懷思遠(yuǎn)，褚 楚，曹 靜，趙志飛，吳 璇，冀天楠，李建雄解放軍總醫(yī)院 放射治療科，北京 00853；云南中科靈長類生物醫(yī)學(xué)重點實驗室，云南昆明 650500

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤是嬰兒和幼兒最常見的眼內(nèi)惡性腫瘤。我國每年新發(fā)小兒視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤1 100 ～ 1 500例，預(yù)后較差[1]。臨床上根據(jù)視母細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展的順序?qū)⑵浞譃?個階段：眼內(nèi)生長期、青光眼期、眼外期和全身轉(zhuǎn)移[2]。視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤通常在后兩個階段才會被發(fā)現(xiàn)，這也就意味著錯過早期治療時機而只能姑息治療。視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展與腫瘤抑制基因Rb1基因密切相關(guān)，通常是由于Rb1基因純合突變和失活引起。目前，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)和基因編輯技術(shù)構(gòu)建了嚙齒類動物、兩棲動物和人類胚胎干細(xì)胞的Rb模型[3-6]。盡管這些模型具有視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的表型，但其與人類視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤之間存在顯著差異。非人類靈長類動物(如食蟹猴)的疾病模型可以更準(zhǔn)確地模擬人類疾病，目前也已經(jīng)成功建立非人靈長類動物模型，如肌營養(yǎng)不良癥和Rett綜合征猴模型[7-9]。因此，我們選擇食蟹猴作為實驗對象，以更好地模擬人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤。近年來，基因編輯技術(shù)主要由ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9(聚簇規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列/CRISPR相關(guān)核酸酶9)系統(tǒng)組成[10-13]。在這3種系統(tǒng)中，CRISPR/Cas9最有效、最簡單且細(xì)胞毒性最少，成為基因編輯建立動物疾病模型的最佳方式。CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)是一種基于古細(xì)菌對外源性核酸侵襲的免疫應(yīng)答的新型基因編輯技術(shù)[14-15]。該技術(shù)由3種原核CRISPR免疫系統(tǒng)組成[16-17]。由于其高效率和簡單性，衍生自化膿鏈球菌Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)的哺乳動物CRISPR系統(tǒng)被廣泛使用。本研究中，我們通過CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)作為研究手段，探求食蟹猴細(xì)胞和胚胎中Rb1腫瘤抑制基因突變的影響。這也是第一次以非人靈長類作為研究對象進(jìn)行Rb1基因的編輯。

材料和方法

1 動物 選擇健康成年食蟹猴(Macaca fascicularis)用于本研究。所有動物都養(yǎng)殖于云南中科靈長類生物醫(yī)學(xué)重點實驗室。實驗所需動物都經(jīng)過國際實驗動物評估和認(rèn)可委員會(AAALAC)的評估和認(rèn)證并批準(zhǔn)可用于本實驗。

2 食蟹猴卵細(xì)胞采集 選擇5只年齡為5 ～ 8歲且月經(jīng)周期正常的健康雌性食蟹猴作為超排的卵母細(xì)胞供體，通過肌內(nèi)注射rhFSH(重組人類促卵泡激素α，GONAL-F，Merck Serono)8 d，第9天rhCG(重組人絨毛膜促性腺激素α，OVIDREL，Merck Serono)施用后32 ～ 35 h通過腹腔鏡濾泡抽吸收集卵母細(xì)胞。MⅡ(第一極體存在)卵母細(xì)胞用于進(jìn)行胞質(zhì)內(nèi)精子注射(ICSI)，受精由兩個原核的存在證實，共獲得26個單細(xì)胞胚胎。

3 食蟹猴成纖維細(xì)胞建系及培養(yǎng) 選擇健康成年食蟹猴，取其耳部組織建立成纖維細(xì)胞系，10 mm直徑培養(yǎng)皿培養(yǎng)至第5代，在含有10% FBS的DMEM中培養(yǎng)。細(xì)胞融合度達(dá)80% ～ 90%時傳代。

4 PCR擴增成纖維細(xì)胞基因組 提取食蟹猴成纖維細(xì)胞系基因組，以此為模版，設(shè)計擴增Rb1基因8號外顯子CDS區(qū)引物，進(jìn)行該區(qū)域基因片段擴增并測序。每項實驗重復(fù)3次。

5 靶片段sgRNA的設(shè)計與合成 利用GeneArtTMPrecision gRNA Synthesis Kit試劑盒，設(shè)計合成gRNA版oligo DNA引物F：TAATACGACTCACTATAGAT GGTTCACCTCGAACACCC，R：TTCTAGCTCTAAA ACGGGTGTTCGAGGTGAACCAT。體外轉(zhuǎn)錄并純化gRNA產(chǎn)物。

