外泌體在中醫(yī)證候研究中的應(yīng)用※

焦海燕 嚴(yán)志祎 劉玥蕓 姜幼明

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京 100029）

中醫(yī)證候的研究一直是現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)，隨著證候研究與多學(xué)科的交叉，以及新的研究方法和理念的引入，證候研究水平不斷深化，研究層次也得到了拓寬。由于證候的復(fù)雜性、模糊性、動(dòng)態(tài)性等特點(diǎn)，證候理論的客觀化以及證候診斷標(biāo)準(zhǔn)與機(jī)制的研究仍是現(xiàn)階段中醫(yī)證候研究的重點(diǎn)內(nèi)容。近年來，細(xì)胞分泌的胞外小囊泡在生物體內(nèi)發(fā)揮的作用被逐步發(fā)掘，受到越來越多研究者們的關(guān)注。細(xì)胞外囊泡包括微泡 (microvesicle)、外泌體 (exosomes)、微球 (microparticle)以及凋亡小體 (apoptotic body)，這些成分各異的囊泡體均能介導(dǎo)細(xì)胞間的信息交換和物質(zhì)傳遞，而外泌體是其中功能較為突出的一類小囊泡[1]。外泌體作為胞外活性囊泡體，能夠參與細(xì)胞間的信號(hào)傳遞，其中所包含的大量活性物質(zhì)參與機(jī)體各項(xiàng)生理活動(dòng)，對(duì)相應(yīng)組織細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體進(jìn)行研究能夠從微環(huán)境的角度揭示細(xì)胞間通訊促進(jìn)某一疾病發(fā)生的機(jī)制與物質(zhì)基礎(chǔ)。此外，外泌體中也包含了疾病狀態(tài)下細(xì)胞的分子信息，因而含有豐富的生物標(biāo)志物分子源，可用于疾病的診斷。因此，將外泌體引入中醫(yī)證候的研究，能夠有效拓展證候研究的思路，促進(jìn)微觀辨證的發(fā)展，為中醫(yī)證候的客觀化提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 外泌體的生物學(xué)特征

外泌體于1987年首次發(fā)現(xiàn)于網(wǎng)織紅細(xì)胞的培養(yǎng)液中，在之后的研究中發(fā)現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、白細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、肥大細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等多種細(xì)胞均能分泌和釋放外泌體，使其廣泛存在于外周血、組織、細(xì)胞間隙以及各種體液中[2]。隨后，有研究發(fā)現(xiàn)B淋巴細(xì)胞釋放的外泌體能夠刺激T細(xì)胞活化、增殖，誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，改變細(xì)胞外微環(huán)境，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長，這使研究者們認(rèn)識(shí)到外泌體不僅是細(xì)胞的代謝產(chǎn)物，其在機(jī)體生命活動(dòng)中也發(fā)揮著重要的作用[3]。

在作用機(jī)制方面，外泌體與微泡并沒有太大的區(qū)分，它們均是為了細(xì)胞間的相互作用而被釋放到胞外，包含細(xì)胞釋放的核酸、蛋白、脂質(zhì)等分子，在與受體細(xì)胞結(jié)合后介導(dǎo)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，改變受體細(xì)胞的功能。外泌體與微泡的主要區(qū)別在于形成方式不同，外泌體是由胞內(nèi)內(nèi)溶酶體微粒 (endolysosomal vesicle)形成的多囊泡體 (multi-vesicular body)與細(xì)胞膜融合后向胞外分泌的小囊泡，其大小均一，直徑在40～150 nm，不同細(xì)胞釋放的外泌體表面均有相似的保守蛋白標(biāo)志物，如CD9、CD63、CD81、Alix等，與其來源細(xì)胞相關(guān)的特異性物質(zhì)包含在囊泡內(nèi)，使不同源的外泌體具有相應(yīng)的生物學(xué)功能[4]，另外大量研究表明，各類進(jìn)化保守蛋白對(duì)不同來源的外泌體的形成與釋放具有一定的作用，如微管蛋白和肌動(dòng)蛋白參與了外泌體的形成過程，磷脂酶D2影響外泌體的釋放，HSP70有助于外泌體適應(yīng)感染、缺氧、細(xì)胞因子刺激等不利的細(xì)胞外環(huán)境，同時(shí)也能使外泌體激活免疫系統(tǒng)消滅病變細(xì)胞，CD55與CD59則可以保護(hù)外泌體免受機(jī)體的免疫攻擊[5]；微泡則是由細(xì)胞出芽后，與細(xì)胞膜融合直接脫落而形成的囊泡，大小不一，直徑約在50 nm～1000 nm，目前研究尚未明確微泡是否具有表面標(biāo)志蛋白，其膜脂質(zhì)成分、蛋白組成等也還需進(jìn)一步的探索[6]。

