劉曉玲，王 芳，趙華路，余 佳

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點實驗室， 北京 100005)

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研究論文

microRNA- 144～451基因簇促進(jìn)紅系分化

劉曉玲，王 芳，趙華路，余 佳*

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點實驗室， 北京 100005)

目的探索microRNA- 144～451基因簇在紅系分化過程中的功能及調(diào)控機(jī)制。方法用real-time PCR法檢測microRNA- 144和microRNA- 451的表達(dá)；用ChIP結(jié)合real-time PCR的方法檢測GATA-1和EKLF在microRNA- 144～451基因簇上游的結(jié)合及調(diào)控；使用microRNA- 144和microRNA- 451模擬物轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞，并用聯(lián)苯胺染色和real-time PCR方法檢測K562細(xì)胞向紅系分化；用Western blot方法檢測紅系分化抑制因子GATA- 2表達(dá)。結(jié)果microRNA- 144和microRNA- 451在K562細(xì)胞紅系分化過程中呈現(xiàn)表達(dá)逐漸上升趨勢；轉(zhuǎn)錄因子GATA- 1和EKLF可以結(jié)合在microRNA- 144～451基因簇并激活microRNA- 144或microRNA- 451的表達(dá)；在K562細(xì)胞中過表達(dá)microRNA- 144或microRNA- 451均可促進(jìn)hemin誘導(dǎo)的紅系分化；另一方面，microRNA- 144和microRNA- 451可以通過抑制GATA- 2的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞向紅系分化。結(jié)論microRNA- 144～451基因簇在紅系分化過程中受到GATA- 1和EKLF的激活調(diào)控，同時通過抑制GATA- 2的表達(dá)促進(jìn)紅系發(fā)育成熟。

microRNA- 144；microRNA- 451；GATA- 1；EKLF；GATA- 2

造血發(fā)生是貫穿人一生的生命活動，正常人體血細(xì)胞維持?jǐn)?shù)量和功能相對恒定，即衰老、死亡的細(xì)胞不斷地被新生的細(xì)胞所取代。一個正常成年人每天約有1011～1012個新的血細(xì)胞生成，同樣也有相近數(shù)量的血細(xì)胞衰老死亡[1- 2]。紅系分化是骨髓多能干細(xì)胞經(jīng)歷一系列細(xì)胞增殖和分化事件最終產(chǎn)生成熟紅細(xì)胞的過程，其中涉及復(fù)雜而精密的基因表達(dá)調(diào)控。microRNA(miRNA)是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類具有調(diào)控功能的內(nèi)源性小分子非編碼RNA。目前研究已充分證實miRNA能通過抑制蛋白質(zhì)編碼基因的表達(dá)，參與眾多的生物學(xué)過程，包括細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞分化和發(fā)育等。microRNA- 144～451(miR- 144～451)是一個高度保守且在紅系造血發(fā)育中特異表達(dá)的miRNA基因簇。已有研究發(fā)現(xiàn)，該基因簇成員miR- 451在模式生物斑馬魚和小鼠的紅細(xì)胞發(fā)育中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[3- 5]。但是，關(guān)于整個miR- 144～451基因簇在人體紅系發(fā)育中的功能和機(jī)制還未見報道。本研究初步探索miR- 144～451基因簇在造血紅系發(fā)育中的功能和作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究miRNA的生物學(xué)特性以及在造血發(fā)生中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)，RNA提取試劑盒Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和pcDNA3.1表達(dá)質(zhì)粒(Invitrogen公司)，實時定量PCR試劑盒(TaKaRa公司)，EZ-ChIP kit (Millipore公司)，GATA- 1抗體 (ab11963，Abcam公司), EKLF抗體 (sc- 14034，Santa Cruz公司)， miRNA模擬物(mimics)、小干擾RNA(siRNA)分子和轉(zhuǎn)染試劑Dharmacon FECT1(Dharmacon公司),細(xì)胞系:人慢性髓系白血病細(xì)胞K562(基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點實驗室保存)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染:參照文獻(xiàn)[6]。

