胡 波，薛 曼，李春寶，高 奉,，張 貞，申學(xué)振，張柏青，劉雨豐，鹿 鳴，劉玉杰解放軍總醫(yī)院 骨科，北京 008；北京朝陽中西醫(yī)結(jié)合急診搶救中心 骨二科，北京 000；中國科學(xué)院化學(xué)研究所分子科學(xué)國家研究中心，北京 0090；中國科學(xué)院大學(xué)，北京 0009；國家體育總局運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)研究所，北京 0006

二次諧波是一種非線性光學(xué)效應(yīng)，區(qū)別于光的反射、折射、衍射、干涉等線性光學(xué)效應(yīng)。這種非線性光學(xué)效應(yīng)是在激光問世之后才被科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)并開始研究的。1961年，F(xiàn)ranken等[1]發(fā)現(xiàn)當(dāng)激光器發(fā)射波長為694.3 nm的紅外激光穿過石英晶體時(shí)，除了紅外激光透射過晶體外，還能產(chǎn)生另一個(gè)波長為347.15 nm的紫外激光。Franken激光倍頻實(shí)驗(yàn)首次實(shí)現(xiàn)了二次諧波(second harmonic generation)現(xiàn)象。在二次諧波的產(chǎn)生過程中，當(dāng)激光強(qiáng)光照射到分子有序排列的石英晶體上，光波不再遵守線性疊加原理，而是與介質(zhì)發(fā)生相互作用，產(chǎn)生了非線性光學(xué)效應(yīng)[2]。從此，關(guān)于非線性光學(xué)的研究迅速發(fā)展起來。經(jīng)過半個(gè)多世紀(jì)的發(fā)展，二次諧波技術(shù)實(shí)現(xiàn)了巨大的飛躍，特別是二次諧波成像技術(shù)，由于其獨(dú)特的高對(duì)比度、高分辨率等成像特點(diǎn)，已經(jīng)被迅速應(yīng)用到生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，擁有巨大的應(yīng)用前景。

1 諧波成像的條件與特點(diǎn)

一般認(rèn)為，二次諧波信號(hào)的產(chǎn)生必須滿足三個(gè)條件：1)入射光強(qiáng)度必須足夠大，所以在激光誕生后才觀察到了二次諧波現(xiàn)象；2)介質(zhì)滿足相位匹配原則；3)介質(zhì)中具有非中心對(duì)稱結(jié)構(gòu)。由于在生物組織中，膠原、微絲、微管、細(xì)胞膜脂質(zhì)雙分子層等結(jié)構(gòu)都具有很好的二階非線性極化率和結(jié)構(gòu)非中心對(duì)稱性，因此能夠產(chǎn)生很強(qiáng)的二次諧波信號(hào)[3-5]。不僅如此，二次諧波成像還具有如下特點(diǎn)：1)二次諧波是生物組織的原發(fā)性信號(hào)，樣品無需染料標(biāo)記，成像過程中沒有能量吸收，從根本上消除了對(duì)樣品的光致毒問題，成為一種非侵入性的成像方法，這與雙光子熒光成像有本質(zhì)的區(qū)別[3-4,6]；2)使用近紅外的激發(fā)光，在樣品中的穿透能力強(qiáng)，對(duì)樣品的損傷小，因此可以觀察比較厚的樣品，獲得深層次的成像；3)二次諧波成像的入射光波長與激發(fā)光波長相距較遠(yuǎn)，信號(hào)不易互相干擾，提高了信噪比；4)在觀察較厚的組織標(biāo)本時(shí)，二次諧波成像減少了非焦平面雜散光所產(chǎn)生的背景干擾，提高了三維空間分辨率，并進(jìn)一步提高了信噪比[2-3,7-8]；5)由于沒有能量吸收過程，因此即使在焦平面上也沒有光毒性和光漂白性，這點(diǎn)也是區(qū)別于雙光子顯微鏡成像的最大優(yōu)勢[3,6]；6)二次諧波的產(chǎn)生是材料的二階非線性極化率所引起的，因此其信號(hào)可反映組織材料的某些結(jié)構(gòu)特性[9]；7)二次諧波對(duì)材料的結(jié)構(gòu)對(duì)稱性變化比較敏感，可為某些疾病的診斷和治療提供依據(jù)。正是基于以上特點(diǎn)，二次諧波成像技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用得以發(fā)展。