外泌體與靶細(xì)胞的識(shí)別具有特異性，其介導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)傳遞的方式主要有以下四種[7]：一是直接作用于靶細(xì)胞表面的特異性受體，如T淋巴細(xì)胞源的外泌體可通過磷脂酰絲氨酸特異性識(shí)別單核細(xì)胞膜表面的受體，從而誘導(dǎo)膽固醇堆積，這一過程可被抗磷脂酰絲氨酸受體的抗體抑制[8]；二是被靶細(xì)胞攝入，釋放生物活性物質(zhì)發(fā)揮作用，如腫瘤細(xì)胞源的外泌體通過被自然殺傷細(xì)胞吸收，轉(zhuǎn)移HSP70來激活自然殺傷細(xì)胞，促進(jìn)機(jī)體的抗腫瘤功能[9]；三是細(xì)胞間受體轉(zhuǎn)移，如人體血漿中外泌體中含有轉(zhuǎn)錄因子受體-PPARγ，具有調(diào)節(jié)免疫相關(guān)細(xì)胞與脂肪細(xì)胞基因表達(dá)的作用[10]，四是通過與受體細(xì)胞融合后釋放mRNA、microRNA等傳遞遺傳信息，如小鼠肥大細(xì)胞源的外泌體可被人的肥大細(xì)胞攝入，其攜帶的mRNA進(jìn)入人細(xì)胞胞漿后能被翻譯成蛋白[11]。常見的細(xì)胞間信息交流方式是通過細(xì)胞釋放蛋白等信號(hào)分子來傳遞的，通過作用于靶細(xì)胞膜表面受體激活胞內(nèi)信號(hào)通路，從而引起受體細(xì)胞功能狀態(tài)的變化。外泌體與這些信號(hào)傳遞分子不同，是細(xì)胞間交流的特殊媒介[12]，其介導(dǎo)的細(xì)胞間信息交換確保了細(xì)胞信號(hào)分子體液彌散過程的順利，保證了部分在細(xì)胞外環(huán)境中易失活或降解的活性成分能夠順利轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞而發(fā)揮其功能。外泌體中運(yùn)載的活性分子種類豐富，富含脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、mRNA、microRNA等成分，可調(diào)控基因表達(dá)影響，影響蛋白的分布和修飾，其膜結(jié)構(gòu)中含有跨膜蛋白PGRL、LAMP1、LAMP2以及有膜轉(zhuǎn)運(yùn)融合蛋白annexins、RAN、GTPases，膜上具有能綁定特異性肽鏈的MHC-1/2蛋白，且膜上的脂質(zhì)筏Chol、ceramide、SM、PC等能限制膜流動(dòng)，參與物質(zhì)內(nèi)吞、跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、脂質(zhì)及蛋白定向分選等多種調(diào)節(jié)。外泌體通過信號(hào)通路、細(xì)胞自動(dòng)調(diào)節(jié)以及關(guān)鍵酶反應(yīng)等方式多途徑、多靶點(diǎn)地對(duì)受體細(xì)胞功能活動(dòng)進(jìn)行調(diào)節(jié)，有效地提高了細(xì)胞間相互作用的精度和效率，更加符合機(jī)體生命活動(dòng)的需要。因此，與外泌體產(chǎn)生相關(guān)的重要分子有Ral、ARF6、PLD2、RAB家族等，外泌體在體內(nèi)廣泛而穩(wěn)定的分布，對(duì)機(jī)體包括內(nèi)分泌調(diào)節(jié)在內(nèi)的各項(xiàng)生命活動(dòng)具有重要意義。

