徐志榮， 魏賽金

(江西農(nóng)業(yè)大學生物科學與工程學院/江西省農(nóng)業(yè)微生物資源開發(fā)與利用工程實驗室，江西南昌 330045)

南方紅豆杉(Taxuschinensisvar.mairer)別稱紫杉，為紅豆杉科(Taxaceae)紅豆杉屬(Taxus)植物，其樹皮中含有的紫杉醇是一種二萜類物質(zhì)，對治療肺癌、卵巢癌等有特定效果[1]。紫杉醇是一種植物次生代謝產(chǎn)物，以其高效、低毒及獨特的抗癌機制得到了人們的青睞。紫杉醇主要是從紅豆杉科紅豆杉屬植物的樹皮中分離、純化得到的，然而其天然資源極其有限，藥源嚴重短缺[2]。

紅豆杉細胞懸浮培養(yǎng)法是解決紫杉醇藥源緊缺的一種很有前途的方法。培養(yǎng)過程中利用生物或非生物誘導處理細胞株，可以有效地促進紅豆杉細胞合成紫杉醇。目前，誘導已經(jīng)成為植物細胞和組織培養(yǎng)中提高次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)量的最有效的方法之一[3]，不僅是植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝物的重要手段，而且在縮短工藝時間、提高容器最大利用率方面的作用也非常明顯[4]。然而，細胞次生代謝強度受到多種環(huán)境因素的影響，其中碳源是重要的一方面。培養(yǎng)基中的蔗糖大部分被降解成葡萄糖和果糖，蔗糖、葡萄糖和果糖的消耗和吸收呈現(xiàn)波動性，其中葡萄糖有利于細胞的前期生長以獲得大量的生物量，果糖有利于細胞培養(yǎng)后期紫杉烷類化合物的合成[5]。前期研究表明，真菌誘導子在懸浮培養(yǎng)南方紅豆杉細胞生產(chǎn)紫杉醇中具有良好的誘導效果。為了在反應(yīng)器中提高外源真菌誘導子的誘導效應(yīng)，本試驗通過果糖補料對南方紅豆杉細胞懸浮培養(yǎng)體系中生理狀態(tài)變化的研究，探索紅豆杉細胞放大培養(yǎng)的有效調(diào)控手段。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

紅豆杉愈傷組織：以南方紅豆杉一年生枝條為外植體誘導獲得，傳至5代以上。真菌DF：為筆者所在實驗室自行分離保存的真菌。

1.2 試驗方法

1.2.1 細胞種子液的制備 將愈傷組織接種于含有新鮮B5液體培養(yǎng)基[6]的三角瓶中，細胞接種量為5 g/瓶，裝液量為50 mL/500 mL，接種量為10%(質(zhì)量分數(shù))，于(24±1) ℃、120 r/min、黑暗條件下振蕩培養(yǎng)7 d，作為細胞種子液。

1.2.2 真菌誘導子的制備 參照蘭文智等的酸解法制備真菌誘導子[7]。收集真菌DF菌體于研缽中，充分研磨，加適量水并調(diào)節(jié)pH值至2.0，于121 ℃高壓滅菌1 h，過濾收集濾液并調(diào)節(jié)pH值至5.8，即為誘導子。誘導子濃度以總糖含量計算，總糖含量以葡萄糖為標準，采用蒽酮-硫酸比色法[8]測定。

1.2.3 5 L反應(yīng)器培養(yǎng)體系 采用5 L機械攪拌氣升式玻璃反應(yīng)器(上海百侖生物科技有限公司)，裝2.0 L B5液體培養(yǎng)基(含0.8 mL/L泡敵)，接入細胞種子液，接種量為10%(體積分數(shù))，反應(yīng)器培養(yǎng)溫度條件為(24±1) ℃，攪拌轉(zhuǎn)速為 60 r/min，通氣量為1 L/min。在細胞培養(yǎng)8 d時加入10%果糖培養(yǎng)基(體積分數(shù)，將蔗糖換成等質(zhì)量果糖，其他成分與B5液體培養(yǎng)基相同)和質(zhì)量濃度為100 μg/mL的真菌誘導子，以只添加質(zhì)量濃度為100 μg/mL的真菌誘導子為對照，每天取樣檢測。

1.3 項目測定

1.3.1 細胞活力的測定 用2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)法[9]測定細胞活力。抽濾除去培養(yǎng)基，取0.1 g紅豆杉細胞，加5.0 mL 0.2%TTC溶液(用0.1 mol/L pH值=7.0的磷酸緩沖液配制)，于24 ℃黑暗放置24 h，離心去上清，加入5 mL蒸餾水洗滌細胞2次后加入5 mL 95%乙醇，置于 60 ℃ 水浴中30 min，靜置于室溫下至細胞完全無色。取上清液，于485 nm處測吸光度，用吸光度表示細胞活力。

