藍(lán)圓鰺腌干工藝中組織蛋白酶與游離氨基酸和滋味形成的關(guān)系

吳燕燕，曹松敏,2，李來好，楊賢慶，林婉玲，陳勝軍

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300；2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306）

傳統(tǒng)咸魚加工主要采用高鹽即20%～30%食鹽腌制魚，由于產(chǎn)品風(fēng)味獨(dú)特，耐貯藏，一直深受消費(fèi)者喜歡，但高鹽食品不利于人體健康。近年來，開發(fā)具有傳統(tǒng)咸魚風(fēng)味但低鹽的腌制產(chǎn)品越來越受到重視。腌制類制品的風(fēng)味物質(zhì)生成比較復(fù)雜，主要來源于脂肪降解及氧化、蛋白降解、美拉德反應(yīng)等。腌制品加工過程中[1-2]蛋白質(zhì)能降解形成大量的小肽和游離氨基酸[3-4]，其中部分游離氨基酸[5]能直接呈現(xiàn)出苦味、甜味或鮮味，另有部分氨基酸及小肽是腌制品風(fēng)味物質(zhì)的前體物質(zhì)。腌制品中能將蛋白質(zhì)降解為多肽和游離氨基酸的內(nèi)源性蛋白酶主要為組織蛋白酶、鈣蛋白酶。鈣蛋白酶和組織蛋白酶D在火腿腌制過程中活力基本喪失，組織蛋白酶B、L、H則在整個(gè)加工過程中均能檢測(cè)到活力[6-8]，其中組織蛋白酶B、L的活力尤其穩(wěn)定[9]。目前與蛋白降解及滋味物質(zhì)形成相關(guān)的內(nèi)源性蛋白酶類的研究主要集中在對(duì)腌制火腿加工過程中，高瑞昌等[9]利用響應(yīng)面預(yù)測(cè)方法研究了腌干鰱魚加工過程中組織蛋白酶B、L活力變化規(guī)律，但未對(duì)組織蛋白酶與蛋白降解及滋味物質(zhì)形成的關(guān)系進(jìn)行深入探究。

為改善傳統(tǒng)法腌制咸魚加工工藝，本實(shí)驗(yàn)在前期研究低鹽乳酸菌法腌制魚工藝的基礎(chǔ)上，以藍(lán)圓鰺為原料，采用傳統(tǒng)高鹽（traditional high-salted fish，HS）和低鹽乳酸菌（low-salted and lactic acid bacteria-fermented fish，LS）腌干方法對(duì)其進(jìn)行加工，測(cè)定出各個(gè)加工階段（A鮮魚、B腌制、C浸泡脫鹽、D烘干、E成品）的組織蛋白酶活力（B、L、H）、蛋白水解率（protein degradation rate，PI）及主要游離氨基酸的含量和組成變化，分析探究不同藍(lán)圓鰺腌干工藝加工過程中組織蛋白酶B、L、H的變化規(guī)律，以及各酶活同蛋白降解及游離氨基酸含量變化之間的關(guān)系。本研究旨在揭示藍(lán)圓鰺不同腌干過程中的蛋白降解規(guī)律及滋味物質(zhì)（游離氨基酸）的形成同各組織蛋白酶之間的關(guān)系，為藍(lán)圓鰺腌干魚制品的實(shí)際加工生產(chǎn)及品質(zhì)控制和工藝改進(jìn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍(lán)圓鰺：冰鮮，每條魚質(zhì)量約為80～100 g；海水曬制粗鹽 廣東臺(tái)山李貴記水產(chǎn)有限公司。

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，Lp）、腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides，Lm）和戊糖片球菌（Pediococcus peutosaceus，Pp），分離自臺(tái)山市廣海鎮(zhèn)李貴記水產(chǎn)品加工廠腌制大黃魚 （Pseudosciaena crocea）；嗜酸乳桿菌（L. acidophilus，La）、短乳桿菌（L. brevis，Lb）分離自腌制三牙魚（Otolithes ruber）。