2 外泌體與證候研究的聯(lián)系

外泌體具體發(fā)揮哪種效應(yīng)機(jī)制是由其生理與病理狀態(tài)所決定的，外泌體的成分能夠反映釋放細(xì)胞的功能，并且可能包含細(xì)胞病態(tài)相關(guān)的物質(zhì)信息[13]，如在肝臟中，肝細(xì)胞的外泌體具有調(diào)節(jié)肝細(xì)胞增殖的作用[14]，巨噬細(xì)胞源的外泌體對(duì)肝臟炎癥反應(yīng)具有調(diào)節(jié)功能[15]，而肝星狀細(xì)胞的外泌體參與了肝纖維化的形成過程[16]，在酒精肝的機(jī)理研究中發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞能在乙醇激活的Caspase3依賴通路調(diào)控下，分泌含有CD40配體的外泌體，進(jìn)而促進(jìn)巨噬細(xì)胞活化，加重肝臟的炎癥反應(yīng)[17]；在外界刺激下，神經(jīng)元通過釋放信號(hào)提高少突膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+通道的通透性，促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞外泌體的釋放[18]，少突膠質(zhì)細(xì)胞的外泌體又能夠增強(qiáng)神經(jīng)元的活性，這一過程與Akt、Erk1/2激酶的調(diào)控密切相關(guān)[19]。在疾病的發(fā)生過程中，外泌體的結(jié)構(gòu)和功能均發(fā)生相應(yīng)變化，如在心肌梗死的炎癥早期，中性粒細(xì)胞來源的外泌體可刺激生成IL-10而發(fā)揮抗炎作用，而在炎癥晚期，纖維母細(xì)胞分泌的外泌體則會(huì)引起MCP-1、MMPs等促炎因子的升高[20]；在神經(jīng)退行性疾病研究中發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元與腦脊液中的外泌體中檢測到含有豐富的蛋白質(zhì)侵染因子，提示外泌體在退行性病變的發(fā)病中起到一定的作用[21]。外泌體在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用日益被研究者們所重視，不同組織細(xì)胞來源的外泌體功能各異，影響著機(jī)體各個(gè)系統(tǒng)的功能活動(dòng)與病理改變，并且外泌體的調(diào)控作用可能與一些發(fā)病機(jī)理尚不明確的疾病密切相關(guān)。

在證候的現(xiàn)代研究中，病證結(jié)合的研究思路具有非凡的指導(dǎo)意義[22]，病證結(jié)合是將中醫(yī)證的概念與西醫(yī)病的理論進(jìn)行結(jié)合，加強(qiáng)了傳統(tǒng)中醫(yī)證候理論的科學(xué)屬性，結(jié)合現(xiàn)代研究技術(shù)和方法，使證候更加客觀化，使辨證論治更具科學(xué)性。外泌體作為如今各類疾病研究的熱點(diǎn)，同樣可以作為研究中醫(yī)證候生物學(xué)基礎(chǔ)的基石，以腦卒中為例，有研究表明當(dāng)腦卒中發(fā)生時(shí)，成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞在谷氨酸的作用下釋放外泌體，外泌體中包含的Hsc/HSP70、H2O2、SOD-I等能在神經(jīng)元的應(yīng)激保護(hù)中起到一定的作用，將缺血損傷限制在局部范圍[23]；而腦卒中的證候類型主要以風(fēng)痰瘀阻證、陰虛風(fēng)動(dòng)證、風(fēng)火上擾證為主[24]，因此，可以將腦卒中不同證候中少突膠質(zhì)細(xì)胞釋放的外泌體作為研究對(duì)象，以此探索腦卒中證候規(guī)律與發(fā)病機(jī)制的途徑。在疾病與證候進(jìn)行之時(shí)，機(jī)體的相應(yīng)系統(tǒng)中發(fā)生著微觀物質(zhì)改變，同樣也會(huì)引起相關(guān)細(xì)胞分泌外泌體的結(jié)構(gòu)功能變化，將外泌體引入中醫(yī)證候機(jī)制的研究中，以病證結(jié)合的思維作為橋梁，探索外泌體在證候發(fā)生過程中的變化，將有助于更全面地探索證候的生物機(jī)制。

