自體支氣管基底層細(xì)胞治療慢性阻塞性肺疾病的小樣本探索性研究*

程 林，袁 慊，王 瑜，馮 偉，孫鳳軍△，戴曉天

(陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院：1.藥學(xué)部；2.呼吸科,重慶 400038)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種具有氣流阻塞特征的肺氣腫和/或慢性支氣管炎，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，且病死率較高。據(jù)WHO預(yù)測(cè)，到2030年，COPD將成為全球第3位導(dǎo)致死亡的疾病[1]。新近的一項(xiàng)研究結(jié)果顯示，在20歲以上的中國(guó)人群中，通過(guò)肺功能檢查確診的COPD整體患病率為8.6%，而40歲以上人群的患病率達(dá)13.7%[2]。目前COPD的治療難以取得滿意的療效，多以緩解癥狀、提高運(yùn)動(dòng)耐量和生活質(zhì)量、延緩疾病進(jìn)展為目的。干細(xì)胞由于具有替代受損細(xì)胞的功能而被認(rèn)為具有治愈肺部疾病的潛力[3- 6]。

支氣管基底層細(xì)胞是位于支氣管上皮基底層的一類(lèi)細(xì)胞，被認(rèn)為是肺內(nèi)的干細(xì)胞，這類(lèi)細(xì)胞作為一個(gè)獨(dú)立的生命體，具有很強(qiáng)的生命力。它的分裂和遷移都比較活躍，能夠不斷產(chǎn)生新的細(xì)胞以補(bǔ)充死亡的其他類(lèi)型上皮細(xì)胞，功能上具有可塑性，可以直接修復(fù)支氣管和肺泡結(jié)構(gòu)。目前已證實(shí)支氣管基底層細(xì)胞移植可以直接修復(fù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的受損肺臟[7- 9]。作者團(tuán)隊(duì)前期研究顯示，通過(guò)支氣管鏡刷檢的方法，從人的3～5級(jí)支氣管中獲取微量組織分離提取的SOX9+支氣管基底層細(xì)胞，體外擴(kuò)增后進(jìn)行自體移植，具有修復(fù)慢性支氣管炎患者受損肺組織的功能[10- 11]。因此，作者團(tuán)隊(duì)開(kāi)展了一項(xiàng)自體支氣管基底層細(xì)胞移植治療COPD的小樣本探索性研究，初步評(píng)價(jià)自體支氣管基底層細(xì)胞治療COPD的安全性及有效性，為COPD患者的治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1一般資料 2017年10月至2018年10月，共入組4例COPD患者，患者均為男性，年齡45～70歲，體質(zhì)量指數(shù) (21.5±1.2)kg/m2,細(xì)胞實(shí)際回輸與標(biāo)準(zhǔn)劑量百分比為(99.4±17.4)%。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)性別不限，年齡18～75歲；(2)臨床診斷為COPD[12],且具有明確的支氣管擴(kuò)張病史；(3)病情穩(wěn)定2周以上，即咳嗽、咳痰、氣短等癥狀穩(wěn)定或幾乎消失，無(wú)咯血及痰中帶血，且血常規(guī)中白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞、C反應(yīng)蛋白、降鈣素原均在2周以上表現(xiàn)正常；(4)支氣管擴(kuò)張范圍分布在6個(gè)肺段及以上，且能耐受纖維支氣管鏡檢查；(5)簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)懷孕、哺乳或未采取有效避孕措施的育齡婦女;(2)梅毒、HIV抗體陽(yáng)性;(3)患有各種惡性腫瘤;(4)患有以下任何一種肺部疾病：活動(dòng)性肺結(jié)核、肺栓塞、氣胸、多發(fā)巨大肺大皰、哮喘未控制、慢性支氣管炎急性發(fā)作、極重度COPD等;(5)患有嚴(yán)重的其他系統(tǒng)疾病，如糖尿病(血糖控制不佳)、心肌梗死、不穩(wěn)定性心絞痛、肝硬化、急性腎小球腎炎等;(6)任何原因造成的白細(xì)胞減少癥或粒細(xì)胞缺乏癥;(7)患有嚴(yán)重的肝臟疾病或肝腎功能損害；(8)有精神病史或自殺危險(xiǎn)，有癲癇病或其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病病史；(9)12- 導(dǎo)聯(lián)心電圖顯示具有嚴(yán)重的心律失常(如室性心動(dòng)過(guò)速、頻發(fā)室上性心動(dòng)過(guò)速、房顫、心房撲動(dòng)等)或心臟Ⅱ度及以上傳導(dǎo)異常；(10)有酒精或違禁藥物濫用史；(11)入選前3個(gè)月內(nèi)已經(jīng)接受任何其他臨床試驗(yàn)；(12)依從性差，難以完成研究；(13)研究者認(rèn)為可能存在增加受試者危險(xiǎn)性或干擾臨床試驗(yàn)的任何情況。本研究經(jīng)第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)NCT02722642)。

