郭艷娥， 李應德， 高 萍， 汪治剛， 段廷玉*

(1. 蘭州大學草地農(nóng)業(yè)科技學院， 甘肅 蘭州 730020； 2. 蘭州新區(qū)市政投資管理集團有限公司， 甘肅 蘭州新區(qū) 730300)

磷(P)作為植物生長發(fā)育的三大必需營養(yǎng)元素之一，占植物細胞干重的0.2%[1]，是植物代謝過程必不可少的物質(zhì)[2]。我國耕地土壤中有1/3～1/2缺P，且許多土壤中，有效磷質(zhì)量分數(shù)低于10 mg·kg-1，極大地限制了植物生長[3]，因此改善P的吸收對促進植物生長和維持生態(tài)系統(tǒng)生產(chǎn)力具有重要意義。

叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi,AMF)是一類重要的植物根際促生菌，能與80%以上維管植物根系建立共生關系并形成AM菌根[4]。AMF促進植物生長的效應與菌根侵染改善宿主植物對P的吸收密切相關[5-6]，這種作用在供P不足土壤環(huán)境中更為顯著。菌根化植物對土壤中P元素的攝取包括直接吸收(direct uptake pathway,DUP)與菌根吸收(mycorrhizal uptake pathway,MUP)[7]兩條途徑。細胞學、生理學以及分子生物學試驗證實，共生體之間P元素的轉(zhuǎn)運發(fā)生在真菌叢枝結(jié)構和宿主皮層細胞之間。AMF借助真菌細胞膜上的磷轉(zhuǎn)運蛋白進行跨膜運輸，將土壤中含有的無機態(tài)磷酸鹽轉(zhuǎn)運到菌根外延菌絲中，在植物與真菌的共生界面又依靠對AM具有特異性的植物磷轉(zhuǎn)運蛋白，將質(zhì)外體空間中呈游離狀存在的磷酸鹽轉(zhuǎn)移到皮層細胞[8]。AMF的菌絲無橫隔，運輸阻力小，其根外菌絲的吸P效率是根系的6倍，轉(zhuǎn)移效率是根系的10倍[9]。

禾草內(nèi)生真菌對宿主生長的介導效應也與P的有效性密切相關[10]。缺P時，接種內(nèi)生真菌能促進宿主植物生長。與非感染植株(E-)相比，內(nèi)生真菌感染(E+)的高羊茅(Festucaarundinacea)根系直徑減小，根毛長度增加，進而擴大了根系吸收面積[11]。此外，E+高羊茅還通過根部分泌酚類化合物對P脅迫作出響應[12]。目前，國際上銷售的多年生黑麥草(Loliumperenne)種子多含有內(nèi)生真菌。

在自然界和農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中，禾草能分別與AMF和內(nèi)生真菌建立共生關系[13]，且有大量關于宿主植物與單一共生菌互作的報道，但二者共同作用對植物生長影響的研究還甚少，不同P水平下兩種微生物共同作用對宿主的影響更是鮮有報道。關于禾草內(nèi)生真菌與AMF的關系，有學者認為二者相互競爭，互相制約[14-16]。如感染內(nèi)生真菌的高羊茅(Festucaarundinacea)、一年生(L.multiflorum)和多年生黑麥草(L.perenne)根系的菌根侵染率降低[14]，禾草內(nèi)生真菌的存在不同程度抑制了AMF的侵染，同樣AMF侵染能夠降低禾草內(nèi)生真菌的菌絲密度和宿主植物葉片的生物堿含量[15-16]。然而，Novas等[17]的研究認為，禾草內(nèi)生真菌可以增加AMF的侵染率，且在一定浸提液濃度內(nèi)，AMF的菌絲長度增加。Liu等[18]的報道指出，AMF與禾草內(nèi)生真菌的互作可能與供試基質(zhì)的養(yǎng)分狀況、內(nèi)生真菌菌株類型以及AMF種類等諸因素相關。接種近明球囊霉(Glomusclaroideum)的E-植株侵染率高于E+，而接種摩西球囊霉(G.mosseae)的E+植株侵染率顯著高于E-[19]。