3 外泌體與證候診斷的相關(guān)性分析

在機(jī)體內(nèi)，不同細(xì)胞內(nèi)包含的物質(zhì)存在差異，其釋放的外泌體內(nèi)容物也會(huì)有相應(yīng)的不同，不同生理病理狀態(tài)下細(xì)胞分泌的外泌體也有不同。外泌體攜帶了特異的生物信息，介導(dǎo)疾病的進(jìn)程，具有作為生物標(biāo)志物的潛力[25]。因此，檢測外泌體中特異的分子標(biāo)志物，比較健康與疾病狀態(tài)下外泌體中物質(zhì)的差異在疾病診斷過程中具有廣闊的應(yīng)用前景[26]。血液與體液中的外泌體易于分離，穩(wěn)定性較高，常用于疾病標(biāo)志物的檢測，如外周血提取的外泌體中的glypican-1+可用于胰腺癌的診斷，其特異性和敏感性優(yōu)于傳統(tǒng)診斷指標(biāo)CA19-9[27]；外周血外泌體中miR-141的表達(dá)水平可用于前列腺腫瘤的良性與惡性鑒別[28]；肝星狀細(xì)胞外泌體表面標(biāo)志物CD81在慢性C型肝炎中的表達(dá)上調(diào)，這表明肝星狀細(xì)胞外泌體中的CD81可以作為慢性C型肝炎的潛在診斷治療標(biāo)志物[29]；在急性腎損傷模型中，尿液來源的外泌體中胎球蛋白A含量增加了50倍，其含量變化比傳統(tǒng)標(biāo)記物肌苷酸發(fā)生得更早[30]；尿液來源外泌體中的ATF3和WT-1可能分別是急性腎小管損傷和慢性腎相關(guān)足突狀細(xì)胞損傷的新型生物標(biāo)記物，這一結(jié)論尚需大樣本的臨床驗(yàn)證[31]。

無論在生理還是病理狀態(tài)下，細(xì)胞都能分泌相應(yīng)的外泌體，其包含的物質(zhì)能夠代表細(xì)胞或系統(tǒng)的一定的生理病理狀況，將外泌體的內(nèi)容物作為一種生物標(biāo)志物用于臨床疾病診斷，與中醫(yī)辨證論治中微觀辨證的理念息息相關(guān)。微觀辨證指明了證候標(biāo)準(zhǔn)化的研究方向，其發(fā)展離不開病證結(jié)合的科學(xué)思維，將研究發(fā)現(xiàn)的外泌體內(nèi)容物中的疾病診斷標(biāo)志物用于證候的診斷是研究的基本思路，能否在外泌體內(nèi)容物中發(fā)掘出某一證候的診斷標(biāo)志物也是研究的難點(diǎn)所在。外泌體雖然作為生物標(biāo)記物的研究位點(diǎn)具有一定優(yōu)勢，但在研究中仍然需要謹(jǐn)慎對(duì)待。首先，外泌體數(shù)量龐大，種類繁多，但單個(gè)外泌體內(nèi)容物含量較少，因此在考慮將外泌體作為生物標(biāo)記物時(shí)需考慮內(nèi)容物的有效豐度。其次，提取出的外泌體的純度直接影響生物標(biāo)記物的研究結(jié)果，外泌體的提取與鑒定尤為重要。最后，由于外泌體來源于各種類型的細(xì)胞，如果從血液、汗液、尿液等外泌體種類較多的體液中提取外泌體，則需要進(jìn)行外泌體來源細(xì)胞的篩選?？傊?，在病證結(jié)合思維與微觀辨證方法的指導(dǎo)下，將外泌體作為中醫(yī)證候診斷的潛在靶點(diǎn)是很有意義的，但仍需要仔細(xì)深入的研究與探索。