1.2方法

1.2.1支氣管基底層細(xì)胞治療前的采集、分離和培養(yǎng) 通過(guò)支氣管鏡刷檢的方法，從患者的3～5級(jí)支氣管中獲取微量組織分離提取支氣管基底層細(xì)胞。將獲得的組織沖洗下來(lái)，酶解消化成單細(xì)胞懸液后進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)為蘇州吉美瑞生醫(yī)學(xué)科技有限公司的專(zhuān)利技術(shù)，能夠選擇性地?cái)U(kuò)增支氣管基底層細(xì)胞，而其他類(lèi)型的成熟上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等則無(wú)法生長(zhǎng)而自然凋亡。支氣管基底層細(xì)胞在經(jīng)過(guò)一段時(shí)間擴(kuò)增之后，保存在液氮細(xì)胞庫(kù)內(nèi)。在用于患者之前，進(jìn)行微生物污染、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞存活力、遺傳特性、Krt5標(biāo)記基因等檢測(cè)。

1.2.2支氣管基底層細(xì)胞治療的具體措施 胸部CT定位后，患者平臥位，在局部麻醉下經(jīng)鼻纖維支氣管鏡生理鹽水局部緩慢灌洗病灶部位的葉或段支氣管，每次50 mL，根據(jù)病灶范圍決定灌洗總量，病灶累及5個(gè)肺段及以下，每肺段灌洗150～200 mL；若病灶累及6個(gè)肺段及以上，每個(gè)肺段灌洗不超過(guò)150 mL(根據(jù)前期放射性肺纖維化局部灌洗經(jīng)驗(yàn)，患者局部麻醉吸氧狀態(tài)下局部葉或段的肺灌洗耐受量在600 mL為宜)。在灌洗結(jié)束后，盡量吸盡病灶肺葉或肺段支氣管內(nèi)的液體，期間可間斷使用全身激素、支氣管擴(kuò)張劑。待患者經(jīng)皮血氧飽和度為92%以上且生命體征平穩(wěn)后，再次經(jīng)纖維支氣管鏡將支氣管基底層細(xì)胞懸液注入病灶部位的葉或段支氣管。病灶在肺下野的各段支氣管，一次性注入各段支氣管5 mL自體支氣管基底層細(xì)胞懸液；病灶在肺上、中野的各段支氣管，一次性注入各段支氣管7 mL自體支氣管基底層細(xì)胞懸液，在完成移植后要求患者保持平臥狀態(tài)2 h左右。自體支氣管基底層細(xì)胞的細(xì)胞量為每人1×106個(gè)/kg。同時(shí)，在注入自體支氣管基底層細(xì)胞后，通過(guò)球囊置放以保證自體支氣管基底層細(xì)胞準(zhǔn)確而有效的定位及植入量，從而提高局部的移植率。治療后禁止使用的藥物：(1)全身用免疫抑制劑，包括吸入性激素(手術(shù)當(dāng)天允許使用)。(2)N- 乙酞半胱氨酸、秋水仙堿、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗菌藥物、干擾素、抗細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子- α(TNF- α)抑制劑。(3)吡非尼酮、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子- β(TGF- β)抑制劑等經(jīng)動(dòng)物試驗(yàn)證明對(duì)于基底層細(xì)胞移植有促進(jìn)作用的藥物。

1.2.3自體支氣管基底層細(xì)胞移植成功的判定標(biāo)準(zhǔn) 在注入各段自體支氣管基底層細(xì)胞懸液并球囊置放2～3 min后，觀察相應(yīng)各段支氣管開(kāi)口處是否有液體溢出，如果無(wú)明顯液體溢出，則判定為成功；如果有明顯液體溢出，則判定為失敗，需采取再次注入自體支氣管基層細(xì)胞的相應(yīng)措施。自體支氣管基底層細(xì)胞移植成功后，先拔出給藥管，后拔出纖維支氣管鏡。必要時(shí)可加用無(wú)創(chuàng)呼吸機(jī)雙側(cè)肺純氧通氣，以便自體支氣管基底層細(xì)胞和肺組織充分結(jié)合。術(shù)后禁食禁飲2 h，囑患者盡量減少咳嗽，必要時(shí)可給予可待因口服。

