趙 婕，杜長虹，鐘大平，范世偉，何思穎，宋 航

巨核細胞是高度分化的細胞，來源于具有雙向分化能力的巨核細胞 -紅系祖細胞（MEP）[1]。Debili等[1]在 1996 年在體外克隆血液細胞系分化實驗中，分離出一種具有兩重分化功能的巨核細胞-紅系祖細胞，開啟了人們對巨核細胞前體細胞的認識。MEP可能既來源于常見的髓系祖細胞（CMP）[2]，也可能直接來源于更為原始的短期造血干細胞（ST-HSC）[3]。從MEP成功分化為巨核細胞需要3種因素的協(xié)調(diào)激活：巨核細胞特異基因、細胞周期的變化、抑制紅系分化因子的激活。MEP向巨核紅系分化過程是差異發(fā)育學(xué)中，最為復(fù)雜但又最能體現(xiàn)生物發(fā)育之精準的例子。

巨核細胞發(fā)育過程是一種“過度肥大”的過程，包括大量細胞體積的膨大、多倍體的形成以及獨特的細胞膜結(jié)構(gòu)形成，接受多種復(fù)雜基因的調(diào)控。相反，幼紅細胞進化發(fā)育過程卻以一種“萎縮”的方式，其典型的表現(xiàn)是細胞的皺縮，幼紅細胞的細胞質(zhì)去細胞器過程，且接受高度統(tǒng)一、單一的基因調(diào)控。這種表型的分化基礎(chǔ)依賴一系列轉(zhuǎn)錄因子的參與[4]。有些因子特異作用于這兩系細胞，有些因子作用于整個血液細胞系，大部分轉(zhuǎn)錄因子具備多種作用，抑制或激活一系列目標基因，參與細胞譜系之間、細胞不同成熟階段的轉(zhuǎn)變。通過比較巨核細胞和紅細胞的啟動子/增強子的差異和人遺傳性巨核細胞生成障礙疾病遺傳基因的研究，對認識巨核細胞的發(fā)育過程有幫助。本研究重點闡述4個參與巨核細胞系的生成調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子家族及其作用機制。

1 GATA 結(jié)合因子 1（GATA-binding factor 1，GATA-1）

GATA-1是由位于X染色體短臂（Xp11.23）的GATA-1基因編碼的具有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子。GATA家族有GATA-1和GATA-2兩個成員，在紅系-巨核系分化過程中，GATA-2表達受抑制，而GATA-1表達上調(diào)[5]。GATA-2缺失小鼠體內(nèi)多能干細胞增殖受損，說明雖然GATA-2與GATA-1在結(jié)構(gòu)上和生物化學(xué)性質(zhì)上有相似，但不能替代GATA-1的特異作用，GATA-1特異性作用于巨核-紅系的分化。FOG1鋅指蛋白是GATA-1特異的輔助因子，可提高與GATA-1結(jié)合的復(fù)合物DNA結(jié)合位點的穩(wěn)定性[6]。GATA-1和FOG1共同缺失的小鼠巨核系發(fā)育不成熟，出現(xiàn)巨核細胞體積小且伴不成熟細胞胞漿[7]，說明無論GATA-1表達水平的增加或GATA-1蛋白活性增強（如與FOG1結(jié)合能力等），均有利于MEP細胞發(fā)生“肥大性”或“萎縮性”形態(tài)變化的分離，使其更容易向巨核細胞系分化。臨床研究發(fā)現(xiàn)，伯納德-血小板綜合征（Bernard-Soulier syndrome）患者體內(nèi)由于GATA結(jié)合位點缺乏或糖蛋白Ⅰbβ啟動子突變，導(dǎo)致巨核細胞減少，表達巨核細胞特異蛋白gpⅠ-Ⅸ-Ⅴ復(fù)合物的血小板減少[8]。臨床研究還發(fā)現(xiàn)，GATA-1 N端鋅指結(jié)構(gòu)的氨基酸基團存在至少4種突變[9]，其臨床表現(xiàn)也各異。如V205M基因突變會引起FOG1結(jié)合能力下降，攜帶此型突變患者會出現(xiàn)貧血伴血小板急劇下降；R216Q和R216W突變會引起GATA-1與含GATC序列的DNA結(jié)合受損；R216Q突變患者臨床上出現(xiàn)中度血小板減少伴地中海貧血；還有D218G突變導(dǎo)致的GATA-1生物學(xué)功能改變并不清楚，但D218G突變患者會出現(xiàn)嚴重的血小板減低而不伴貧血；D218Y突變引起GATA-1結(jié)構(gòu)上嚴重的改變，引起重度血小板減少和貧血?？傊?，這些基因突變證明GATA-1功能損傷更容易影響巨核細胞系的分化。

