王麗麗, 楊宇琴，柯尊暉，黎 晨，尤培蒙，韓 冰，楊 田，郭 忠，趙 晉

(西北民族大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730030)

HPV屬于乳頭瘤空泡病毒A屬，為小型雙鏈環(huán)狀DNA病毒，約含8 000個堿基，對皮膚和粘膜上皮細胞具有高親嗜性，能夠主要引起人類皮膚黏膜的增生性病變.HPV根據(jù)其致癌的危險程度可分為低危型和高危型.高危型HPV感染的組織比低危型HPV感染的組織有更多的增殖趨勢和DNA損傷存在[1].HPV感染可導(dǎo)致多種疾病，有研究表明[2]低危型HPV6和11是生殖器疣的病因，HPV還與喉癌有一定病因?qū)W聯(lián)系，然而與食管癌和肺癌的關(guān)系尚不能確定.高危型HPV16、18、31、33、45、52、61等是子宮頸、外陰、陰道、陰莖、肛門和口腔以及口咽癌的病因.DNA損傷應(yīng)答(DNA damage response，DDR)是細胞維持基因組穩(wěn)定性的重要保護機制，是一個復(fù)雜的過程，對生物體的監(jiān)控與修復(fù)DNA損傷極為重要.DNA損傷及應(yīng)答異常與腫瘤有關(guān)， 如卵巢癌發(fā)病與BRCA1異常甲基化和H2AX過度磷酸化等有聯(lián)系[3].HPV的復(fù)制能夠激活DDR.病毒致癌蛋白的產(chǎn)生也會對宿主細胞DDR造成影響.本文對HPV感染與宿主細胞DNA損傷應(yīng)答關(guān)系的研究進展進行綜述.

1 HPV的分子生物學(xué)特征

HPV為二十面體立體對稱的雙鏈環(huán)狀DNA病毒，僅由蛋白外殼和DNA核心組成，直徑52～55 nm，相對分子質(zhì)量為5 ×106Da，目前根據(jù)HPV DNA序列表達基因不同，已確定HPV亞型超過200種.HPV基因組含有8個開放閱讀框架和1個上游調(diào)節(jié)區(qū)，按功能可分為3個部分:早期基因區(qū)(E).晚期基因區(qū)(L)及上游調(diào)控區(qū)(URR)，其中6個開放閱讀框架組成E區(qū).其編碼的蛋白在病毒復(fù)制的早期表達，稱為早期蛋白，即E1、E2、E4、E5、E6和E7，2個開放閱讀框架組成L區(qū)，編碼的蛋白在病毒復(fù)制的晚期表達，稱為晚期蛋白，即主要衣殼蛋白L1和小衣殼蛋白L2[4].早期蛋白中，E1 和E2負責病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，E4則協(xié)助感染細胞釋放病毒[5].近期研究發(fā)現(xiàn)，E5通過促進病毒癌基因的轉(zhuǎn)化、干預(yù)生長因子受體、干擾細胞周期蛋白和細胞周期蛋白依賴激酶(CDKs)[6]等環(huán)節(jié)發(fā)揮致癌作用.E6和E7都參與細胞的永生化，誘導(dǎo)宿主基因組不穩(wěn)定性.E6可降解p53，激活端粒酶等，E7 則與視網(wǎng)膜細胞瘤腫瘤抑制蛋白家族(Rb、p107、p130)、AP-1轉(zhuǎn)錄因子、細胞周期蛋白、CDKs和細胞周期蛋白依賴激酶抑制物(CKIs)相互作用，誘導(dǎo)細胞增殖[7].

2 HPV的復(fù)制周期

HPV通過感染上皮基底層細胞起始復(fù)制，并隨感染細胞的分化而增殖.宿主細胞的分化在病毒復(fù)制中起到關(guān)鍵作用.HPV復(fù)制周期包括建立期(establishment)、維持期(maintenance)和擴增期(amplification).在建立期，破損的皮膚和黏膜為HPV 進入機體提供了機會.病毒先潛伏于表皮細胞和基底層細胞間，在機體免疫力降低等情況下，病毒粒子可與細胞表面的受體結(jié)合并進入細胞核[8].在維持期，病毒主要以游離狀態(tài)存在于基底層細胞并且維持低拷貝.細胞每進入S期，病毒就在E1、E2以及細胞復(fù)制蛋白的協(xié)同作用下復(fù)制一次[9].一些上皮細胞在不斷分裂過程中離開基底層并開始分化，這時出現(xiàn)兩種情況，未感染HPV的上皮細胞在分化為角質(zhì)細胞后停止分裂，細胞核逐步退化；而感染了HPV的細胞在分化的同時仍然保持分裂和增殖活性，并促使病毒DNA大量復(fù)制，形成了HPV的擴增期，每個細胞中病毒基因組的拷貝數(shù)可達到并維持在幾百，甚至幾千拷貝[10].總的來說，HPV感染上皮黏膜是一個長期過程, 甚至可潛伏在細胞內(nèi)若干年.