2 二次諧波成像技術(shù)在肌腱病研究中的應(yīng)用

在生物組織中，膠原、微絲、微管、細(xì)胞膜脂質(zhì)雙分子層等結(jié)構(gòu)能產(chǎn)生較強(qiáng)的二次諧波信號(hào)。因此，理論上各種組織都有利用二次諧波成像技術(shù)進(jìn)行觀察的可能性。2010年，Olivier等[10]利用二次諧波成像和三次諧波成像，觀察了斑馬魚胚胎的有絲分裂全過程，記錄下斑馬魚受精卵從一個(gè)細(xì)胞到有絲分裂10次以后的二次諧波和三次諧波圖像，包括最深部細(xì)胞的有絲分裂紡錘體的形成和512個(gè)細(xì)胞階段的整體細(xì)胞團(tuán)簇立體圖像，并記錄了每一級(jí)分裂的時(shí)間，精確到分鐘。這有力地證明了諧波成像技術(shù)的三維空間分辨率優(yōu)勢和無光毒性、光漂白性方面的安全性。2016年，Kuzmin等[11]利用背向二次諧波成像和三次諧波成像技術(shù)觀察了低分化神經(jīng)膠質(zhì)瘤的大體病理標(biāo)本，展示出腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞在二次諧波成像下有更明顯的界線。原因是二次諧波信號(hào)的產(chǎn)生與生物組織的結(jié)構(gòu)特性有關(guān)，因此可以發(fā)現(xiàn)更早期的腫瘤細(xì)胞內(nèi)蛋白分子結(jié)構(gòu)上的細(xì)微變化，同時(shí)也充分證明了背向諧波成像觀察活體、大體厚標(biāo)本的優(yōu)勢。

肌腱組織主要成分是膠原纖維，肌腱病發(fā)病率很高。但是肌腱病的研究仍然有許多問題沒有解決，包括病理、疼痛機(jī)制、病因，甚至連術(shù)語都沒有得到統(tǒng)一[12-17]。因此肌腱組織也是二次諧波成像研究中的重要對(duì)象之一[18]。1971年Fine和Hansen[19]在膠原組織中首次檢測到二次諧波信號(hào)。2011年，Abraham等[20]通過對(duì)照大鼠跟腱的二次諧波成像和雙光子熒光成像，顯示二次諧波成像擁有更高的圖像分辨率和對(duì)比度。2012年，Abraham等[21]又分別利用前向、背向二次諧波成像技術(shù)對(duì)體外模擬環(huán)境下細(xì)胞外基質(zhì)中Ⅰ型膠原的重塑進(jìn)行了三維成像定量分析，其中包括SHG信號(hào)衰減、纖維直徑、細(xì)胞尺寸、共定位輪廓、3D體積和傅立葉分析，證實(shí)了二次諧波信號(hào)與膠原結(jié)構(gòu)的強(qiáng)相關(guān)性。2014年，Bancelin等[22]利用二次諧波成像技術(shù)觀察鼠尾肌腱，并精確測得了其膠原纖維的直徑最小可達(dá)30 nm，指出二次諧波成像的分辨率比普通光學(xué)成像高15倍。2015年，Wen等[23]利用反射棱鏡使激光從兩個(gè)相互垂直的方向照射標(biāo)本，對(duì)鼠尾肌腱纖維進(jìn)行激發(fā)并進(jìn)行二次諧波成像，證實(shí)膠原纖維的蛋白分子平行、定向的排列方式，當(dāng)入射激光方向與纖維排列方向平行或垂直時(shí)，會(huì)產(chǎn)生不同強(qiáng)度的二次諧波信號(hào)，這一點(diǎn)與其他通過染色或熒光蛋白標(biāo)記后的成像方式都不同，包括雙光子激發(fā)熒光顯微鏡。作者認(rèn)為普通二次諧波成像的三維圖像是靠計(jì)算機(jī)將多個(gè)焦平面的二維圖像疊加重建出來的，不是真正的三維圖像。而上述單一入射方向的激發(fā)光產(chǎn)生的二次諧波信號(hào)可能會(huì)因?yàn)槿肷浼す夥较蚺c膠原排列方向垂直而無法產(chǎn)生較強(qiáng)的諧波信號(hào)，該現(xiàn)象容易導(dǎo)致判斷細(xì)胞外基質(zhì)中膠原蛋白的三維結(jié)構(gòu)時(shí)丟失重要信息，通過雙光子激發(fā)熒光顯微鏡進(jìn)行對(duì)比驗(yàn)證，為探索二次諧波成像特點(diǎn)及參數(shù)設(shè)置提供了重要依據(jù)。孫婭楠等[24]利用背向二次諧波成像和雙光子熒光成像技術(shù)觀察了人源膠原蛋白涂抹于小鼠表皮層后的透皮吸收程度，發(fā)現(xiàn)二次諧波成像可以更快速、更靈敏地檢測皮膚中的膠原纖維。Wu等[7]利用二次諧波成像三維空間高分辨率的特點(diǎn)，對(duì)跟腱的膠原纖維基質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，明確了膠原纖維基質(zhì)的橫向、斜向連接對(duì)跟腱的生物力學(xué)的影響。2016年，Zhao等[25]設(shè)計(jì)了一個(gè)光纖探針，嘗試將激發(fā)光源和諧波信號(hào)采集通過光纖進(jìn)行傳輸，并用這種裝置觀察了樹葉、魚鱗和鼠尾肌腱。雖然這種技術(shù)距離臨床應(yīng)用還有很多問題，但將諧波成像技術(shù)從實(shí)驗(yàn)室向臨床應(yīng)用推進(jìn)了一大步。Hase等[26]通過家兔肌腱離斷愈合的動(dòng)物模型進(jìn)行二次諧波觀察和力學(xué)測試，發(fā)現(xiàn)離斷肌腱部位膠原排列雜亂，與正常肌腱呈現(xiàn)出不同的二次諧波成像信號(hào)。并提出了采用所有像素點(diǎn)二次諧波信號(hào)強(qiáng)度的平均值和傅立葉變換的方法來對(duì)二次諧波成像進(jìn)行量化分析。這種二次諧波信號(hào)強(qiáng)度和傅立葉變換的方法曾于2010年被Fung等[27]采用，用來分析疲勞載荷下肌腱的形態(tài)學(xué)變化。Hase等[26]將大體標(biāo)本的二次諧波成像與實(shí)時(shí)生物力學(xué)測試相結(jié)合，進(jìn)一步展示了二次諧波成像無需切片、染色，在新鮮標(biāo)本上即可進(jìn)行檢測的優(yōu)勢，提出了用光纖探針技術(shù)觀測活體標(biāo)本，以及二次諧波成像運(yùn)用于臨床的重要意義。但目前為止，在腱病動(dòng)物模型的建立方面還缺少研究證據(jù)，需要進(jìn)一步研究。