4 展望

在機(jī)體的各種生理和病理過程中，外泌體從釋放到與特定受體細(xì)胞結(jié)合傳遞信息，發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用，在病證結(jié)合的研究思路下，外泌體可作為證候機(jī)制研究的一條新途徑；同時(shí)，深入探討各類細(xì)胞釋放的外泌體的結(jié)構(gòu)和功能，能夠?yàn)槲⒂^辨證和證候的診斷與標(biāo)準(zhǔn)化提供新的思路。此外，由于外泌體形態(tài)較小，易透過血腦屏障[32]，結(jié)合方證研究的相關(guān)思路，中藥復(fù)方對(duì)外泌體的作用也可能成為證候研究的一個(gè)有效手段?？傊?，外泌體作為一個(gè)新的研究熱點(diǎn)，如何使其與證候研究相契合，發(fā)揮出最大的潛力，需要中醫(yī)藥研究者們共同的探索與思考。

[1]Tetta C，Ghigo E，Silengo L，et al.Extracellular vesicles as an emerging mechanismofcell-to-cell communication[J].Endocrine，2013，44(1):11.

[2]Johnstone R M，Adam M，Hammond J R，et al.Vesicle formation during reticulocyte maturation.Association of plasma membrane activities with released vesicles (exosomes)[J].Journal of Biological Chemistry，1987，262(19):9412.

[3]Raposo G，Nijman HW，Stoorvogel W，et al.B lymphocytes secrete antigenpresenting vesicles[J].Journal of Experimental Medicine，1996，183(3):1161.

[4]SimpsonR，JensenSJ.Proteomicprofilingofexosomes:currentperspectives[J].Proteomics，2008，8(19):4083.

[5]吳金恩，丁軍濤.外泌體生物學(xué)功能及應(yīng)用研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2016，37(12):90-94.

[6]LeeY，ElAndaloussiS，WoodMJA.Exosomesand microvesicles:extracellularvesicles for genetic information transfer and gene therapy[J].Human MolecularGenetics，2012，21(R1):R125.

[7]Camussi G，Deregibus M C，Bruno S，et al.Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication[J].Kidney International，2010，78(9):838-848.

[8]Zakharova L，Svetlova M，F(xiàn)omina A F.T cell exosomes induce cholesterol accumulation in human monocytes via phosphatidylserine receptor.J Cell Physiol[J].Journal ofCellular Physiology，2007，212(1):174.

[9]Lancaster G I，F(xiàn)ebbraio M A.Exosome-dependent Trafficking of HSP70 A NOVELSECRETORYPATHWAYFOR CELLULAR STRESSPROTEINS[J].JournalofBiologicalChemistry，2005，280(24):23349.

[10]Looze C，Yui D，Leung L，et al.Proteomic profiling of human plasma exosomes identifies PPARgamma as an exosome-associated protein[J].Biochemical&Biophysical Research Communications，2009，378(3):433.

[11]ValadiH，Ekstr?mK，BossiosA，etal.Exosome-mediated transfer ofmRNAs andmicroRNAsisanovelmechanismofgeneticexchangebetweencells[J].Nature Cell Biology，2007，9(6):654-659.

[12]Sun D，Zhuang X，Zhang S，et al.Exosomes are endogenous nanoparticles that can deliver biological information between cells[J].Advanced DrugDeliveryReviews，2013，65(3):342-347.

[13]Mathivanan S，Lim J W E，Tauro B J，et al.Proteomics analysis of A33 immunoaffinity-purified exosomes released from the human colon tumor cell line LIM1215 reveals a tissue-specific protein signature[J].Molecular&Cellular Proteomics Mcp，2010，9(2):197.