1.3.2 培養(yǎng)液pH值的測定 取濾液，用PHS-2型精密酸度計測定pH值。

1.3.3 胞外蛋白含量的測定 采用考馬斯亮藍法[10]測定。取1 mL濾液，加入5 mL考馬斯亮藍G-250溶液，混勻，放置2 min后，在595 nm下檢測吸光度。以牛血清白蛋白為標準品繪制標準曲線：y=1.119 9x-0.079 2，r2=0.996 7。

1.3.4 胞外總酚含量的檢測 參照文獻[11-12]測定胞外總酚含量。取5 mL濾液，加入10 mL乙酸乙酯萃取2 h，烘干后加1 mL 95%乙醇重新溶解，與1 mL Folin-Ciocalteu試劑(使用時稀釋10倍)混合，于40 ℃下水浴10 min，再加入 0.4 mL 7.5% Na2CO3溶液和5 mL蒸餾水，充分混勻，于 765 nm 下檢測吸光度。以沒食子酸為標準品繪制標準曲線：y=0.087 6x+0.000 6，r2=0.997 1

1.3.5 多酚氧化酶(PPO)樣品制備及活性(鮮質(zhì)量)測定 參照張月玲等的方法[13]，取0.1 g固體細胞于預冷的研缽中，加5 mL 0.05mol/L磷酸緩沖液(pH值為6.8)，在冰浴下研磨成勻漿，于4 ℃、4 000 r/min離心5 min，上清液即為粗酶液。在反應(yīng)管中加入3.8 mL 0.05 mol/L pH值為6.8的磷酸緩沖液、1 mL 0.1 mol/L鄰苯二酚、0.2 mL粗酶液，于35 ℃恒溫水浴保溫20 min，迅速冰浴，以磷酸緩沖液作為對照，在 398 nm 處測定吸光度。以1 min內(nèi)398 nm處的吸光度變化0.01定義為1個PPO活性單位(U)。

1.3.6 紫杉醇的提取及測定 紫杉醇的提取及測定參照趙繼鵬等的方法[6]。將固體細胞于45 ℃烘干至恒質(zhì)量，充分研磨。準確稱取100 mg干燥后的細胞，加2 mL甲醇，超聲提取30 min，5 000 r/min離心5 min，取上清液，重復提取2次。合并上清液，于45 ℃烘干，浸膏加入4 mL雙蒸水后用4 mL二氯甲烷萃取2次，合并二氯甲烷層，于25 ℃烘干，用3 mL甲醇溶解，在228 nm下測定樣品吸光度。用紫杉醇標準品繪制標準曲線：y=20.83x+1.06，r2=0.997。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用Excel進行數(shù)據(jù)整理，用Origin 8.5.1繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 細胞活力的變化

由圖1可知，在細胞培養(yǎng)8 d后，加入真菌誘導子后的細胞活力下降得較快，在后續(xù)培養(yǎng)中，細胞活力上升平緩，且始終低于初始細胞活力；而在真菌誘導結(jié)合果糖補料的條件下，細胞活力下降較為平緩，在培養(yǎng)的11 d后，細胞活力開始逐步上升，在培養(yǎng)的14 d后，細胞活力高于初始細胞活力，增幅為9.34%。

2.2 培養(yǎng)液pH值的變化

由圖2可知，在培養(yǎng)的8 d后，加入真菌誘導子后，培養(yǎng)液pH值降低。其中，只添加真菌誘導子的處理，pH值下降得更快，最大降幅為14.29%；加入真菌誘導子后進行果糖補料，pH值的下降較平緩。

2.3 胞外蛋白質(zhì)含量的變化

在培養(yǎng)的8 d后，只添加真菌誘導子，胞外蛋白質(zhì)含量呈上升趨勢，由誘導初期的11.98 μg/mL上升為培養(yǎng)后期的18.17 μg/mL，增幅為51.67%；在真菌誘導后進行果糖補料，胞外蛋白質(zhì)含量培養(yǎng)在過程中基本保持不變(圖3)。

2.4 胞外總酚含量的變化

由圖4可知，加入誘導子后，胞外總酚含量在培養(yǎng)的9 d后開始上升，在培養(yǎng)后的11 d含量到達峰值，為 17.92 μg/mL，隨后下降，最后趨于平穩(wěn)。添加真菌誘導和果糖補料后，胞外總酚含量上升，在培養(yǎng)后的10 d達到峰值，為 26.27 μg/mL，隨后下降，最后趨于平穩(wěn)。