1.2.2 實時定量PCR:按照說明書，用Trizol提取總RNA，紫外分光光度計測定RNA純度和濃度。mRNA反轉(zhuǎn)錄采用oligo(dT18)為引物合成第一鏈cDNA。用SYBR? Premix Ex TaqTMkit試劑盒完成real-time PCR。mRNA定量檢測采用內(nèi)源性的GAPDH作為內(nèi)參，miRNA定量檢測采用內(nèi)源性的U6 snRNA作為內(nèi)參。has-miR- 144成熟序列：5′-U ACAGUAUAGAUGAUGUACU-3′，反轉(zhuǎn)錄引物：5′-GT CGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGA TACGACAGTACA-3′，上游引物：5′-GGCCGCGTAC AGTATAGATGA-3′，下游引物：5′-GTGCAGGGTCCG AGGT-3′; has-miR- 451成熟序列：5′-AAACCGUU ACCAUUACUGAGUU-3′，反轉(zhuǎn)錄引物：5′-GTCGTA TCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACG ACAACTCA-3′，上游引物：5′-GGCGAAACCGTTACC ATTAC-3′，下游引物： 5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′;U6 snRNA上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCAC ATATACT-3′，下游引物：5′-ACGCTTCACGAATTTG CGTGTC-3′; CD235a上游引物：5′-ACAACTTGCCC ATCATTTCTCTG-3′,下游引物：5′-ACAACTTGCCC ATCATTTCTCTG-3′; Gamma-globin上游引物：5′-GCAGCTTGTCACAGTGCAGTTC-3′，下游引物：5′-TGGCAAGAAGGTGCTGACTTC-3′; GAPDH上游引物：5′-TCAACGACCACTTTGTCAAGCTCA-3′，下游引物：5′-GCTGGTGGTCCAGGGGTCTTACT-3′; EKLF基序#1上游引物：5′-AAGGTTCAGGGAGGAAGTG CTT-3′,下游引物：5′-TGAAGGATCTTGTGAGGCAG GT-3′; EKLF基序#2上游引物：5′-TTGAGGGAC AGATCCT-3′,下游引物：5′-AATGATGCAGAAGGTT CC-3′; GATA- 1 基序#1上游引物：5′-AATTCTCTG TCTCAGCCTCCTGA-3′，下游引物：5′-GGTGTATCA CGAGGTCTGGAGTT-3′; GATA- 1 基序#2上游引物：5′-AGGAAGAGTATTAACTGCC-3′，下游引物：5′-AAGGCCTCTGCTGTTTAG-3′; GATA- 1 基序#3上游引物：5′-GCCATGCTTCCTGTGCC-3′，下游引物：5′-CCGGACTAGTACATCATC-3′。

1.2.3 ChIP:K562 細(xì)胞用hemin誘導(dǎo)48 h后，參照EZ-ChIP kit 試劑盒說明書完成ChIP。并用定量PCR檢測。

1.2.4 聯(lián)苯胺染色: 參照文獻(xiàn)[6]。

1.2.5 Western blot:細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗2次，加入RIPA 細(xì)胞裂解液， 冰浴30 min，4 ℃ 10 000 r/min離心10 min，收集上清，BCA法測定蛋白濃度。取25 g細(xì)胞總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后，5%脫脂奶粉封閉，1∶500稀釋的抗GATA- 1和GATA-2， 4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后加二抗辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG，37 ℃溫育2 h，洗膜后加入ECL試劑，在X線片上曝光，顯影，定影?？贵w洗脫液洗脫后，進(jìn)行第二次雜交，使用抗GAPDH抗體，操作同上。

2 結(jié)果

2.1 miR- 144～451基因簇在K562細(xì)胞紅系分化過程中的表達(dá)檢測

在誘導(dǎo)分化過程中，miR- 144(圖1A)和miR- 451(圖1B)都呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢。

2.2 轉(zhuǎn)錄因子GATA- 1和EKLF結(jié)合于miR- 144～451基因簇上游并激活其表達(dá)