NaAc、NaCl、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）、KH2PO4、Na2HPO4、Na2EDTA、L-Cys、ClCH2COONa、30% Brij 35、β-ME、DMSO、HAc（均為分析純） 廣州化學(xué)試劑廠；二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、7-氨基-4-甲基香豆素（7-amido-4-methylcoumarin，AMC）、Z-Arg-Arg-AMC、L-Arg-AMC、L-Phe-Arg-AMC 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；MRS肉湯培養(yǎng)基 廣州環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BS224S分析天平 美國(guó)Sartorius公司；3k30冷凍離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司；UV-2550紫外分光光度計(jì)、QP2010 plus氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用儀 日本島津公司；T25均質(zhì)機(jī) 德國(guó)IKA公司；HH-4快速恒溫?cái)?shù)顯水浴箱 常州澳華儀器公司；RC-5型熱泵干燥機(jī) 廣東省農(nóng)業(yè)機(jī)械研究所干燥設(shè)備制造廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

1.3.1.1 HS腌干魚工藝[10]

冰鮮藍(lán)圓鰺去內(nèi)臟后洗凈，放入腌漬池中，層魚層鹽（20%鹽/魚），后灌入飽和食鹽水至淹沒全部魚體，4 ℃條件下腌制36 h，取出并清水浸泡3～4 h（0.5～1 h換水1 次），浸泡脫鹽結(jié)束后置于曬網(wǎng)上晾干水分，再移入（28±2）℃ 熱泵干燥機(jī)中烘干至魚體水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為30%，包裝即為成品。

1.3.1.2 LS腌干魚工藝[11]

冰鮮藍(lán)圓鰺去內(nèi)臟后洗凈，放入腌漬池中，層魚層鹽（10%鹽/魚），后灌入飽和食鹽水至淹沒全部魚體，4 ℃腌制24 h，取出并清水浸泡3～4 h（0.5～1 h換水1 次），浸泡脫鹽結(jié)束后置于曬網(wǎng)上晾干水分，接種混合乳酸菌液（Lp∶Pp∶Lm∶La∶Lb=4∶4∶2∶3∶4），菌液濃度109CFU/mL，接種量為10mL/100g，接種完成后置于RC-5型熱泵干燥機(jī)中調(diào)節(jié)溫度至（26±1）℃，恒溫發(fā)酵17 h，然后調(diào)節(jié)溫度至（28±2）℃烘干至魚體水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%，包裝即為成品。

兩種腌制加工工藝在加工過程分5 個(gè)階段取樣：樣品A（鮮藍(lán)圓鰺）、樣品B（腌制后）、樣品C（脫鹽后）、樣品D（烘干中期）、樣品E（烘干后成品）。每個(gè)階段取樣階段均取樣5～8 條樣品魚，去除可見脂肪及魚皮，用絞肉機(jī)將樣品魚肉均勻絞碎，密封保存于-30 ℃冰箱中。

1.3.2 組織蛋白酶活力測(cè)定[12]

1.3.2.1 粗酶液的提取

稱取5.000 g樣品魚肉與20 mL預(yù)冷緩沖液（包含50 mmol/L NaAc、100 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、0.2%聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）；pH 5.0）均勻混合，均漿（15 000 r/min，6×10 s），4 ℃、10 000×g離心40 min，過濾，取上清液即為組織蛋白酶B、H、L粗酶液。

1.3.2.2 組織蛋白酶B、B＋L活力的測(cè)定

0.5 mL粗酶液與0.25 mL反應(yīng)緩沖液（B：pH 6.0，352mmol/L KH2PO4，4 mmol/L Na2EDTA，48 mmol/L Na2HPO4，使用前配制成8 mmol/L L-Cys溶液；B＋L：pH 5.5，340 mmol/L NaAc，4 mmol/L Na2EDTA，60 mmol/L HAc，使用前配制成8 mmol/L DTT溶液）均勻混合，將混合液于40 ℃水浴中預(yù)熱 5 min，后加入0.5 mL預(yù)熱5 min的酶反應(yīng)底物（B：Z-Arg-Arg-AMC、B＋L：Z-Phe-Arg-AMC；20μmol/L）混合均勻后于40 ℃水浴環(huán)境中反應(yīng)15 min，反應(yīng)完成后加入2 mL終止試劑（pH 4.3，100 mmol/L ClCH2COONa，70 mmol/L HAc，30 mmol/L NaAc；對(duì)照組：先加入終止試劑再加其他），10 000 r/min離心10 min，熒光分光光度計(jì)（λex=340 nm，λem=440 nm）測(cè)定上清液熒光值。組織蛋白酶L活力=組織蛋白酶B＋L活力-組織蛋白酶B活力。

