(zé)任編輯 李云霞）

Effects of Long-term Different Fertilization and Irrigation Managementson Soil Bacterial Abundance, Diversity and Composition

YANG YaDong, WANG ZhiMin, ZENG ZhaoHai

(College of Agronomy and Biotechnology, China Agricultural University, Beijing 100193)

【Objective】This study was carried out to investigate the bacterial community in a wheat-maize rotation field during wheat growing season in northern China. The effects of long-term different fertilization and irrigation regimes on the abundance, diversity and composition of bacterial community were identified. It will provide evidences for further optimizing fertilization and irrigation managements, improving soil productivity, and maintaining soil microbial diversity.【Method】Based on a long-term fertilization and irrigation experiment carried out in Wuqiao Experimental Station of China Agricultural University, six different soil samples were collected after wheat was harvested, including chemical fertilization and no irrigation (CI0), chemical fertilization and irrigation at the jointing stage (CI1), chemical fertilization and irrigation at the jointing and filling stages (CI2), manure fertilization and no irrigation (MI0), manure fertilization and irrigation at the jointing stage (MI1), and manure fertilization and irrigation at the jointing and filling stages (MI2). The abundance, diversity and composition of the bacteria community in different soil samples were revealed by using real-time PCR and Illumina Miseq sequencing platform, targeting the 16S rRNA gene. Correlation analysis was carried out between soil properties and the bacteria community abundance, diversity and structure.【Result】Irrigation significantly increased soil moisture and soil pH, and manure fertilization significantly increased Total Organic Carbon (TOC) content compared with no irrigation and chemical fertilization treatments, respectively. The bacterial 16S rRNA gene copy numbers ranged from 4.34×109to 1.39×1010g-1in different treatments. Irrigation significantly increased the bacterial 16S rRNA gene copy number by 1.17-1.60 and 0.76-1.93 times in the chemical and manure fertilization treatments, respectively. The bacterial α diversity index results showed that irrigation but not fertilization significantly affected bacterial α diversity index. At the phylum level, thirty-nine phyla were obtained in all the treatments, among which Proteobacteria, Actinobacteria, Chloroflexi, Acidobacteria and Bacteroidetes were the predominant phyla, accounting for 77.22%-86.28% of the total reads. There were significant variations in relative abundance of Actinobacteria (11.09%-27.01%), Bacteroidetes (5.45%-12.13%) and Saccharibacteria (2.41%-3.77%) among different treatments. Irrigation significantly decreased the relative abundance of Actinobacteria and Saccharibacteria by 36.48%-48.03%, 22.17%-33.67% and 15.21%-45.54%, 13.40%-23.97% in the chemical and manure fertilization treatments, respectively. Hierarchical clustering and principal component analysis (PCA) results showed that both fertilization and irrigation managements affect the bacterial structure, and irrigation had a stronger effect than fertilization on the bacterial structure. In addition, there were significant correlations between soil moisture, soil pH, Total Nitrogen (TN) content, and TOC content and the abundance, α diversity index and structure of the bacterial community.【Conclusion】Irrigation greatly altered the abundance, diversity, and structure of the bacterial community, while fertilization had a minor effect on the abundance and structure of the bacterial community, and soil moisture and soil pH were the potential environmental factors associated with the bacterial community variations.

manure fertilizer; irrigation; bacterial community diversity; high-throughput sequencing; northern China

2017-06-21；

2017-08-25

國家重點研發(fā)計劃項目（2016YFD0300205-01）、國家自然基金（31671640）、國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201503121-11）

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