預(yù)測紅系分化重要轉(zhuǎn)錄因子GATA- 1和EKLF分別與miR- 144～451基因簇上游的3個和2個保守位點相結(jié)合(圖2A)。結(jié)果證明GATA- 1和EKLF均能夠與上述位點發(fā)生結(jié)合(圖2B)。在K562細(xì)胞中過表達(dá)GATA- 1或EKLF能夠激活miR- 144和miR- 451的表達(dá)(P<0.05)；相反地，抑制內(nèi)源性GATA- 1或EKLF表達(dá)時則使miR- 144和miR- 451的水平顯著降低(P<0.05)(圖2C)。

A.expression level of miR- 144 during erythroid differentiation of K562 cells; B.expression level of miR- 451 during erythroid differentiation of K562 cells

圖1 Real-time PCR檢測miR- 144和miR- 451在K562細(xì)胞紅系分化過程中的表達(dá)

Fig 1 Expression level of miR- 144 and miR- 451 during erythroid differentiation of K562 cells detected by real-time PCR

A.the representation of GATA- 1 and EKLF binding sites upstream of miR- 144～451 gene cluster; B.ChIP-PCR results of GATA- 1 and EKLF in K562 cells; C.expression level of miR- 144 and miR- 451 in K562 cells either with GATA- 1/ EKLF overexpression or inhibition;*P<0.05 compared with pcDNA3.1 or si-control group

圖2 GATA- 1和EKLF在miR- 144～451基因簇上游的結(jié)合及調(diào)控

Fig 2 The occupancy and regulation of GATA- 1 and EKLF upstream of miR- 144～451 gene cluster

2.3 過表達(dá)miR- 144～451促進(jìn)K562細(xì)胞紅系分化標(biāo)記基因的表達(dá)

miR- 144或miR- 451可分別實現(xiàn)20倍或30倍的過表達(dá)效果(P<0.01)(圖3A)。聯(lián)苯胺染色顯示過表達(dá)miR- 144或miR- 451的K562與對照相比，聯(lián)苯胺陽性細(xì)胞比例顯著增加(24、48、72 h均P<0.05)(圖3B，C)。另一方面，real-time PCR檢測也顯示，過表達(dá)miR- 144或miR- 451的K562細(xì)胞與對照相比，gamma-globin(24、48、72 h,均P<0.05)和CD235a(24和72 h，均P<0.05)的表達(dá)水平顯著升高(圖3D)。

2.4 miR- 144～451通過抑制GATA- 2的表達(dá)抑制K562細(xì)胞向紅系分化

過表達(dá)miR- 144或miR- 451可以顯著抑制K562細(xì)胞內(nèi)源性GATA- 2的表達(dá)(P<0.05)，但其對GATA- 2 mRNA的影響并不大(圖4)。

3 討論

紅細(xì)胞是人類和其他脊椎動物血液中一種重要的血液細(xì)胞，血液中的紅細(xì)胞過少或過多都會造成疾病，但調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成的詳細(xì)分子機(jī)制仍未闡明。miR- 144～451基因簇定位于人體的17號染色體，已有研究指出，miR- 451在小鼠和斑馬魚的成熟紅細(xì)胞內(nèi)大量存在，miR- 451基因敲除的小鼠幾乎沒有成熟紅細(xì)胞的產(chǎn)生[3- 5]。但關(guān)于完整miR- 144～451基因簇及其在人紅系發(fā)育中的功能還未見報道。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR- 144～451基因簇的兩個成員miR- 144和miR- 451均在K562細(xì)胞紅系分化過程呈現(xiàn)逐漸上升趨勢。同時，在miR- 144～451基因簇上游鑒定了紅系分化重要轉(zhuǎn)錄因子GATA- 1和EKLF的保守結(jié)合位點，并通過表達(dá)檢測證實了GATA- 1和EKLF可以激活miR- 144和miR- 451的表達(dá)。后續(xù)的功能試驗也證實在K562細(xì)胞中過表達(dá)miR- 144或miR- 451后，表現(xiàn)為促進(jìn)其向紅系的分化成熟。