1.3.2.3 組織蛋白酶H活力的測(cè)定[13]

L-Arg-AMC可以同時(shí)被氨肽酶和組織蛋白酶H水解，半胱氨酸蛋白酶專一不可逆抑制劑（E-64）可抑制組織蛋白酶H活力，以L-Arg-AMC為底物的樣品組實(shí)際測(cè)得的總酶活力與添加E-64抑制劑樣品組所測(cè)得的酶活之差即為組織蛋白酶H真實(shí)活力值。步驟如下：添加E-64組（A）：20 μL E-64（1 mmol/L）與0.5 mL粗酶液和0.25 mL反應(yīng)緩沖液混合均勻后40 ℃水浴環(huán)境中放置60 min；未添加E-64組（B）：0.5mL粗酶液與0.25 mL反應(yīng)緩沖液混合均勻后40 ℃水浴環(huán)境中放置5 min；最后吸取0.5 mL預(yù)熱5 min后的酶反應(yīng)底物（L-Arg-AMC；20μmol/L）添加至A、B兩組，于40 ℃水浴環(huán)境中反應(yīng)15 min，之后步驟同組織蛋白酶B活力測(cè)定方法。

用AMC制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算酶活力。一個(gè)酶活力單位（U）仍定義為每克魚肉中1min產(chǎn)生1 nmol AMC所需要的組織蛋白酶（B、B＋L、H）的數(shù)量（40 ℃）。

1.3.3 蛋白降解率（proteolysis index，PI）的測(cè)定[14-15]

非蛋白氮（nonprotein nitrogen，NPN）測(cè)定：準(zhǔn)確稱取樣品2.000 g，與20 mL超純水，40 ℃振蕩2 h，完成后加入20 mL 10% TCA溶液連續(xù)振蕩40 min，10 000 r/min離心15 min，過濾，取上清液于消化管中，加入催化劑（Cu2SO4·5H2O與K2SO4質(zhì)量比1∶9）3 g和12 mL濃硫酸，消化，冷卻后用蛋白質(zhì)自動(dòng)分析儀測(cè)定NPN含量。總氮（total nitrogen，TN）測(cè)定：準(zhǔn)確稱取樣品1.000 g，于消化管中，加入3 g催化劑和12 mL濃硫酸，消化，冷卻后用蛋白質(zhì)自動(dòng)分析儀測(cè)定TN含量。PI值計(jì)算公式如下：

1.3.4 游離氨基酸的測(cè)定

依照GB/T 22729—2008《海洋魚低聚肽粉》中的方法進(jìn)行樣品前處理，再根據(jù)GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測(cè)定》規(guī)定的方法，利用氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的所有指標(biāo)均設(shè)計(jì)3 個(gè)平行，并用Excel計(jì)算各指標(biāo)s。利用Origin 7.0軟件作圖，JMP 7.0軟件分析方法中的Tukey HSD檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)的顯著性分析。利用SPSS軟件進(jìn)行組織蛋白酶與蛋白降解和游離氨基酸之間的皮爾遜相關(guān)系數(shù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)圓鰺腌干工藝加工過程中內(nèi)源性蛋白酶類活力變化分析

組織蛋白酶B、L活力相比鮮魚中酶的活力在HS法成品中和LS法成品中分別提升了46.91%、113.11%和27.16%、100%；HS法中組織蛋白酶H活力下降了7.37%，LS法中組織蛋白酶H活力提升了10.53%。3 種組織蛋白酶B、L、H在HS法和LS法藍(lán)圓鰺加工過程中變化趨勢(shì)不相同：成品中組織蛋白酶B、L活力相比于鮮魚均呈現(xiàn)出增高趨勢(shì)，HS法成品中組織蛋白酶H活力低于鮮魚中組織蛋白酶H活力，而LS法中組織蛋白酶H活力高于鮮魚中組織蛋白酶H活力。李敏等[16]發(fā)現(xiàn)臘魚風(fēng)干末期B、L酶活力相對(duì)鮮魚中活力略有增高與本實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致，而Toldrá等[17]則發(fā)現(xiàn)火腿加工結(jié)束時(shí)組織蛋白酶B、B＋L的殘余活力僅為原料肉中酶活力的5%～15%。Flores等[18]在使用冰凍過后的原料肉加工Iberian火腿過程中發(fā)現(xiàn)成品火腿中組織蛋白酶B的活力較原料肉中活力呈現(xiàn)出增高趨勢(shì)，組織蛋白酶B＋L活力則呈現(xiàn)出降低趨勢(shì)（降低趨勢(shì)不顯著，P＞0.05），組織蛋白酶H活力則出現(xiàn)降低趨勢(shì)。趙改名等[19]發(fā)現(xiàn)金華火腿加工過程中溫度、鹽分含量、pH值對(duì)組織蛋白酶B、B＋L的活力具有復(fù)雜復(fù)合作用，酶活力并非由單一因素的變化而產(chǎn)生變化，受到多種環(huán)境因素的共同作用而產(chǎn)生相應(yīng)的變化。由此可見，原料以及加工方式不同導(dǎo)致的加工過程中加工環(huán)境各異，將對(duì)腌干魚類制品中蛋白酶活力的變化具有不同的激活或抑制作用。

