李曉青，王利群，劉晉紅，游艷琴，周紅輝，張蔓麗，張鑫悅，盧彥平

解放軍總醫(yī)院，北京 100853 1婦產(chǎn)科；2病理科

妊娠中期以后羊水的主要來源為胎兒尿液，羊水過少主要依靠超聲檢查發(fā)現(xiàn)，診斷標(biāo)準(zhǔn)是最大羊水暗區(qū)垂直深度(maximum vertical pocket，MVP)≤2 cm。此時應(yīng)著重關(guān)注胎兒是否存在畸形可能，如腎缺如、腎發(fā)育不全、輸尿管或尿道狹窄、膀胱出口梗阻、多囊性腎病、Meckel綜合征等，以上畸形均可能導(dǎo)致尿液產(chǎn)生過少或排出受阻，最終表現(xiàn)為羊水過少。而其中常染色體隱性遺傳病是重要的原因之一[1]。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，染色體微陣列分析(Chromosomal microarray analysis，CMA)及全外顯子組檢測技術(shù)(Whole exome sequencing，WES)在遺傳病診斷中具有很大的優(yōu)勢[2-3]。2013年美國婦產(chǎn)科醫(yī)師學(xué)會(American College of Obstetricians and Gynecologists，ACOG)和美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)會(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)提 出 了基因芯片在產(chǎn)前診斷領(lǐng)域的應(yīng)用規(guī)范[4-5]，尤其是對一些臨床表型不典型、外顯率下降或多變表型遺傳性疾病，這些疾病容易給臨床醫(yī)生帶來誤導(dǎo)，使用靶向基因的panel容易產(chǎn)生陰性結(jié)果。而從技術(shù)角度看，WES為編碼變異提供全基因組范圍篩查平臺，Blue等[6]在家族性先天性心臟病的研究中證明了使用WES能更容易解決這一問題。但是WES也有其局限性，WES并不能檢測所有的潛在因果關(guān)系的基因突變型，并可能出現(xiàn)嚴(yán)重遺漏，如病理性重復(fù)擴增和大多數(shù)CNVs[7]。由于本研究中的病例均為羊水過少病例，傳統(tǒng)核型分析存在困難，采用對于染色體病篩查更全面的SNP-array平臺可以同時對染色體微缺失、微重復(fù)進(jìn)行篩查。同時采用WES技術(shù)進(jìn)行單基因病的篩查，兩種檢測手段共同應(yīng)用探究妊娠中期羊水過少患者的遺傳學(xué)病因。

對象和方法

1 研究對象 2015年9月- 2017年12月我院收治的妊娠中期羊水過少病例15例，所有病例于兩家其他醫(yī)院各行1次超聲檢查或于我院間隔1 ～ 2周行2次以上的超聲重復(fù)檢查確診，并引產(chǎn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：1)核對孕周在妊娠14 ～ 27+6周；2)超聲提示羊水MVP≤2 cm；或妊娠14 ～ 27+6周發(fā)生胎死宮內(nèi)，同時超聲提示羊水過少。排除標(biāo)準(zhǔn)：1)胎膜早破；2)孕期有毒物接觸史或有血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(angiotensin-converting enzyme inhibitors，ACEI)或血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑(angiotensinⅡreceptor blocker，ARB)類降壓藥、前列腺素合成酶抑制劑用藥史；3)孕期有感染史；4)多胎妊娠。所有家庭簽署知情同意書，均經(jīng)院倫理委員會審批。15例羊水過少引產(chǎn)(胎死宮內(nèi))病例臨床資料見表1。

2 研究方法 取胎兒大腿內(nèi)側(cè)皮膚組織1 cm2，委托貝康公司進(jìn)行基因芯片檢測，使用human cyto-12芯片和擴增、雜交試劑盒(Illumina)，參照Infinium HD Assay標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行擴增、雜交、掃描和分析，結(jié)果判讀參照DGV、CHOP database和OMIM數(shù)據(jù)庫。智因東方公司完成全外顯子檢測，外顯子區(qū)的捕獲采用羅氏NimbleGen 公司的Seq EZ Exome Enrichment Kit V2.0捕獲探針進(jìn)行人全外顯子組捕獲，覆蓋人基因組中19 119個基因的編碼區(qū)，總共捕獲區(qū)間大小是40 Mb。測序平臺使用Illumina公司的HiSeq X測序儀，測序策略為PE150，平均測序深度為100×，測序數(shù)據(jù)量≥8 G，測序質(zhì)量(Q20)≥90%，測序質(zhì)量(Q30)≥85%。