3 HPV感染與宿主細胞DNA損傷應(yīng)答的相互作用

細胞的DNA損傷有多種類型，DNA雙鏈斷裂或DNA復(fù)制阻滯是最常見DNA損傷性結(jié)構(gòu)改變，其能啟動多種信號通路，涉及的損傷識別因子主要有：Mre11-Rad50-Nbs1復(fù)合體(MRN)、磷脂酰肌醇3激酶樣—激酶(PI3)ATM(ataxia-telangiectasia mutated)和ATR(ATM-and Rad3-related)等，最終觸發(fā)細胞周期抑制、DNA損傷修復(fù)或誘導(dǎo)細胞凋亡[11].研究表明[12]，HPV需要激活 DDR，以完成一個成功的生命周期.這種激活對維持上皮細胞內(nèi)的病毒基因組并不需要，但對于HPV生命周期的擴增期是必要的，目前尚不清楚其建立期是否需要激活DDR.但由于DDR反應(yīng)的激活通常會引起細胞周期阻滯，從而阻礙病毒的生命周期，因此HPV同時也選擇性地抑制宿主細胞DNA損傷應(yīng)答[13].事實上，HPV在其生命周期的多個時期可以激活和異常調(diào)節(jié)DDR通路，以達到在宿主細胞中完成復(fù)制的目的[14]，其中，HPV E1、E2、E6和E7蛋白在這個過程中起了主要的作用.

3.1 HPV E1和E2在宿主細胞DDR中的作用

HPV E1和E2蛋白以及病毒基因組，構(gòu)成病毒復(fù)制復(fù)合體的核心.E1和E2蛋白與復(fù)制起始位點(origin，Ori)結(jié)合起始病毒DNA的復(fù)制.在感染之后，病毒基因組必須迅速擴增到每個細胞20～50個拷貝數(shù)，這種復(fù)制潛在地產(chǎn)生“onion skin”結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生扭轉(zhuǎn)應(yīng)力，促進DNA單鏈斷裂和DNA雙鏈斷裂的形成.這一結(jié)果被細胞認為是DNA損傷，進而激活A(yù)TR和ATM路徑，進一步激活DDR，因此HPV E1～E2介導(dǎo)的復(fù)制具有直接激活DDR的能力[15].E1和E2可將DNA修復(fù)蛋白招募到病毒復(fù)制中心，這些蛋白質(zhì)很可能被利用去復(fù)制病毒基因組[13].

HPV E1由三個功能域組成，許多調(diào)控和定位信號存在于蛋白質(zhì)的N端，包括核定位信號和核出口信號，以及細胞周期蛋白E/A結(jié)合序列和兩個Cdk2磷酸化位點.HPV E1的功能最明顯的是它的解旋酶域，位于蛋白質(zhì)的C端，每個域和位點都是高效的病毒復(fù)制所需要的[16].研究表明，HPV E1的表達可以激活DDR，誘發(fā)S期停滯.這種激活依賴于HPV E1的Ori結(jié)合和解旋酶域，其中ATM的自動磷酸化參與該過程[17-18].一旦ATM被激活，就會磷酸化大量的效應(yīng)分子，包括組蛋白H2AX和Chk2，這就觸發(fā)了一個信號級聯(lián)，引起了病變的修復(fù)和細胞周期的停止[19].ATR也被激活以響應(yīng)HPV E1的表達，從而導(dǎo)致ATR和Chk1 (ATR的下游靶點)的磷酸化.與ATM不同的是，ATR只在一部分HPV E1表達的細胞中被激活，表明這種激活發(fā)生在細胞周期的某些階段[20].

HPV E2是一種模塊化的蛋白質(zhì)，由C-末端DNA結(jié)合域和N-末端轉(zhuǎn)錄激活域組成.E2的C端與HPV基因組結(jié)合，并將其與宿主細胞基因組相連，從而保證了病毒子代在分裂中的精確分離.HPV E2也是病毒基因表達的主要調(diào)控因子，通過與p300和p300/CBP-Associated Factor(p/CAF)這兩個細胞組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HATs)的相互作用，促進HPV E6和E7的表達，從而推動病毒轉(zhuǎn)錄[21].同時，在DNA損傷后，p300和p/CAF乙?；痯53，增加p53的序列特異性結(jié)合能力，從而使其能夠驅(qū)動靶基因轉(zhuǎn)錄，最終導(dǎo)致DNA修復(fù)反應(yīng)被完全激活.而E2與p300和p/CAF的作用可能間接干擾了p53的激活，減弱了DDR[22-23].