2 Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1（Runt-related transcription factor 1，RUNX1）

RUNX1由位于染色體21q22.3位點RUNX1基因編碼[10]，因其N端含有保守的runt同源結(jié)合域而得名，也稱為核結(jié)合因子（core-binding factor subunit α-2，CBFA2）或急性髓系白血病1蛋白（acute myeloid leukemia 1 protein，AML1）。Runt結(jié)構(gòu)域和RUNX1的共轉(zhuǎn)錄因子CBF β相關(guān)，共同參與造血細胞的發(fā)育編程，是人急性白血病最常見的突變靶點。RUNX1和CBF β僅在MEP向巨核細胞分化時高表達，當MEP向紅系細胞分化時未見表達。RUNX1缺失小鼠出現(xiàn)嚴重的巨核細胞成熟障礙，紅系發(fā)育稍受影響[4]。CBF β基因缺陷小鼠巨核系發(fā)育障礙，提示了核結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子在巨核細胞譜系中的重要作用。RUNX1基因突變涉及家族性血小板紊亂/急性髓系白血?。╢amilial platelet disorder/acute myeloid leukemia，F(xiàn)PD/AML）， 這是一種常染色體顯性遺傳疾病，患者臨床特征為嚴重出血，出血程度與血小板輕度減少不成比例，血小板異常表現(xiàn)在致密核顆粒減少和細胞二磷酸腺苷（ADP）表達減少[11]。血小板受膠原、腎上腺素和花生四烯酸刺激后，血小板的聚集顯著減少，機制可能是通過減少ADP表達[12]，或PKCθ激酶相關(guān)的底物磷酸化受損以及NOTCH4等調(diào)節(jié)[10，13]。

3 弗蘭德白血病整合因子1（Friend leukemia integration 1，F(xiàn)LI-1）

FLI-1屬于ETS轉(zhuǎn)錄因子家族（含有85位氨基酸的有翼螺旋-轉(zhuǎn)向-螺旋ETS結(jié)構(gòu)域），識別并結(jié)合含有5'-GGAA/T-3'序列的DNA，該序列緊鄰GATA位點。ETS家族中有3個成員：FLI-1、GABPα和TEL1，均直接作用于巨核細胞[14]。FLI-1敲除小鼠出現(xiàn)明顯出血和無效造血，可引起胚胎死亡[15]。FLI-1可使MEP趨向于分化成巨核系爆式集落形成細胞（BFU-Meg）。研究發(fā)現(xiàn)FLI-1能夠抑制紅系krueppel樣轉(zhuǎn)錄因子（erythroid krueppel-like transcription factor，EKLF）對 β-球蛋白（β-globin）及相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄激活，其機制是FLI-1通過與DNA結(jié)合，掩蓋了EKLF的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，同樣EKLF也可抑制FLI-1對GPⅨ（血小板糖蛋白Ⅸ）等巨核細胞發(fā)育關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄激活作用，兩者可互相牽制[16]。人巨核細胞生成相關(guān)的FLI-1基因缺陷是一種罕見的遺傳性疾病，稱為帕瑞斯陶瑟杰（Paris-Trousseau syndrome，PTS），該基因缺陷患者會出現(xiàn)顱骨畸形、發(fā)育延遲和多器官畸形，終身伴有輕微的出血傾向、巨大血小板減少癥，骨髓中巨核細胞小伴巨大α顆粒[17]。

4 原癌基因c-Myb

c-Myb是巨核細胞分化過程中強有力的負調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子。c-Myb突變小鼠出現(xiàn)外周血血小板增加和骨髓巨核細胞增加。c-Myb條件性敲除小鼠骨髓巨核細胞集落形成增加，伴紅系集落形成減少。c-Myb的靶基因是p300共激活因子，p300是 CREB結(jié)合蛋白（CREB binding protein,CBP）共激活因子的同源基因。c-Myb可結(jié)合p300的KIX結(jié)構(gòu)域，從而招募p300，發(fā)揮下游作用[18]。將KIX結(jié)構(gòu)域敲掉會出現(xiàn)cMyb表達的下調(diào)，外周血中血小板數(shù)量增加和骨髓巨核細胞數(shù)量增加。所以cMyb很可能在MEP分化過程中作為負調(diào)節(jié)巨核系分化的轉(zhuǎn)錄因子，抑制MEP向巨核細胞分化[19]。