以往的研究多是基于AMF和禾草內(nèi)生真菌的關系，所得結(jié)論也并不一致[20]。本研究以多年生黑麥草(L.perenne)為供試對象，旨在探究不同P水平下AMF與禾草內(nèi)生真菌對其生長、養(yǎng)分吸收、光合特性及磷酸酶活性的影響，以期為高效利用共生微生物，促進牧草生長提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1供試植物 多年生黑麥草種子AR1帶有內(nèi)生真菌(E+)、Nil不帶內(nèi)生真菌(E-)，由新西蘭國家草地研究所(AgResearch)、新西蘭皇家科學院院士John Caradus教授提供。

1.1.2叢枝菌根真菌 幼套球囊霉(Claroideoglomusetunicatum)，購買于北京市農(nóng)林科學院植物營養(yǎng)與資源研究所，“叢枝菌根真菌種質(zhì)資源庫BGC”編號為NM01B，以三葉草種子(克朗德)盆栽擴繁所得的孢子、菌根根段、根外菌絲及培養(yǎng)基質(zhì)作為接種物。

1.2 試驗方法

1.2.1試驗設計 盆栽試驗于2016年9月—11月在蘭州大學草地農(nóng)業(yè)科技學院智能溫室中進行，共設4個P水平，分別為0(P0)、10 mg·kg-1(P10)、20 mg·kg-1(P20)和30 mg·kg-1(P30)。試驗將50 g·pot-1AMF接種物平鋪在500 g滅菌的蛭石上面，然后再覆蓋150 g蛭石，對照(AMF-)則加等量滅菌接種物和接種物濾液，以保證微生物區(qū)系一致[21]。挑選大小一致且籽粒飽滿的種子，用10% H2O2對其表面消毒10 min，然后用無菌水沖洗干凈，于25℃恒溫培養(yǎng)箱催芽[21]。48 h后，選取長勢基本一致，大小相近的帶菌(E+)和不帶菌(E-)黑麥草植株分別移栽至直徑18 cm、高19 cm的花盆中，每盆移栽5株，出苗1周后，定苗至3株。定苗后，加入極易被植物吸收利用的0.1 mol·L-1KH2PO4溶液，建立不同P水平處理，P0則加入等量蒸餾水。試驗過程中根據(jù)不同生長期植物所需，按其飽和含水量的50%～75%稱重澆水。共設16個處理，每個處理6個重復。生長8周后收獲并測定植物生長及生理生化指標。

1.2.2測定方法 生物量采用烘干法測定；AMF侵染率的測定采用染色鏡檢法：取0.2 g左右沖洗干凈的黑麥草根系，裝入15 ml離心管，于10 ml 10%的KOH溶液中沸水浴常壓處理30 min，觀察根系表皮顏色是否已消除，如顏色已去除，棄去KOH，用蒸餾水沖洗干凈，置于2%的HCl中酸化30 min，棄去HCl并進行沖洗，然后用0.05%的Trypan-Blue(曲利苯藍)染液(w/v，溶劑為乳酸︰甘油︰水=1︰1︰1的混合液)，80℃水浴染色20 min，待染色結(jié)束后，棄去染液，用蒸餾水沖洗干凈，置于50%脫色液中(v/v，甘油︰水=1︰1) 脫色保存，最后用“十字交叉法”測定各處理的AMF侵染率[22-23]；全N、全P含量：用球磨儀研磨植物干樣，并過2 mm篩，稱取0.25 g左右研磨好的植物樣，加入3.3 g催化劑(K2SO4和CuSO4研磨后10∶1混合)和10 ml濃H2SO4，420℃消煮2 h，冷卻后定容至100 ml，采用流動注射儀(FIAstar 5000 Analyzer,FOSS,Sweden)測定；采用Li-6400便攜式光合儀測定葉片光合特性，每盆取5個值，測定參數(shù)包括凈光合速率、蒸騰速率和氣孔導度。葉片與根系磷酸酶活性的測定參照Sadasivam和Manickam的方法[24]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)錄入Microsoft Excel 2007進行整理，采用JMP IN 4(SAS Institute Inc.,SAS Campus Drive,Cary,NC27513,USA)對各指標進行交互效應及方差分析，結(jié)果用GraphPad Prism 5.01(GraphPad Software Inc.,San Diego CA)作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物生物量