1.3觀察指標(biāo)

1.3.1肺功能指標(biāo) 于自體支氣管基底層細(xì)胞移植前和移植后4、12、24和48周，評(píng)估患者的肺功能相關(guān)指標(biāo)，包括第1秒用力呼氣容積(FEV1%)占預(yù)計(jì)值的百分比、用力肺活量(FVC)占預(yù)計(jì)值的百分比、FEV1/FVC、肺總量(TLC)占預(yù)計(jì)值的百分比、殘氣量(RV)占預(yù)計(jì)值的百分比、RV/TLC、一氧化碳彌散量(DLCO)占預(yù)計(jì)值百分比及DLCO與肺泡通氣量(VA)比值(DLCO/VA)，6 min步行距離及圣喬治呼吸問(wèn)卷(SGRQ)評(píng)分。

1.3.2血常規(guī) 于自體支氣管基底層細(xì)胞移植前和移植后1、3、6個(gè)月，監(jiān)測(cè)患者的血常規(guī)相關(guān)指標(biāo)，包括白細(xì)胞(WBC)、紅細(xì)胞(RBC)、血紅蛋白、血小板(PLT)、C反應(yīng)蛋白(CRP)。

1.3.3肝腎功能指標(biāo) 于自體支氣管基底層細(xì)胞移植前和移植后1、3、6個(gè)月，監(jiān)測(cè)患者的肝功能指標(biāo)，包括丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)和腎功能指標(biāo)尿素氮、肌酐。

1.3.4心肌酶譜指標(biāo) 于自體支氣管基底層細(xì)胞移植前和移植后1、3、6個(gè)月，監(jiān)測(cè)患者的心肌酶譜指標(biāo)肌酸激酶(CK)和乳酸脫氫酶(LDH)。

2 結(jié) 果

2.1肺功能指標(biāo) 基底層細(xì)胞移植后12、24、48周，患者6 min步行距離均較移植前有所增加，SGRQ評(píng)分較移植前有所降低(P<0.05)。FEV1占預(yù)計(jì)值的百分比、TLC占預(yù)計(jì)值的百分比、RV占預(yù)計(jì)值的百分比、RV/TLC有所增高，F(xiàn)VC占預(yù)計(jì)值的百分比、FEV1/FVC、DLCO占預(yù)計(jì)值百分比及DLCO/VA有所降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.2血常規(guī) 基底層細(xì)胞移植前和移植后1、3、6個(gè)月，患者血常規(guī)指標(biāo)WBC、RBC、血紅蛋白、PLT和CRP均在正常值范圍內(nèi)，見(jiàn)表2。

2.3肝腎功能指標(biāo) 基底層細(xì)胞移植前和移植后1、3、6個(gè)月，患者肝功能指標(biāo)ALT、AST和腎功能指標(biāo)尿素氮、肌酐均在正常值范圍內(nèi)，見(jiàn)表3。

表1 COPD患者細(xì)胞移植前、后肺功能相關(guān)性指標(biāo)

-：該項(xiàng)缺失

表2 COPD患者細(xì)胞移植前、后血常規(guī)指標(biāo)

表3 COPD患者細(xì)胞移植前、后肝腎功能指標(biāo)

2.4心肌酶譜指標(biāo) 基底層細(xì)胞移植前和移植后1、3、6個(gè)月，患者心肌酶譜指標(biāo)CK和LDH均在正常值范圍內(nèi),見(jiàn)表4。

表4 COPD患者細(xì)胞移植前、后心肌酶譜 指標(biāo)