3.2 HPV E6和E7在宿主細胞DDR中的作用

E6和E7基因，分別編碼含有150個氨基酸和100個氨基酸的病毒原癌蛋白，兩者共同存在Cys-X-X-Cys(半胱氨酸—任意氨基酸—任意氨基酸—半胱氨酸)序列，均具有鋅指結(jié)構(gòu).

通常大量的DNA損傷會導(dǎo)致細胞凋亡，但HPV E6蛋白可阻止DDR信號，從而提高細胞對DNA損傷的耐受性[13].高危型HPV E6可干擾JAK /STAT 通路誘導(dǎo)，其與細胞E3泛素連接酶即E6 相關(guān)蛋白( E6-associated protein，E6AP) 結(jié)合，E6AP 泛素化p53并將其降解.E6還可通過阻止 P53乙?；瘉硪种破涔δ?，進而抑制STAT1 表達，而STAT1表達抑制HPV復(fù)制[24].此外，HPV E6還可以通過抑制反式激活p53的蛋白質(zhì)而間接阻斷p53的轉(zhuǎn)錄激活.最終，這些關(guān)鍵的p53基因修飾蛋白的數(shù)量減少，破壞了p53的穩(wěn)定性以及響應(yīng)DNA損傷時的激活過程，所以盡管存在著損傷的DNA，但細胞允許繼續(xù)增殖.HPV E6通過與參與DNA單鏈斷裂修復(fù)的2種蛋白(XRCC1 和O6methylguanine-DNA methyl-transferase)相互作用，使DNA單鏈斷裂的修復(fù)變?nèi)?，說明人乳頭狀瘤病毒E6不僅停止p53的活動還直接擾亂了多個修復(fù)途徑以確保他們不暫停細胞周期和誘導(dǎo)DNA損害后的細胞凋亡[25].另外，HPV E6還可以通過直接改變促凋亡和抗凋亡Bcl-2家族成員之間的平衡，阻滯內(nèi)在凋亡通路[26-27].

E7蛋白也參與了HPV陽性細胞中DDR的激活，E7可以通過兩種方式增加宿主DDR蛋白的數(shù)量.首先，通過干擾E2F1-pRb相互作用，使E2F1激活DDR基因的轉(zhuǎn)錄；第二，通過E7和DDR因子的直接相互作用，利用一種未知的機制穩(wěn)定宿主蛋白，同時，E7也增加了激活的DDR因子的水平，如磷酸化Chk2和Chk1[13,28].雖然E7能夠激活DDR，但有研究表明， E7在DNA損傷應(yīng)答過程中具有抑制作用[29]，能推動細胞周期的進程.E7可以 與去磷酸化的pRb作用, 阻止其與E2F轉(zhuǎn)錄因子反應(yīng)，還可與E2F轉(zhuǎn)錄因子直接作用, 促進其轉(zhuǎn)錄活性, 或減弱E2F6的轉(zhuǎn)錄抑制功能，從而推動細胞周期的進程[30].HPV E7也可以通過增加CDKs活性和抑制CKIs來促進細胞周期[31-32].

4 結(jié)語

宿主細胞中，HPV病毒復(fù)制與宿主細胞的DNA 損傷應(yīng)答反應(yīng)共同存在且相互作用.在HPV生命周期的建立期和擴增期，病毒基因組必須在每個細胞周期中不止一次復(fù)制.這種復(fù)制會對病毒基因組施加壓力，使其產(chǎn)生DNA單鏈斷裂和DNA雙鏈斷裂，從而激活DDR.HPV E1和E2主要能夠激活DDR，募集修復(fù)蛋白引起病毒基因組的復(fù)制.為了避免DDR引起的細胞周期阻滯，HPV E6和HPV E7通過多種途徑提高了宿主細胞對基因組不穩(wěn)定性和DDR的耐受性.因此，HPV通過操控DDR來復(fù)制病毒基因組，并為病毒的傳播維持良好的細胞環(huán)境[33].目前，HPV 感染與宿主細胞的DNA 損傷應(yīng)答間還有許多機制不清楚，而了解兩者的關(guān)系, 有助于我們更好地預(yù)防與治療HPV病毒引起的疾病，減少該病毒對人類帶來的危害.