5 其他轉(zhuǎn)錄因子

決定巨核細胞分化命運的不掌握在任何單一的轉(zhuǎn)錄因子或家族手上，而是多種因素共同作用。除了以上重點描述的因子，如今涌現(xiàn)出大量的如GFI1B、ETV6、EVI1和HOXA11等新的轉(zhuǎn)錄因子為大家所認識。巨核細胞系發(fā)育過程中至少存在3種以上的轉(zhuǎn)錄因子的統(tǒng)一調(diào)節(jié)，如GATA-1和RUNX1共缺陷小鼠存在嚴重的巨核細胞異常（細胞核多倍體消失，克隆形成能力增加，病態(tài)增殖和分界膜缺陷等）。研究發(fā)現(xiàn)，造成此現(xiàn)象的原因除了GATA-1和RUNX1存在物理性的相互作用和功能合作外，還有CMPL、GPⅠbα、JAK2和GPⅡb等多種基因協(xié)同參與巨核細胞的分化調(diào)控[20]。而Fossett等[21]研究果蠅體內(nèi)造血細胞發(fā)育時，也發(fā)現(xiàn)這種基因交叉性協(xié)作的存在，說明這種基因協(xié)作在生物進化過程中是高度保守的。FLI-1/GABP復(fù)合物與GATA-1/RUNX1復(fù)合物也存在共同的靶基因——C-MPL、GPⅠbα、JAK2和GPⅡb。 生物化學(xué)分析曾證實，GATA-1與FLI-1存在相互作用。有趣的是，F(xiàn)LI-1和GABPα能通過促進FOG1/GATA-1復(fù)合物的形成激活GPⅡb增強子，而與FLI-1同屬ETS家族的另外一個成員PU.1卻沒有此作用[6]。因此，F(xiàn)OG1是作為GATA-1的共抑制子或共激活因子都取決于GATA-1相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子和增強子。Starck等[16]研究者在巨核細胞復(fù)合物中證明了GATA-1與FLI-1相互作用，在紅細胞復(fù)合物中證明了GATA-1與EKLF相互作用。而FLI-1與EKLF可以直接相互作用，也存在競爭抑制作用。與EKLF相互作用可以讓FLI-1暴露于DNA結(jié)合位點，引起特定抑制子的招募。這個研究證明了3種不同轉(zhuǎn)錄因子一起協(xié)同作用于巨核細胞和紅系的分化過程。

綜上所述，巨核細胞調(diào)控相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子以類似“二進制”特點發(fā)揮調(diào)控作用。GATA-1作用應(yīng)該是巨核細胞生成或是紅系生成的重要開關(guān)環(huán)節(jié)，GATA-1/FOG1復(fù)合物是巨核-紅系共同激活因子，F(xiàn)LI-1和EKLF則分別是巨核系和紅系特異性譜系選擇因子[16]。當巨核系分化時，F(xiàn)LI-1的DNA結(jié)合域暴露，通過與GATA-1/FOG1生成復(fù)合物（GATA-1/FOG1/FLI-1），MEP分化成巨核細胞，同時抑制與紅系生成復(fù)合物EKLF的DNA結(jié)合域結(jié)合，反之亦然。目前對巨核紅系譜系選擇因子的調(diào)控機制并不完全清楚，當巨核細胞選擇性轉(zhuǎn)錄因子的優(yōu)勢上調(diào)，同時伴隨紅系特異性轉(zhuǎn)錄因子的下調(diào)，以及共同紅系-巨核系轉(zhuǎn)錄因子的正常表達均協(xié)同時，才能正常地開始巨核細胞的分化，這個復(fù)雜的調(diào)控機制需要更全面系統(tǒng)地的對調(diào)節(jié)因子的生物學(xué)功能和信號通路進行研究。

【參考文獻】

[1]Debili N,Coulombel L,Croisille L,et al.Characterization of a bipotenterythro-megakaryocytic progenitor in human bone marrow[J].Blood,1996,88(4):1284-1296.