圖1 藍(lán)圓鰺腌干工藝加工過程中組織蛋白酶H活力變化情況Fig. 1 Changes in cathepsin activities during dry-salted fish processing

由圖1可見，2 種藍(lán)圓鰺腌干工藝加工過程中組織蛋白酶B、L、H的變化趨勢(shì)相似，HS法中組織蛋白酶B的活力在腌制、脫鹽階段變化不顯著（P＞0.05），烘干階段活力顯著增高（P＜0.05），到烘干末期活力達(dá)到最大值；LS法中組織蛋白酶B的活力在腌制階段略有增加，脫鹽階段活力出現(xiàn)回落趨勢(shì)，烘干階段活力顯著提升（P＜0.05），在烘干中后期活力達(dá)到最大值。組織蛋白酶H活力在腌制階段呈現(xiàn)出顯著降低的趨勢(shì)（P＜0.05），之后活力顯著增強(qiáng)至烘干階段達(dá)到最大值（與新鮮魚中活力值大小相仿），整個(gè)加工階段LS法中組織蛋白酶H和L活力大于HS法中酶的活力（P＜0.05）。李樹紅[20]在鰱魚加工過程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)NaCl含量在0～0.2 mol/L范圍內(nèi)時(shí)，組織蛋白酶B活力隨食鹽含量的增高而增強(qiáng)，大于0.2 mol/L時(shí)蛋白酶B活力受到一定的抑制。由此可見食鹽含量對(duì)組織蛋白酶影響較大，食鹽含量較低時(shí)有利于激活組織蛋白酶活力，食鹽含量較高時(shí)會(huì)抑制組織蛋白酶活力；由于HS法中食鹽含量較LS法高，所以在腌制階段LS法的組織蛋白酶活力大于HS法。而烘干階段組織蛋白酶B、L、H活力均顯著提升（P＜0.05），在烘干中后期活力達(dá)到最大值，說明烘干過程的溫度是組織蛋白酶的最適合溫度，所以活力增強(qiáng)。

2.2 藍(lán)圓鰺腌干工藝加工過程中蛋白降解情況分析對(duì)比

圖2 藍(lán)圓鰺腌干工藝加工過程中PI值變化情況Fig. 2 Changes in PI values aduring dry-salted fish processing

圖2體現(xiàn)了不同加工工藝腌干藍(lán)圓鰺加工過程中PI值的變化規(guī)律，研究人員在火腿加工過程中發(fā)現(xiàn)火腿特征風(fēng)味與肽類[21]成分及含量具有密切的相關(guān)性，部分帶有親脂性側(cè)鏈的小肽導(dǎo)致火腿呈現(xiàn)出苦味[3]，蛋白質(zhì)水解最嚴(yán)重。由圖2可見，PI值在HS法和LS法腌干藍(lán)圓鰺加工過程中變化趨勢(shì)相同：PI值隨加工的進(jìn)行同樣呈現(xiàn)出逐漸增高的趨勢(shì)。圖2中兩種加工工藝各加工階段中樣品PI值在腌制、脫鹽階段LS法大于HS法（差異不顯著，P＞0.05），烘干中期及成品中則為HS法大于LS（差異不顯著，P＞0.05），說明HS法生產(chǎn)的腌干魚制品蛋白降解程度略高于LS法制備的腌干藍(lán)圓鰺，LS法利于減輕腌干魚制品的蛋白降解程度。Careri等[5]在研究帕爾瑪火腿中發(fā)現(xiàn)，若PI值小于22說明火腿蛋白質(zhì)水解不夠，導(dǎo)致火腿缺乏應(yīng)有香氣和滋味；若PI值大于30則火腿表現(xiàn)出蛋白質(zhì)水解過度，導(dǎo)致火腿質(zhì)地過軟，呈現(xiàn)出明顯苦味或金屬后味。本研究中HS法和LS法生產(chǎn)的腌干藍(lán)圓鰺PI值分別為23.99和23.08，PI值在22～30之間，說明均不會(huì)產(chǎn)生明顯的苦味或者金屬后味。