結(jié) 果

1 胎兒CMA檢測 15例均未發(fā)現(xiàn)異常。

2 胎兒WES檢測 12例中有10例未發(fā)現(xiàn)可疑致病基因，2例發(fā)現(xiàn)可疑致病基因：1例ACE基因c.1631T＞C(p.L544P)和c.3070-3071delCT(p.L1024Lfs*17)復(fù)合雜合突變，相關(guān)疾病為腎小管發(fā)育不良 (renal tubular dysgenesis，RTD)；1例ANKS6 c.2394+1G ＞ A(IVS13)、c.621(exon2)_c.622(exon2)insTGGTG復(fù)合雜合突變，相關(guān)疾病為腎消耗病16型 (nephronophthisis-16，NPHP16)。

表1 15例孕中期羊水過少患者臨床資料Tab. 1 Clinical data about 15 cases with oligohydramnios in the second trimester

圖1 ACE基因突變位點c.1631T＞C (dbSNP數(shù)據(jù)庫未收錄)，該突變?nèi)旧w位置為chr17：61561254，該突變來源于先證者之母，導(dǎo)致氨基酸改變?yōu)閜.544，L＞P，經(jīng)蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果為有害Fig. 1 ACE gene mutation c.1631T＞C is located at chr17: 61561254, which is not included in dbSNP database. The mutation comes from the mother of the proband, resulting in amino acid alteration of p.544, L＞P. The result of protein structure prediction is harmful

圖2 ACE基因c.3070-3071delCT (dbSNP數(shù)據(jù)庫未收錄)，該突變?nèi)旧w位置為chr17:61561254，該突變?yōu)橐拼a突變，來源于先證者之父，導(dǎo)致氨基酸改變?yōu)閜.L1024Lfs17，該突變?yōu)橐拼a突變，理論上序列與原來的完全不同，對所編碼蛋白質(zhì)的功能影響比較明顯Fig. 2 ACE gene c.3070-3071delCT is located at chr17:61561254, which is a frameshift mutation and it is not included in dbSNP database. It originates from the father of proband and causes amino acid change to p.L1024Lfs17. The frameshift mutation is theoretically different from the original one, and its effect on the function of the encoded protein is signif i cant

3 2例存在可疑致病基因突變病例的臨床資料ACE基因突變先證者父母連續(xù)兩次于妊娠24周左右發(fā)現(xiàn)羊水過少，最終引產(chǎn)。2011年第1次妊娠，引產(chǎn)后未行進(jìn)一步檢查。2013年第2次妊娠，24周產(chǎn)前超聲提示羊水過少，最大平面深0.9 cm，胎兒雙腎增大，實質(zhì)回聲增強，皮髓質(zhì)分界不清，未提示其他胎兒發(fā)育異常，觀察至孕29+1周仍羊水過少，于外院行引產(chǎn)術(shù)。引產(chǎn)后胎兒行尸檢，胎兒胸腹腔內(nèi)各臟器未見明顯畸形。為進(jìn)一步明確致病原因，夫妻雙方染色體核型分析，結(jié)果均正常，夫妻雙方無相關(guān)遺傳家族史，且雙方腎超聲檢查均正常。胎兒行SNP-array檢測，未發(fā)現(xiàn)變異。2015年取得胎兒DNA，并留取夫妻全血行全基因組外顯子檢測，結(jié)果先證者突變基因為ACE，突變位點為c.1631T＞C(圖1)和c.3070-3071delCT(圖2)復(fù)合雜合突變。

ANKS6基因突變先證者的父母孕26+3周于外院超聲檢查發(fā)現(xiàn)羊水過少，最大羊水池深度1.5 cm，胎兒雙腎增大就診于我院，孕27周+5 d于我院行產(chǎn)前診斷超聲：羊水過少(MVP=0.5 cm)，胎兒雙腎明顯增大，回聲增強，考慮嬰兒型多囊腎待除外。胎兒尸檢外觀未見明顯畸形，臟器解剖發(fā)現(xiàn)雙腎明顯增大，腎剖面雙腎成顆粒狀改變，鏡下病理雙腎均見大小不等的囊泡，腎皮質(zhì)層較薄，腎小球及腎小管數(shù)量均較少，腎小管和腎小球形態(tài)異常(圖3)。取胎兒組織行WES檢測結(jié)果提示先證者為ANKS6基因c.621(exon2)_c.622 (exon2)insTGGTG(圖4)和c.2394+1G＞A(IVS13)復(fù)合雜合突變(圖5)。