2.5 多酚氧化酶活性的變化

加入誘導子后，PPO活性在培養(yǎng)后的9 d達到峰值，為62.50 U/g，隨后酶活性下降，在培養(yǎng)的13 d開始，酶活性趨于平穩(wěn)；真菌誘導和果糖補料后，酶活性同樣在9 d達到峰值，為106.17 U/g，隨后酶活性下降，在培養(yǎng)的10 d后酶活性趨于平穩(wěn)(圖5)。

2.6 紫杉醇含量(干質(zhì)量)

由表1可知，只加入誘導子時，紫杉醇含量首先逐漸下降，在培養(yǎng)10 d時為最低值，隨后含量逐漸升高，在培養(yǎng)的 12 d 達到峰值26.38 μg/g，與培養(yǎng)8 d的初始值相比，增幅為 24.85%，12 d后，紫杉醇含量逐漸下降。而在加入誘導子的同時加果糖補料，紫杉醇的含量首先逐步升高，在培養(yǎng)12 d時到達峰值，為20.40 μg/g，與初始值相比紫杉醇含量增幅為170.56%，從培養(yǎng)13 d開始時紫杉醇含量逐漸下降。

3 結(jié)論與討論

細胞活力與細胞線粒體活性成正比，線粒體活性越強，細胞代謝能力越強。在本試驗中，加入真菌誘導子后，細胞活力下降，可能是由于誘導子對細胞的損傷使得細胞活力下降，細胞活力維持較低水平不變，而添加果糖后，細胞活力在后期逐步上升，說明懸浮培養(yǎng)后期果糖作為合適碳源，有利于保持細胞活力，提高代謝能力[14]。

表1 紫杉醇含量(干質(zhì)量)

植物細胞對pH值具有較強的自我調(diào)控能力，而在本試驗中加入誘導子，培養(yǎng)基pH值持續(xù)下降，這有可能是由于誘導子使胞內(nèi)質(zhì)子大量釋放，從而導致培養(yǎng)基酸化；進行果糖補料后，可以減緩pH值的下降速率，這有可能是由于果糖可以減緩質(zhì)子釋放速率或者使質(zhì)子內(nèi)流而減緩pH值下降[15]。

用真菌誘導后，胞外蛋白含量逐漸升高，原因可能有2個方面：一方面可能因為細胞代謝增強，蛋白分泌增加，另一方面，可能是細胞膜通透性改變，其胞內(nèi)蛋白被釋放出來[16]。而細胞活力與代謝強度成正比，加入真菌誘導子后細胞活力持續(xù)下降，代謝強度較低，因此可見胞外蛋白含量上升不是由于分泌增加而是由細胞膜通透性改變引起的。細胞膜通透性改變可能是外源真菌誘導子處理的紅豆杉細胞在顯著提高紫杉醇產(chǎn)量的同時，也導致細胞中氧自由基含量的提高而發(fā)生細胞氧損傷，從而引起植物的過敏反應(yīng)[17]。而加入真菌誘導子后進行果糖補料，胞外蛋白含量基本保持不變，這有可能是由于果糖可以減弱這種過敏反應(yīng)。

誘導紅豆杉細胞時，維持適當濃度的酚類化合物有利于紫杉醇產(chǎn)量的提高[18]。所以當培養(yǎng)體系中加入真菌誘導子后，胞外總酚含量上升，可能是細胞感受到真菌誘導子侵入而增加酚類化合物的合成以減少傷害；加入真菌誘導子后進行果糖補料能使酚類物質(zhì)迅速積累，同時也能增加紫杉醇的含量。當酚類物質(zhì)含量過高時，細胞通過提高PPO活性來降解酚類物質(zhì)。

研究表明，在南方紅豆杉細胞培養(yǎng)后期添加果糖能夠解除細胞合成紫杉醇的碳源限制，從而有效地提高真菌誘導子的誘導效能[18]。Ketchum等研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)周期的中期添加1%果糖，可以提高紫杉醇產(chǎn)量，縮短培養(yǎng)周期[19-20]。在本試驗中，加入誘導子后，紫杉醇含量先下降后上升，上升到峰值后逐步下降，可能是誘導子在誘導初期對細胞的損傷而使紫杉醇合成受影響，細胞適應(yīng)后，誘導子誘導細胞合成紫杉醇而使其含量上升。加入誘導子后進行果糖補料，紫杉醇含量上升沒有受到誘導子的損傷而下降，可進一步說明果糖可以減弱誘導子對細胞的損傷或者可能是果糖在培養(yǎng)后期更適合用于合成紫杉醇。

因此可見，在用真菌誘導子誘導紅豆杉細胞時，加入一定量的果糖可以緩解真菌誘導子誘導所引起的紅豆杉細胞膜脂過氧化等不良反應(yīng)，從而有利于細胞的生長和紫杉醇產(chǎn)量的提高。