表1 藍(lán)圓鰺不同腌干工藝加工過程中游離氨基酸變化情況分析Table1 Changes in free amino acids during dry-salted fish processing

2.3 藍(lán)圓鰺腌干工藝加工過程中游離氨基酸變化與滋味形成的分析對(duì)比

由表1可見，隨著加工進(jìn)程的不斷推進(jìn)，HS法和LS法生產(chǎn)過程中TFAA含量變化趨勢(shì)相同：腌制、脫鹽階段均出現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)（P＜0.05），主要原因是水溶性游離氨基酸隨水分逐漸流失；烘干階段TFAA含量顯著增加（P＜0.05），說明腌干咸魚中游離氨基酸主要生成于烘干階段。TFAA含量在腌制、脫鹽階段HS法＜LS法，而烘干階段HS法＞LS法。Toldra等[22]在火腿的研究中發(fā)現(xiàn)游離氨基酸主要由多肽和蛋白質(zhì)在氨肽酶的作用下水解產(chǎn)生。在腌制、脫鹽兩階段中，由于LS法中組織蛋白酶B、L活力略大于HS法中活力，使得LS法中多肽含量較高，在氨肽酶做用下產(chǎn)生較多的游離氨基酸；但烘干階段2 種組織蛋白酶活力則是HS法大于LS法，促進(jìn)了HS法中多肽的生成，使得烘干階段TFAA含量為HS法大于LS法。TFAA對(duì)腌制品的滋味影響較大，研究發(fā)現(xiàn)游離氨基酸是火腿酸味、甜味和苦味的前體物，與火腿風(fēng)味的形成具有巨大相關(guān)性[3,5,23-24]。丙氨酸能產(chǎn)生甜味[23]，苦感的產(chǎn)生與高濃度的蛋氮酸、亮氨酸和異亮氨酸有關(guān)[25]，谷氨酸和天冬氨酸具有鮮味[3]。由表1可見，兩種腌干藍(lán)圓鰺加工過程中PFAA含量百分比的變化趨勢(shì)相同，均隨著加工的進(jìn)行百分含量逐漸增高，雖然HS法加工制作的腌干藍(lán)圓鰺中TFAA含量高于LS法，但PFAA含量百分比為L(zhǎng)S法大于HS法；BFAA（與苦味前體物質(zhì)相關(guān)的氨基酸）含量百分比在HS法中主要增高階段為腌制、烘干前期，LS法主要增高階段為腌制、烘干末期，這可能與LS法中復(fù)合乳酸菌的發(fā)酵作用相關(guān)性較高有關(guān)；UFAA含量百分比在脫鹽、烘干期間均逐漸增高，特別是烘干末期，成品中UFAA含量百分比為L(zhǎng)S法大于HS法，這是由于復(fù)合乳酸菌的發(fā)酵降解產(chǎn)生較多UFAA的原因；SFAA含量百分比主要在烘干前期增加較明顯，且成品中SFAA含量百分比為L(zhǎng)S法大于HS法；由以上分析可見，LS法更有利于腌干魚滋味物質(zhì)的產(chǎn)生。

2.4 藍(lán)圓鰺腌干工藝加工過程中組織蛋白酶與蛋白降解和游離氨基酸的相關(guān)性分析

表2 藍(lán)圓鰺腌干工藝加工過程中蛋白降解與組織蛋白酶活力之間的皮爾遜相關(guān)系數(shù)Table2 Pearson’s correlation coefficients between PI and cathepsin activities during dry-salted fish processing