討 論

近年來，高通量測序技術(shù)逐步應(yīng)用于遺傳病基因檢測[8-13]，為疑難病例的診斷帶來希望。本研究中，在充分排除了母體、藥物、胎盤、臍帶等因素后，采用基因芯片技術(shù)及WES技術(shù)，15家系均未發(fā)現(xiàn)染色體結(jié)構(gòu)畸變，WES技術(shù)一次性對全外顯子組進(jìn)行序列分析，為2家系尋找到了可疑致病基因：1例ACE基因c.1631T＞C(p.L544P)和c.3070-3071delCT(p.L1024Lfs*17)復(fù)合雜合突變，涉及疾病為腎小管發(fā)育不良；1例ANKS6c.2394+1G ＞ A(IVS13)、c.621(exon2)_c.622(exon2)insTGGTG復(fù)合雜合突變，涉及疾病為腎消耗病16型。以下分別對發(fā)現(xiàn)可疑致病基因的2家系進(jìn)行病例分析。

RTD家系臨床表現(xiàn)和基因型分析符合遺傳學(xué)共分離現(xiàn)象。我們通過蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能軟件預(yù)測，以上變異會導(dǎo)致ACE基因編碼的蛋白質(zhì)發(fā)生改變，c.3070-3071delCT為框移突變，引起氨基酸改變的為p.L1024Lfs*17即第20外顯子第3 070 ～3 071位缺失堿基CT，導(dǎo)致編碼的蛋白從第1 064位氨基酸開始算起，再翻譯16個終止(包含第1 024位)，且這16個氨基酸的序列與原來的完全不同，對所編碼蛋白質(zhì)的功能影響比較明顯。然而，我們未能獲得胎兒的病理組織切片，從病理上進(jìn)一步確認(rèn)胎兒符合腎小管發(fā)育不良的診斷。

1983年Allanson等[14]報道了一孕婦2次因妊娠中期羊水過少而胎死宮內(nèi)。2個胎兒各器官大體結(jié)構(gòu)均未發(fā)現(xiàn)異常，而腎組織學(xué)病理特點為腎小管缺如、塌陷。此后，這種改變被命名為RTD。RTD患胎或患兒多于圍生期死亡，重度羊水過少是該病的征兆，是由于胎兒尿量減少導(dǎo)致的。持續(xù)性羊水過少導(dǎo)致胎兒軀體壓縮和活動受限，導(dǎo)致Potter序列綜合征，表現(xiàn)為典型的面部異常、多余皮膚、肢體定位缺陷與支氣管肺發(fā)育不良。對RTD患者進(jìn)行超聲檢查，可見腎正?；蚵杂蟹糯螅谢驘o腎實質(zhì)回聲異?；蚱に栀|(zhì)分離。產(chǎn)后初期超聲與孕期檢查結(jié)果相似，且多未見胎兒生長受限[15-16]。部分早產(chǎn)新生兒無尿，伴頑固性低血壓，多在出生后不久死于嚴(yán)重腎功能衰竭、低血壓及支氣管肺發(fā)育不良[17]，另外部分RTD新生兒還有顱骨骨化缺陷，如大囟門和寬顱縫等表現(xiàn)[18]。

2005年，Gribouval等[18]研究了來自9個家庭的16例RTD患者。這些患者均在孕16～31周由超聲發(fā)現(xiàn)羊水過少(其中2例是在妊娠28周以后發(fā)現(xiàn)羊水過少)。提取這些患兒及其父母的DNA進(jìn)行基因檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)11例患者在涉及腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)的相關(guān)基因(1q32的REN基因、1q42的AGT基因、17q23的ACE基因和3q24的AGTR1基因)存在純合或者復(fù)合雜合突變，而他們的父母是以上基因突變的攜帶者[18]?；诖?，Gribouval等指出RTD是1種常染色體隱性遺傳病，并推測胎兒無尿和腎損傷是由于RAS系統(tǒng)失活，導(dǎo)致腎長期處于低灌注狀態(tài)，引起組織學(xué)改變。此外，RTD患兒的母親孕期多有服用ACEI類藥物的經(jīng)歷[19]，這說明RTD與RAS可能存在著密不可分的聯(lián)系。2012年，Gribouval等[20]再次報道了54例RTD患者的基因檢測結(jié)果，他們來自48個無血緣關(guān)系的家庭。結(jié)果顯示，這些患者均有明確的基因位點改變，其中64.4%的家庭ACE基因存在突變位點，20%的家庭存在REN基因突變，AGT和AGTR1基因突變占15.6%。近年來，有一些RTD胎兒或新生兒的基因檢測結(jié)果報道，并報道了一些突變位點，如ACE基因c.798C＞G和c.1486C＞T突變[16,21]；2015年Richer等[22]報道了ACE基因c.820_821delAG、c.3521delG等。但目前未檢索到國內(nèi)關(guān)于RTD的報道。