6 CRISPRMAXTM轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞 選擇生長狀態(tài)良好的食蟹猴成纖維細(xì)胞鋪皿于6孔板，鋪皿密度為30% ～ 40%，待細(xì)胞數(shù)量約為2×105/孔，選用試劑盒LipofectmineTMCRISPRMAXTMTransfection Reagent(Cat.no.31985)作為轉(zhuǎn)染細(xì)胞工具，Cas9-nuclease和sgRNA9(1 200 ng/μl)的混合溶液加入到靶細(xì)胞的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48 ～ 72 h，收集細(xì)胞，做下一步檢測。每項實驗重復(fù)3次。

7 T7酶切實驗檢測細(xì)胞基因組編輯結(jié)果 提取基因編輯細(xì)胞DNA，溶于0.1×TE中。設(shè)計引物包含sgRNA作用靶點，上游引物為Rb1-exon8-F：5'-TTGGGAGCAGAGTAGACGAG-3'，下游引物為Rb1-exon8-R：5'-CCAGCCTTGGTAGGGTATTT-3'。PCR反應(yīng)體系50μl(PCR反應(yīng)相關(guān)試劑購自寶生物工程有限公司，中國)。反應(yīng)條件：98℃ 5 min；(98℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s)×30 ；72℃ 10 min ；保存4℃。后用PCR純化試劑盒(Takara公司)純化PCR產(chǎn)物。取200 ng純化后的PCR產(chǎn)物在NEB Buffer 2中變性、復(fù)性后，用T7核酸內(nèi)切酶(NEB，M0302L)37℃孵育75 min，然后用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離。顯影分析。每項實驗重復(fù)3次。

8 基因編輯后食蟹猴成纖維細(xì)胞及胚胎基因組T克隆載體鏈接測序 連接反應(yīng)的準(zhǔn)備：提取Rb1基因編輯成功的細(xì)胞及胚胎基因組并擴增，產(chǎn)物純化。取純化后的PCR產(chǎn)物1μl；1 kb control 0.5 ～8μl；pTOPO-Blunt Vector 1μl；10×Enhancer 1μl；nuclease-free H2O Xμl；總體積10μl，室溫瞬時低速離心后置于冰上備用。取50 ～ 100μl感受態(tài)細(xì)胞置于室溫解凍，加入5μl連接液并加300 ～500μl LB培養(yǎng)基(不含抗生素)，37℃180 r/min振蕩培養(yǎng)10 min。取200μl混合液涂板(含氨芐青霉素50 ～ 100μg/ml)，置于37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)過夜12 h后，從板內(nèi)挑取菌落25個分別裝于收納管中振蕩培養(yǎng)后測序， 用通用M13F/M13R 引物測序來確定是否含有目的克隆。

9 Western blot檢測Rb蛋白表達(dá) 將生長狀態(tài)良好的細(xì)胞在pH 7.9，含有0.15 mol/L NaCl、1 000μmol/L PMSF、0.02 mol/L NaF、1 000μmol/L DTT、0.1%NP40和蛋白酶抑制劑混合物(Thermo)的0.025 mol/L HEPES的緩沖液中裂解并提取蛋白。加樣于上層膠(5% SDS-PAGE)，在1×電泳緩沖液，80 V電壓下濃縮。后于下層膠分離[12% SDS-PAGE(Bio-Rad)，220 mA，120 V]。5%脫脂牛奶室溫封閉，加一抗[Rb1 1∶500(554136，BD)]4℃條件下溫育過夜。第二抗體是1∶3 000的HRP連接的山羊抗小鼠和HRP連接的山羊抗兔。增強的化學(xué)發(fā)光(ECL，Sigma)用于檢測。在暗室使用Alpha View Software(ABI，USA)對帶進(jìn)行量化分析。每項實驗重復(fù)3次。

10 胚胎培養(yǎng) 將獲取的15個胚胎在含有400μl PZM-3的4孔培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱條件為37℃、5% CO2。待胚胎發(fā)育至囊胚階段，收集并凍存于液氮中。