3 討 論

COPD的發(fā)病機(jī)制目前尚不完全清楚，可能的原因?yàn)檠趸? 抗氧化失衡導(dǎo)致氣道上皮細(xì)胞受損、蛋白酶- 抗蛋白酶失衡、炎性細(xì)胞增多、感染、肺內(nèi)細(xì)胞凋亡等。有研究顯示，COPD患者肺組織內(nèi)肺泡上皮細(xì)胞、結(jié)構(gòu)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等發(fā)生凋亡，細(xì)胞再生及繁殖能力相對(duì)不足，維持肺正常結(jié)構(gòu)及功能的能力下降，導(dǎo)致肺氣腫形成[13]，且在COPD患者早期，患者存在肺內(nèi)上皮祖細(xì)胞的衰竭[14]。而支氣管基底層細(xì)胞能夠不斷分化為各種類(lèi)型的細(xì)胞，從而取代凋亡的細(xì)胞，維持肺的正常結(jié)構(gòu)和功能。在動(dòng)物模型中，SOX9+支氣管基底層細(xì)胞、p63+Krt5+支氣管基底層細(xì)胞、成熟的氣管支氣管組織干細(xì)胞/祖細(xì)胞等被證實(shí)具有修復(fù)支氣管氣道的功能[7,15- 17]。

細(xì)胞治療早在20世紀(jì)70年代就開(kāi)始在血液相關(guān)疾病治療中被廣泛應(yīng)用(輸血和骨髓移植)。但是近年來(lái)逐漸興起，運(yùn)用到其他組織器官疾病的治療中，如皮膚細(xì)胞移植治療燒傷、肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞移植治療肝衰竭和其他肝代謝類(lèi)疾病、角膜緣細(xì)胞移植治療角膜損傷等。自體細(xì)胞治療存在以下優(yōu)點(diǎn)：(1)細(xì)胞來(lái)源于自身，不存在免疫排斥問(wèn)題。(2)細(xì)胞來(lái)源于成體組織器官，本身即是身體的一部分，故不存在成瘤的風(fēng)險(xiǎn)。(3)細(xì)胞具有可塑性，其分裂和遷移能力活躍，在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境中可以補(bǔ)充凋亡或壞死的同組織或同類(lèi)型細(xì)胞。(4)操作簡(jiǎn)單，移植是通過(guò)各種輸注途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的。(5)多種治療機(jī)制，包括通過(guò)遷移到組織受損部位并分化為正常組織細(xì)胞發(fā)揮修復(fù)作用，或者通過(guò)旁分泌機(jī)制，分泌各種抗炎因子，抑制促炎因子分泌發(fā)揮作用。

關(guān)于支氣管擴(kuò)張的細(xì)胞治療在ClinicalTrial.gov注冊(cè)的僅有1項(xiàng)，是美國(guó)2015年12月4日注冊(cè)的NCT02625246觀察骨髓來(lái)源細(xì)胞對(duì)非囊性纖維化支氣管擴(kuò)張的安全性、耐受性和潛在有效性研究。應(yīng)用自體支氣管基底層細(xì)胞移植治療COPD在國(guó)內(nèi)外尚鮮見(jiàn)報(bào)道。

根據(jù)COPD診治指南，COPD的管理目標(biāo)為減輕當(dāng)前癥狀，包括緩解癥狀、改善運(yùn)動(dòng)耐量和改善健康狀況；降低未來(lái)風(fēng)險(xiǎn)，包括防止疾病進(jìn)展、防止和治療急性加重和降低病死率[18]。本研究中，患者移植自體基底層細(xì)胞12、24、48周后，6 min步行距離均較移植前有所增加，SGRQ評(píng)分較移植前有所降低，說(shuō)明患者的肺功能有所好轉(zhuǎn)，生活質(zhì)量有所提高。雖然患者的FEV1占預(yù)計(jì)值百分比、TLC占預(yù)計(jì)值百分比、RV占預(yù)計(jì)值百分比、RV/TLC有所增高，F(xiàn)VC占預(yù)計(jì)值百分比、FEV1/FVC、DLCO占預(yù)計(jì)值百分比及DLCO/VA有所降低，但變化都不明顯，提示自體基底層細(xì)胞移植防止了COPD的進(jìn)一步加重。另外，移植自體基底層細(xì)胞后1、3、6個(gè)月，患者的血常規(guī)指標(biāo)、肝腎功能指標(biāo)、心肌酶譜指標(biāo)都在正常范圍內(nèi)，說(shuō)明該細(xì)胞移植方法安全。

綜上所述，自體SOX9+支氣管基底層細(xì)胞移植治療COPD患者是有效和安全的，但本研究屬于探索性研究，樣本量較小，具體該細(xì)胞移植的有效性和安全性尚需進(jìn)一步多中心、大樣本的隨機(jī)臨床對(duì)照研究進(jìn)行驗(yàn)證。