將2 種藍(lán)圓鰺腌干工藝加工過程中組織蛋白酶活力與PI值及游離氨基酸含量通過SPSS軟件中的皮爾遜相關(guān)系數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見表2。HS法中組織蛋白酶B與PI值、TFAA、BFAA、UFAA、SFAA、PFAA均呈現(xiàn)出正相關(guān)性，且相關(guān)性極顯著（P＜0.01），LS法中組織蛋白酶B與PI值呈現(xiàn)出極顯著正相關(guān)性（P＜0.01），TFAA、BFAA、UFAA、SFAA、PFAA均呈現(xiàn)出顯著相關(guān)性（P＜0.05），說明組織蛋白酶B在兩種腌干工藝中均發(fā)揮較大作用。HS法和LS法中組織蛋白酶L、H與PI值、BFAA、UFAA、SFAA、PFAA均呈現(xiàn)出正相關(guān)性，但相關(guān)性均不顯著（P＞0.05）；這說明腌干藍(lán)圓鰺加工過程中組織蛋白酶L、H對(duì)蛋白降解的作用較小。組織蛋白酶L在LS法中與TFAA呈現(xiàn)出顯著正相關(guān)性（P＜0.05），但HS法中正相關(guān)性不顯著（P＞0.05），組織蛋白酶H對(duì)蛋白的降解作用為L(zhǎng)S法＞HS法，由此可推測(cè)在藍(lán)圓鰺腌干過程組織蛋白酶B對(duì)蛋白降解及滋味物質(zhì)的產(chǎn)生的作用大于組織蛋白酶L和H。

火腿加工過程中蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的游離氨基酸和小分子多肽是其滋味物質(zhì)的主要組成部分，多肽一般呈苦味，親脂性殘基增強(qiáng)其苦味感。部分游離氨基酸本身具有特殊滋味，另一部分能夠通過降解反應(yīng)或美拉德反應(yīng)生成火腿的特殊風(fēng)味物質(zhì)，其中帶側(cè)鏈的化合物一般是由游離氨基酸參與形成[26]。趙改名等[27]發(fā)現(xiàn)火腿中組織蛋白酶發(fā)揮降解作用使得蛋白質(zhì)降解形成多肽，多肽再通過一系列內(nèi)源性酶類降解為游離氨基酸。Virgili等[28]發(fā)現(xiàn)Parma火腿加工過程中非蛋白氮含量與組織蛋白酶B活力相關(guān)性較大，且Garcia-Garrido等[29]在Spanish火腿加工中發(fā)現(xiàn)組織蛋白酶B＋L與非蛋白氮含量具有較大相關(guān)性，非蛋白氮含量與PI值呈正相關(guān)性，Quali等[30]研究發(fā)現(xiàn)組織蛋白酶H對(duì)肌原纖維的降解作用非常有限。綜合上述研究人員的研究結(jié)論及本實(shí)驗(yàn)中各酶與PI值及PFAA之間的關(guān)系推斷組織蛋白酶B、L在腌干藍(lán)圓鰺加工過程中蛋白降解的過程中發(fā)揮一定作用，其中組織蛋白酶B發(fā)揮主要作用。

3 結(jié) 論

2 種藍(lán)圓鰺腌干工藝均利于組織蛋白酶B、L活力的提升，且組織蛋白酶B、L活力均在烘干末期達(dá)到最大值；整個(gè)加工過程組織蛋白酶H活力是LS法大于HS法，在腌制階段組織蛋白酶H活力均顯著下降（P＜0.05），在脫鹽和烘干階段活力顯著提高，但總體活力較鮮魚中活力變化不顯著（P＞0.05）。TFAA、PFAA含量均在烘干階段顯著增加，成品中：PI值為HS法大于LS法，TFAA含量為HS法大于LS法；PFAA含量百分比為L(zhǎng)S法大于HS法。LS法能夠在減少PI值的同時(shí)提升制品中PFAA含量百分比，相對(duì)于HS法來說LS法更利于豐富制品中的滋味物質(zhì)。HS法和LS法加工過程中：組織蛋白酶B活力較組織蛋白酶L活力穩(wěn)定；在蛋白降解及游離氨基酸的生成過程中組織蛋白酶發(fā)揮的作用大小為組織蛋白酶B大于組織蛋白酶L，組織蛋白酶B對(duì)蛋白降解的作用是HS法大于LS法；組織蛋白酶H對(duì)制品中蛋白降解及游離氨基酸的生成的作用較小。