RTD是一種嚴(yán)重的腎結(jié)構(gòu)紊亂，常導(dǎo)致胎死宮內(nèi)或早期新生兒死亡。而單純羊水過少可能是RTD在胎兒時期的唯一表現(xiàn)。行胎兒基因檢測和引產(chǎn)后胎兒尸檢，特別是腎組織病理學(xué)檢查，有助于明確診斷。尤其是對于多次妊娠合并羊水過少的家庭，這些檢查意義重大。

NPHP16家系臨床表現(xiàn)和基因型分析符合遺傳學(xué)共分離現(xiàn)象。突變c.621_c.622insTGGTG，在ANKS6基因的外顯子2的第621位堿基與第622位堿基之間插入了序列為TGGTG的5個堿基，該突變?yōu)橐拼a突變，引起的氨基酸改變：p.R208Wfs*5(NM_173551)，該基因編碼的氨基酸序列與原來完全不同，生物學(xué)危害性較高。而另一突變位點c.2394+1G＞A(IVS13)，為經(jīng)典剪切位點突變，該突變會改變外顯子的剪接方式，直接導(dǎo)致蛋白質(zhì)的改變，生物危害性較高。

NPHP16一般于嬰兒期或青少年期發(fā)病，發(fā)病后5 ～ 10年進(jìn)展為終末期腎病，臨床表現(xiàn)較多樣，包括多囊性腎發(fā)育不良、腎功能不全、腎增大，可合并有腎外表現(xiàn)如主動脈瓣狹窄、肥厚型心肌病、動脈導(dǎo)管未閉、完全性內(nèi)臟逆位、肺動脈狹窄、膽汁淤積、肝纖維化等。病變主要累及腎小管間質(zhì)，腎小管萎縮，伴腎小管基底膜不規(guī)則變薄，間質(zhì)纖維化，在皮髓交界處和髓質(zhì)有多發(fā)囊腫形成，患者腎功能減退，最終發(fā)展為終末期腎病[23]。該病涉及的基因為ANKS6。2013年Hoff等[24]報道來自6個家庭的8例患者的病變，其中5個家庭中有嬰兒期受累，進(jìn)行性發(fā)展為終末期腎病，且有嚴(yán)重腎外的缺陷，包括梗阻性肥厚型心肌病、主動脈瓣狹窄、肺動脈狹窄、動脈導(dǎo)管未閉、內(nèi)臟和門靜脈周圍的肝纖維化，而1個家庭則表現(xiàn)為青少年發(fā)病。在他們的研究中確定了6種不同ANKS6基因純合突變、截斷突變、剪接位點突變、錯義突變。Hoff等[24]還發(fā)現(xiàn)在動物模型中，ANKS6基因突變會引起初級纖毛的改變導(dǎo)致發(fā)育異常，因此NPHP16還是一種初級纖毛疾病，其致病機制的研究還有待進(jìn)一步揭示。本研究中的病例在胎兒期即有腎形態(tài)學(xué)的明顯異常，同時伴有羊水過少，說明腎功能嚴(yán)重異常，同時也提示本研究中檢測到的突變位點具有較高的致病性。

本次研究中采用的檢查手段為尸檢和病理，對于畸形的描述較精確，為CMA及WES數(shù)據(jù)分析提供準(zhǔn)確的臨床信息，使檢測結(jié)果更加可靠。研究發(fā)現(xiàn)染色體微缺失重復(fù)與孕中期羊水過少未見相關(guān)性，CMA不是孕中期羊水過少必需的檢查項目；妊娠中期發(fā)生羊水過少是某些遺傳性疾病的表現(xiàn)，建議進(jìn)行全外顯子檢測，幫助明確病因。

由于本研究中納入的樣本數(shù)量少，研究結(jié)果有待于進(jìn)一步擴大樣本量后得到進(jìn)一步驗證。此外本研究中發(fā)現(xiàn)的2例可疑致病位點均為國內(nèi)外首次報道，接下來我們將對此進(jìn)一步進(jìn)行蛋白和功能驗證。

綜上，染色體微缺失重復(fù)與孕中期羊水過少未見相關(guān)性，CMA不是孕中期羊水過少必需的檢查項目；部分妊娠中期羊水過少是由常染色體隱性遺傳病引起，全外顯子檢測有助于明確病因，指導(dǎo)再次妊娠。