3 二次諧波成像技術(shù)的展望

諧波成像技術(shù)本身也在不斷完善和改進(jìn)，在普通二次諧波成像技術(shù)的基礎(chǔ)上，衍生出了一系列新的成像技術(shù)，如快速干涉諧波成像[28-29]、調(diào)節(jié)偏振/消偏振二次諧波成像[9,30-31]等，均具有很大的發(fā)展?jié)摿?。但二次諧波成像仍需要對(duì)以下因素進(jìn)行最優(yōu)化考慮：1)脈沖激光器的輸出功率及其穩(wěn)定性；2)合適數(shù)值孔徑物鏡的選擇；3)高靈敏度探測器的選擇；4)不同脈沖激發(fā)波長的選擇；5)觀測樣品的選擇和制備方法(富含膠原、微絲、微管等具有高二階非線性和準(zhǔn)相位匹配的樣本)[32]?？傊沃C波成像技術(shù)仍是一個(gè)尚未普及的、具有較高技術(shù)的新型檢測方法。該方法對(duì)樣本的要求簡單，但對(duì)儀器設(shè)備的操作、調(diào)試和維護(hù)要求非常專業(yè)。因此，二次諧波成像技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用范圍的進(jìn)一步拓展，需要生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域和物理化學(xué)領(lǐng)域更加緊密的合作。在腱病研究方面，高效、穩(wěn)定的動(dòng)物模型的建立仍是當(dāng)務(wù)之急，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)控制上很難迫使所有的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物達(dá)到過度使用的最低標(biāo)準(zhǔn)。如何選擇合適的模型動(dòng)物及增加動(dòng)物在運(yùn)動(dòng)過程中的依從性是自主運(yùn)動(dòng)建立過度使用性肌腱病動(dòng)物模型的發(fā)展方向[33-35]。在此基礎(chǔ)上，才能利用二次諧波成像對(duì)生物組織結(jié)構(gòu)高度敏感的潛在優(yōu)勢，對(duì)腱病的發(fā)病機(jī)制做出深入研究，使其成為一種針對(duì)肌腱腱病的新型的、早期的、無創(chuàng)的診斷方法。