以上研究表明，可以從控制加工過程中內(nèi)源性蛋白酶類活力入手改進(jìn)傳統(tǒng)腌干魚加工工藝，通過適當(dāng)方法控制組織蛋白酶B、L活力促進(jìn)制品中PFAA含量百分比的增加，減少或者消除不適宜的產(chǎn)品風(fēng)味。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)雖然腌干魚中的組織蛋白酶B在HS法中發(fā)揮的活力作用大于LS法，使得PI值LS法小于HS法，增加了HS法中TFAA含量，但PUFA含量百分比并未增加，因此LS法由于復(fù)合乳酸菌的發(fā)酵作用更利于腌干魚營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的保存及滋味物質(zhì)的形成。LS法更符合人們對(duì)于低鹽食品的要求，此腌干工藝具有巨大的可開發(fā)空間，可以用于其他腌制肉制品中，以提升更多其他肉制品產(chǎn)品的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

[1] MARTíN L, CóRDOBA J J, ANTEQUERA T, et al. Effects of salt and temperature on proteolysis during ripening of Iberian ham[J]. Meat Science, 1998, 49(2): 145-153. DOI:10.1016/S0309-1740(97)00129-0.

[2] MOLINA I, TOLDRA F. Detection of proteolytic activity in microorganisms isolated from dry-cured ham[J]. Journal of Food Science, 1992, 56(6): 1308-1310. DOI:10.1111/j.1365-2621.1992.tb 06843.x.

[3] STEFANO S, ALESSANDRO P, MAURIZIO M, et al. Oligopeptides and free amino acids in Parma hams of known cathepsin B activity[J].Food Chemistry, 2001, 75(3): 267-273. DOI:10.1016/S0308-81 46(01)00224-2.

[4] BUSCAILHON S, MONIN G, CORNET M, et al. Time-related changes in nitrogen fractions and free amino-acids of lean tissue of french dry-cured ham[J]. Meat Science, 1994, 37(3): 449-456.

[5] CARERI M, MANGIA A, BARBIERI G, et al. Sensory property relationships to chemical data of Italian-type dry-cured ham[J].Journal of Food Science, 1993, 58(5): 968-972. DOI:10.1111/j.1365-2621.1993.tb06090.x.

[6] TOLDRE F, CERVERO M C, PART C. Porcine aminopeptidase activity as affected by curing agents[J]. Journal of Food Science, 1993,58(4): 724-726. DOI:10.1111/j.1365-2621.1993.tb09344.x.

[7] SáRRAGA C, GIL M, GARCíA-REGUEIRO J A. Comparison of calpain and cathepsin (B, L and D) activities during dry-cured ham processing from heavy and light large white pigs[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 1993, 62(1): 71-75. DOI:10.1002/jsfa.2740620110.

[8] MATILDE P, ROSER C M G, CARMEN S, et al. Development of cathepsin B, L and H activities and cystatin-like activity during two different manufacturing processes for Spanish dry-cured ham[J]. Food Chemistry, 1994, 49(1): 15-21.

[9] 高瑞昌, 蘇麗, 黃星奕, 等. 腌干鰱魚組織蛋白酶B、L活力變化的響應(yīng)面法預(yù)測(cè)研究[J]. 食品科學(xué), 2012, 33(17): 136-140.

[10] 任中陽, 吳燕燕, 李來好, 等. 腌干魚制品熱泵干燥工藝參數(shù)優(yōu)化[J]. 南方水產(chǎn)科學(xué), 2015, 11(1): 81-88. DOI:10.3969/j.issn.2095-0780.2015.01.012.

[11] 游剛, 吳燕燕, 李來好, 等. 添加復(fù)合乳酸菌再發(fā)酵對(duì)腌干魚肉微生物、亞硝酸鹽和亞硝胺的影響[J]. 南方水產(chǎn)科學(xué), 2015, 11(4): 109-115. DOI:10.3969/j.issn.2095-0780.2015.04.016.

[12] THOMAS A R, GONDOZA H, HOFFMAN L C, et al. The roles of the proteasome, and cathepsins B, L, H and D, in ostrich meat tenderisation[J]. Meat Science, 2004, 67(1): 113-120.DOI:10.1016/j.meatsci.2003.10.001.

[13] ARANISHI F, HARA K, OSATOMI K, et al. Substrate specificity of carp Cyprinus carpio cathepsin H with methylcoumarylamide substrates[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part B:Biochemistry and Molecular Biology, 1997, 116B(2): 203-208.DOI:10.1016/S0305-0491(96)00249-0.