[14]Nojima H，F(xiàn)reeman CM，Schuster R M，et al.Hepatocyte exosomes mediate liver repair and regeneration via sphingosine-1-phosphate[J].Journal ofHepatology，2016，64(1):60.

[15]Saha B，Momenheravi F，Kodys K，et al.MicroRNA Cargo of Extracellular Vesicles fromAlcohol-exposed Monocytes Signals Naive Monocytes to DifferentiateintoM2Macrophages[J].JournalofBiologicalChemistry，2016，291(1):149.

[16]Chen L，Chen R，Kemper S，et al.Suppression of fibrogenic signaling in hepatic stellate cells byTwist1-dependent microRNA-214 expression:Role of exosomesinhorizontaltransferofTwist1[J].AmericanJournalofPhysiologyGastrointestinal&LiverPhysiology，2015，309(6):G491.

[17]Verma VK，Li H，WangR，et al.Alcohol stimulates macrophage activation through caspase dependent hepatocyte derived release of CD40L containing extracellular vesicles[J].Journal ofHepatology，2016，64(3):651.

[18]Carsten F，Dominik F，Eva-Maria K A.Emerging Roles of Exosomes in Neuron Glia Communication[J].Frontiers in Physiology，2012，3(3):119.

[19]Jin K，MaoXO，Zhu Y，et al.MEKand ERKprotect hypoxic cortical neuronsviaphosphorylationofBad[J].JournalofNeurochemistry，2002，80(1):119.

[20]Distler J H W，PisetskyDS，Huber LC，et al.Microparticles as regulators of inflammation:Novel players of cellular crosstalk in the rheumatic diseases[J].Arthritis&Rheumatism，2005，52(11):3337-3348.

[21]Berrone E，Corona C，Mazza M，et al.Detection of cellular prion protein in exosomes，derived from ovine plasma[J].Journal of General Virology，2015，96(12):3698.

[22]李柳驥，陳家旭.試述中醫(yī)病證結(jié)合的關(guān)系[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，27(3):7-9.

[23]Frühbeis C，F(xiàn)r?hlich D，Wen P K，et al.Neurotransmitter-Triggered Transfer of Exosomes Mediates Oligodendrocyte Neuron Communication[J].PLoSBiology，2013，11(7):e1001604.

[24]陳光艷.缺血性腦卒中患者中醫(yī)體質(zhì)、中醫(yī)證候類型、5-HT、NE與腦卒中后抑郁發(fā)病的關(guān)系研究[D].濟(jì)南：山東中醫(yī)藥大學(xué)，2014.

[25]覃思華，鄭磊.外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展[J].臨床檢驗(yàn)雜志，2016，34(12):927-930.

[26]朱偉，李雅紅.Exosomes(外體)在臨床診斷和治療中的應(yīng)用[J].臨床檢驗(yàn)雜志，2012，30(10):846-849.

[27]Melo S A，Luecke L B，Kahlert C，et al.Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer[J].Nature，2015，523(7559):177.

[28]ThéryC，Duban L，Segura E，et al.Indirect activation ofna?ve CD4+Tcells bydendritic cell-derived exosomes[J].Nature Immunology，2002，3(12):1156-1162.

[29]Welker MW，Reichert D，Süsser S，et al.876 Soluble SerumCD81 is Elevated in Patients with Chronic Hepatitis C and Correlates with Alanine Aminotransferase SerumActivity[J].Plos One，2012，7(2):S341-S341.

[30]Zhou H，Pisitkun T，Aponte A，et al.Exosomal Fetuin-A identified byproteomics:a novel urinary biomarker for detecting acute kidney injury.[J].Kidney International，2006，70(10):1847-1857.

[31]Zhou H，CheruvankyA，Hu X，et al.Urinaryexosomal transcription factors，a newclass ofbiomarkers for renal disease[J].KidneyInternational，2008，74(5):613-621.

[32]SquadritoML，BaerC，BurdetF，etal.EndogenousRNAsmodulatemicroRNAsortingtoexosomesandtransfertoacceptorcells[J].CellReports，2014，8(5):1432.