A.expression level of miR- 144 and miR- 451 in K562 cells treated with scramble or miRNA mimic; B.percentage of benzidine-positive cells in K562 cells treated with scramble or miRNA mimic; C.representative benzidine staining in K562 cells treated with scramble or miRNA mimic(×400); D.expression level of gamma-globin and CD235a in K562 cells treated with Scramble or miRNA mimic;*P<0.05，**P<0.01 compared with control group

圖3 過表達(dá)miR- 144或miR- 451對K562細(xì)胞紅系分化的影響

Fig 3 The influence of over-expression of miR- 144 or miR- 451 on erythroid differentiation of K562 cells

A.Western blot of GATA- 2 in K562 cells treated with scramble or miRNA mimic; B.real-time of GATA- 2 mRNA in K562 cells treated with scramble or miRNA mimic; *P<0.05 compared with control group圖4 miR- 144和miR- 451在K562細(xì)胞中抑制GATA- 2的表達(dá)Fig 4 Inhibition of GATA- 2 by miR- 144 and miR- 451 in K562 cells

GATA- 2 與GATA- 1同屬于GATA轉(zhuǎn)錄因子家族，其中GATA- 1是正常紅系定向造血的關(guān)鍵，在紅系細(xì)胞中高表達(dá)[7]；而GATA- 2則表達(dá)于造血干/祖細(xì)胞，在造血干細(xì)胞自我更新方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[8]。已有研究證明，在造血干細(xì)胞向紅系分化成熟過程中，細(xì)胞內(nèi)GATA- 2的表達(dá)逐漸降低，因而過表達(dá)及活化GATA- 2可以抑制正常的造血紅細(xì)胞分化[9]。本研究在K562細(xì)胞中，通過Western blot確定了miR- 144和miR- 451對GATA- 2的調(diào)控作用，提示miR- 144和miR- 451很可能通過抑制了GATA- 2的表達(dá)促進(jìn)紅系分化發(fā)育。該研究為進(jìn)一步闡明miRNA 在造血紅系分化中的調(diào)控機(jī)制提供新的線索，并為相關(guān)疾病的分子靶向治療及預(yù)后評估提供新的思路。

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MicroRNA- 144～451 gene cluster promotes erythroid differentiation

LIU Xiao-ling, WANG Fang, ZHAO Hua-lu, YU Jia*

(State Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, CAMS & PUMC, Beijing 100005,China)

Objective To study the roles of microRNA- 144～451 gene cluster during erythroid differentiation of K562 cells. Methods The expression of microRNA- 144 and microRNA- 451 during K562 erythroid differentiation was detected by quantitative RT-PCR. The occupancy and regulation of transcription factors GATA- 1 and EKLF on microRNA- 144～451 gene was investigated by chromatin immunoprecipitation (ChIP) and quantitative PCR. K562 cells were transfected with the microRNA- 144 or microRNA- 451 mimics, respectively. The effects of over-expression of microRNA- 144 or microRNA- 451 on erythroid differentiation were examined by benzidine staining and quantitative RT-PCR. Western blot was performed to detect the level of erythroid antagonist GATA- 2 upon miRNA over-expression. Results microRNA- 144 and microRNA- 451 were up-regulated during K562 erythroid differentiation. Erythroid transcription factors GATA- 1 and EKLF reside and activate microRNA- 144～451 gene expression. Over-expression of microRNA- 144 or microRNA- 451 in K562 cells accelerates its erythroid differentiation. GATA- 2 was inhibited by microRNA- 144 and microRNA- 451 in erythroid cells. Conclusions The microRNA- 144～451 gene cluster is activated by GATA- 1 and EKLF and then regulates erythroid differentiation of K562 cells via repressing GATA- 2.

microRNA- 144；microRNA- 451；GATA- 1；EKLF；GATA- 2

2015- 03- 19

2015- 04- 15

國家自然科學(xué)基金(31471227)

1001-6325(2015)06-0744-05

Q254

A

*通信作者(corresponding author)：j-yu@ibms.pumc.edu.cn