11 單細(xì)胞胚胎的Cas9蛋白和sgRNA復(fù)合物顯微注射 11個單細(xì)胞胚胎注射Cas9蛋白(1 000 ng/μl)和sgRNA(500ng/μl)的復(fù)合物。在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行顯微注射入單細(xì)胞胚胎細(xì)胞質(zhì)中。然后將其培養(yǎng)在含有10%胎牛血清(HyClone Laboratories，SH30088.02)和90%無蛋白倉鼠胚胎培養(yǎng)基-10(HECM-10)中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待胚胎發(fā)育至4-細(xì)胞階段，終止其發(fā)育收集胚胎單個卵裂球。

12 胚胎單卵裂球基因測序 提取單卵裂球基因組PCR擴增產(chǎn)物，純化后交由碩擎生物公司行第三代測序法測序，并依結(jié)果制作基因測序峰圖。

結(jié) 果

1 基因編輯序列的確立和驗證 NCBI上查閱基因組序列，食蟹猴Rb1基因組位于其17號染色體上，全長176 042 bp，共有27個外顯子，本實驗我們選擇了8號外顯子CDS區(qū)作為基因編輯的目的片段，該片段長度為143 bp，此外顯子區(qū)序列突變與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤發(fā)生關(guān)系密切，我們對比了該段片段食蟹猴和人類基因序列組成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)完全匹配，排除SNP存在，并以此作為靶片段序列。見圖1。

2 sgRNA序列設(shè)計與合成 設(shè)計并合成了編輯上述目的片段的sgRNA，其序列為ATGGTTCACCTC GAACACCC，其PAM位點為AGG。合成的sgRNA檢測濃度為5 500 ng/μl。見圖2。

3 酶切實驗檢驗RNP轉(zhuǎn)染后成纖維細(xì)胞基因組編輯結(jié)果 提取轉(zhuǎn)染RNP細(xì)胞基因組并設(shè)計包含目的片段引物，PCR擴增后得到目的片段大小為660 bp，sgRNA位置在第210 bp，進(jìn)行酶切實驗檢測是否發(fā)生基因突變，發(fā)現(xiàn)目的片段被切割成兩部分，大小約為207 bp和442 bp，與sgRNA作用靶點位置相符，說明該sgRNA成功切開目的片段。見圖3。

4 RNP轉(zhuǎn)染細(xì)胞基因組發(fā)生突變 測定編輯后胚胎基因組序列并制作基因測序峰圖，在gRNA序列PAM位點(上圖211、212、213位點)前第4個堿基(紅色箭頭位置)開始出現(xiàn)了突變，說明了該突變是由CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)作用引起。見圖4。

5 單克隆基因測序計算敲除效率 為了檢測轉(zhuǎn)染RNP細(xì)胞的突變效率，利用T克隆載體結(jié)合單一基因組進(jìn)行單克隆基因測序，單克隆基因組測序結(jié)果為20個有效，其中發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)基因突變的序列共15個，敲除效率為75%(15/20)。見圖5。

6 Western blot檢測Rb蛋白表達(dá) 轉(zhuǎn)染RNP后被編輯的食蟹猴成纖維細(xì)胞Rb蛋白含量明顯下降甚至不表達(dá)。而未轉(zhuǎn)染組Rb蛋白表達(dá)正常。說明Rb1基因敲除會影響基因轉(zhuǎn)錄及翻譯功能。見圖6。

7 sgRNA-Cas9復(fù)合體在猴胚胎中誘導(dǎo)基因組突變 為了測試猴胚胎中sgRNA-Cas9復(fù)合物的敲除效率，利用顯微操作技術(shù)將RNP注射入11只食蟹猴的單細(xì)胞受精卵中(圖7A)。通過對比分析發(fā)現(xiàn)基因編輯的胚胎囊胚率也處于正常范圍(60%)(圖7B)。結(jié)果顯示4個(36.4%)胚胎發(fā)生基因組突變，其中2個(18.2%)胚胎為純合突變，該胚胎具有4個相同突變類型的單卵裂球，這意味著胚胎基因組在1-細(xì)胞階段被編輯；另2個胚胎(18.2%)為嵌合突變，說明基因編輯發(fā)生在1-細(xì)胞階段后(圖7C)。將受精卵放置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中至胚胎發(fā)育至4-細(xì)胞階段，觀察胚胎發(fā)育狀態(tài)良好并記錄(圖7D)。