[2]Akashi K,Traver D,Miyamoto T,et al.A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages[J].Nature,2000,404(6774):193-197.

[3]Yang L,Bryder D,Adolfsson J,et al.Identification of Lin(-)Sca1(+)kit(+)CD34(+)Flt3-short-term hematopoietic stem cells capable of rapidly reconstituting and rescuing myeloablated transplant recipients[J].Blood,2005,105(7):2717-2723.

[4]Behrens K,Triviai I,Schwieger M,et al.Runx1 downregulates stem cell and megakaryocytic transcription programs that support niche interactions[J].Blood,2016,127(26):3369-3381.

[5]Fujiwara T.GATA transcription factors:Basic principles and related human disorders[J].Tohoku J Exp Med,2017,242(2):83-91.

[6]Fujiwara T,Sasaki K,Saito K,et al.Forced FOG1 expression in erythroleukemia cells:induction of erythroid genes and repression of myelo-lymphoid transcription factor PU.1[J].Biochem Biophys Res Commun,2017,485(2):380-387.

[7]Stachura DL,Chou ST,Weiss,et al.Early block to erythromegakaryocytic development conferred by loss of transcription factor GATA-1[J].Blood,2006,107(1):87-97.

[8]Ludlow LB,Schick BP,Budarf ML,et al.Identification of a mutation in a GATA binding site of the platelet glycoprotein Ibbeta promoter resulting in the Bernard-Soulier syndrome[J].J Biol Chem,1996,271(36):22076-22080.

[9]Crispino JD,Horwitz MS.GATA factor mutations in hematologic disease[J].Blood,2017,129(15):2103-2110.

[10]Li Y,Jin C,Bai H,et al.Human NOTCH4 is a key target of RUNX1 in megakaryocytic differentiation[J].Blood,2017.

[11]SakuraiM,Kunimoto H,Watanabe N,etal.Impaired hematopoietic differentiation of RUNX1-mutated induced pluripotentstem cellsderived from FPD/AML patients[J].Leukemia,2014,28(12):2344-2354.

[12]Ho CY,Otterud B,Legare RD,et al.Linkage of a familial platelet disorder with a propensity to develop myeloid malignancies to human chromosome 21q22.1-22.2[J].Blood,1996,87(12):5218-5224.

[13]Sun L,Mao G,Rao AK.Association of CBFA2 mutation with decreased platelet PKC-theta and impaired receptor-mediated activation of GPIIb-IIIa and pleckstrin phosphorylation:proteins regulated by CBFA2 play a role in GPIIb-IIIa activation[J].Blood,2004,103(3):948-954.

[14]Pang L,Xue HH,Szalai G,et al.Maturation stage-specific regulation of megakaryopoiesis by pointed-domain Ets proteins[J].Blood,2006,108(7):2198-2206.

[15]Hart A,Melet F,Grossfeld P,et al.Fli-1 is required for murine vascular and megakaryocytic development and is hemizygously deleted in patients with thrombocytopenia [J].Immunity,2000,13(2):167-177.

[16]Starck J,Cohet N,Gonnet C,et al.Functional cross-antagonism between transcription factors FLI-1 and EKLF[J].Mol Cell Biol,2003,23(4):1390-1402.

[17]Falet H.Singling out FLI1 in Paris-Trousseau syndrome[J].Blood,2017,129(26):3399-3401.

[18]Shammas SL,Travis AJ,Clarke J.Remarkably fast coupled folding and binding of the intrinsically disordered transactivation domain of cMyb to CBP KIX[J].J Phys Chem B,2013,117(42):13346-13356.

[19]Mukai HY,Motohashi H,Ohneda O,et al.Transgene insertion in proximity to the c-myb gene disrupts erythroid-megakaryocytic lineage bifurcation[J].Mol Cell Biol,2006,26(21):7953-7965.

[20]Xu G,Kanezaki R,Toki T,et al.Physical association of the patient-specific GATA1 mutants with RUNX1 in acute megakaryoblastic leukemia accompanying Down syndrome[J].Leukemia,2006,20(6):1002-1008.

[21]Fossett N,Schulz RA.Functional conservation of hematopoietic factors in Drosophila and vertebrates[J].Differentiation,2001,69(2-3):83-90.