[14] 趙改名, 周光宏, 柳艷霞, 等. 肌肉非蛋白氮和游離氨基酸在金華火腿加工過程中的變化[J]. 食品科學(xué), 2006, 27(2): 33-37.DOI:10.3321/j.issn:1002-6630.2006.02.001.

[15] 張會(huì)麗, 余翔, 張弘, 等. 鱸魚風(fēng)干成熟工藝及對(duì)蛋白質(zhì)水解和感官品質(zhì)影響[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(16): 47-51.

[16] 李敏. 臘魚腌制過程中內(nèi)源蛋白酶的變化及其對(duì)品質(zhì)的影響[D].武漢: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2014.

[17] TOLDRá F, RICO E, FLORES J. Cathepsin B, D, H and L activities in the processing of dry-cured ham[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 1993, 62(2): 157-161. DOI:10.1002/jsfa.2740620208.

[18] FLORES M, ARISTOY M C, ANTEQUERA T, et al. Effect of prefreezing hams on endogenous enzyme activity during the processing of Iberian dry-cured hams[J]. Meat Science, 2009, 82(2):241-246. DOI:10.1016/j.meatsci.2009.01.017.

[19] ZHAO G M, ZHOU G H, WANG Y L, et al. Time-related changes in cathepsin B and L activities during processing of Jinhua ham as a function of pH, salt and temperature[J]. Meat Science, 2005, 70(2):381-388. DOI:10.1016/j.meatsci.2005.02.004.

[20] 李樹紅. 鱗魚背肌組織蛋白酶B、L的純化鑒定及水解肌球蛋白的研究[D]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué), 2004.

[21] HANSEN-MLLER J, HINRICHSEN L. Evaluation of peptides generated in Italian-style dry-cured ham during processing[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1997, 45(8): 3123-3128.DOI:10.1021/jf960743x.

[22] TOLDRá F, FLORES M, SANZ Y. Dry-cared ham flavour-enzymatic generation and process influence[J]. Food Chemistry, 1997, 59(4):523-530. DOI:10.1016/S0308-8146(97)00013-7.

[23] GARCíA I, DíEZ V, ZUMALACáRREGUI J M. Changes in nitrogen fractions and free amino acids during ripening of Spanish dried beef “cecina”[J]. Journal of Muscle Foods, 1998, 9(3): 257-266.DOI:10.1111/j.1745-4573.1998.tb00659.x.

[24] TOLDRá F, ARISTOY M C, FLORES M. Contribution of muscle aminopeptidases to flavor development in dry-cured ham[J]. Food Research International, 2000, 33(3): 181-185. DOI:10.1016/S0963-9 969(00)00032-6.

[25] VIRGILI R, SCHIVAZAPPA C, PAROLARI G, et al. Proteases in fresh pork muscle and their influence on bitter taste formation in drycured ham[J]. Journal of Food Biochemistry, 1998, 22(1): 53-63.DOI:10.1111/j.1745-4514.1998.tb00230.x.

[26] SABIO E, VIDAL-ARAGON M C, BERNALTE M J, et al. Volatile compounds present in six types of dry-cured ham from south European countries[J]. Food Chemistry, 1998, 61(4): 493-503. DOI:10.1016/S0308-8146(97)00079-4.

[27] 趙改名. 肌肉蛋白水解酶在金華火腿加工過程中作用的研究[D].南京: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2004.

[28] VIRGILI R, PAROLARI G, SCHIVAZAPPA C. Sensory and texture quality of dry-cured ham as affected by endogenous cathepsin b activity and muscle composition[J]. Journal of Food Science, 1995,60(6): 1183-1186. DOI:10.1111/j.1365-2621.1995.tb04551.x.

[29] GARCIA-GARRIDO J A, QUILES-ZAFRA R, TAPIADOR J, et al. Activity of cathepsin B, D, H and L in Spanish dry-cured ham of normal and defective texture[J]. Meat Science, 2000, 56(1): 1-6.DOI:10.1016/S0309-1740(00)00005-X.

[30] OUALI A, GARREL N, OBLED A, et al. Comparative action of cathepsins D, B, H, L and of a new lysosomal cysteine proteinase on rabbit myofibrils[J]. Meat Science, 1987, 19(2): 83-100.DOI:10.1016/0309-1740(87)90014-3.