8 脫靶檢測未見脫靶效應(yīng) 應(yīng)用ucsc基因查詢網(wǎng)站，明確預(yù)測的脫靶位點位置，共計12個相近sgRNA序列，提取Rb1 sgRNA編輯后細(xì)胞基因組，針對這12個DNA片段設(shè)計引物，完成PCR擴增及純化，并測定DNA片段序列，未見脫靶效應(yīng)。見表1。

討 論

表1 12個脫靶位點序列及基因名稱Tab.1 Sequences of 12 off-target sites and gene names

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因Rb1是一個重要的抑癌基因。Rb1的雙等位基因失活可引發(fā)人類視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤。為研究視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤以及Rb1基因失活如何介導(dǎo)腫瘤發(fā)展，有研究者使用不同的實驗對象建立了嚙齒動物、兩棲動物和人類胚胎干細(xì)胞多種腫瘤模型，發(fā)現(xiàn)當(dāng)Rb1基因在大鼠和非洲熱帶爪蟾中雙等位基因失活時可致死，Rb1、Rb11(p107)和Rb12(p130)嵌合突變體可誘導(dǎo)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤。RB1-/- hESCs引發(fā)了三側(cè)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤，并伴有顱內(nèi)神經(jīng)腫瘤[5]。目前還沒有與人類疾病過程相似的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤模型，因此我們選用食蟹猴作為基因編輯對象。

CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)是一種基于古細(xì)菌對外源核酸侵入物免疫反應(yīng)的新技術(shù)。利用CRISPR系統(tǒng)可創(chuàng)建許多動物模型，已經(jīng)用于小鼠的CRISPR/Cas9基因組編輯。Cas9可由轉(zhuǎn)染質(zhì)粒、轉(zhuǎn)染mRNA或直接轉(zhuǎn)染RNP來進(jìn)行目的細(xì)胞或胚胎的基因編輯。一些研究人員通過轉(zhuǎn)染編碼Cas9和sgRNA的質(zhì)粒構(gòu)建基因編輯模型。但其作用機制是質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄和翻譯為細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)以產(chǎn)生切割作用來敲除目的基因。另有研究人員將Cas9 mRNA和sgRNA混合物用于基因編輯，Cas9 mRNA被翻譯為蛋白質(zhì)，然后執(zhí)行其切割功能。這兩種方法都不能很好控制Cas9作用時間，易引發(fā)嵌合突變[18-19]。本研究利用了RNP轉(zhuǎn)染方法，其優(yōu)勢在于易于操作，該復(fù)合物一旦轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中或注射到胚胎中會立即發(fā)揮切割目的序列的作用，受細(xì)胞周期等其他不可控因素影響小。我們選擇單個gRNA注射條件也降低了發(fā)生嵌合突變的風(fēng)險，可以根據(jù)細(xì)胞周期和胚胎發(fā)育階段選擇注射時機，得到理想的編輯細(xì)胞和胚胎。

本研究得到基因突變的食蟹猴胚胎概率以及胚胎囊胚率，說明了單個sgRNA且以RNP形式顯微注射進(jìn)入胚胎后的CRISPR基因編輯系統(tǒng)的編輯效率，表明Rb1-sgRNA-8-1在猴胚胎中具有較高的敲除效率，這是構(gòu)建Rb猴模型的第一步，以此為參考計算移植胚胎的數(shù)量獲得模型動物，進(jìn)而利用猴子腫瘤模型來探索腫瘤發(fā)生機制，并以此確定視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的早期標(biāo)記物，通過上述結(jié)果尋求視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤治療的藥物靶點。本實驗仍有待改進(jìn)，非人靈長類胚胎獲取難度大且比較昂貴，實驗中胚胎數(shù)量較少，為了有效地獲得Rb1猴子模型，有必要提高胚胎的敲除效率，下一步我們將繼續(xù)優(yōu)化基因編輯條件并移植基因編輯胚胎。

總之，本實驗是第一次以非人靈長類為實驗對象，在胚胎水平上進(jìn)行Rb1基因編輯，采用CRISPR/Cas9技術(shù)，并利用顯微技術(shù)注射含單個sgRNA的RNP方法獲取編輯效率。我們的研究開拓了非人靈長類胚胎基因編輯的思路，優(yōu)化了基因編輯條件，明確了抑癌基因編輯后在細(xì)胞及胚胎水平上的作用效果。也為今后建立靈長類腫瘤模型提供了很好的理論基礎(chǔ)和參考。