結(jié)果顯示：不同P水平下，對照AMF-E-的地上生物量無顯著差異(P>0.05)(表1)。AMF與禾草內(nèi)生真菌單獨作用降低了多年生黑麥草的地上生物量，僅P30水平下AMF-E+處理較AMF-E-增加1.95%，P20水平下AMF+E-的地上生物量比P0、P10和P30分別高19.29%，31%和3.17%(表1)。AMF與禾草內(nèi)生真菌互作時存在交互效應(表2)，AMF+E+不同P水平下的地上生物量比AMF-E+分別低14%，1.45%、9.45%和17.74%，P0和P10水平下比AMF+E-分別高3.58%和21.16%，P20和P30水平下比AMF+E-分別低6.85%和3.97%(表1)。

表1 不同處理下多年生黑麥草的生物量Table 1 Biomass of perennial ryegrass under different treatments

注：AMF-E-：未接種對照；AMF-E+：含禾草內(nèi)生真菌處理；AMF+E-：接種AMF處理；AMF+E+：同時接種AMF和禾草內(nèi)生真菌處理。圖中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標準誤。不同小寫字母表示不同處理間經(jīng)LSD法檢驗差異顯著(P<0.05)，下同

Note:AMF-E-means control treatment;AMF-E+means grass endophyte treatment;AMF+E-means AMF treatment;AMF+E+means inoculated with AMF and grass endophyte. Data are mean±SE. Different lowercase letters indicate significant differences across treatments at the 0.05 level by LSD test,the same as bellow

P對地下生物量和總生物量的影響一致，P20水平下最高(表1)。不同P水平下，AMF+E-處理的地下生物量和總生物量趨勢一致，先降低后增加，但各水平間的差異均不顯著(P>0.05)(表1)。AMF-E+地下生物量和總生物量隨P水平增加而增加，與AMF互作時，先增加后降低，三者間存在交互作用(表1，表2)。

表2 不同P水平下叢枝菌根真菌與禾草內(nèi)生真菌對多年生黑麥草各指標的方差分析(P值)Table 2 Variance analyses of E- and E+ perennial ryegrass inoculated with or without AMF under differentphosphorus levels (P Value)

注：MxP：AMF與P水平間的交互作用；MxE：AMF與禾草內(nèi)生真菌間的交互作用；ExP：禾草內(nèi)生真菌與P水平間的交互作用；MxExP：AMF、禾草內(nèi)生真菌與P水平三者間的交互作用

Note:MxP means interaction between AMF and phosphorus level;MxE means interaction between AMF and grass endophyte;ExP means interaction between grass endophyte and phosphorus level;MxExP means interaction among AMF,grass endophyte and phosphorus level

2.2 AMF侵染率

未接種AMF的黑麥草根系均未檢測到菌根結(jié)構。P水平對AMF侵染率產(chǎn)生顯著影響(P<0.05)，AMF+E-處理P10比P0、P20和P30分別高5.56%，11.48%和14.86%。禾草內(nèi)生真菌對AMF侵染率產(chǎn)生極顯著影響(P<0.01)，且二者間存在交互效應(表2)，P0、P10、P20和P30水平下AMF+E+的侵染率比AMF+E-分別低16.54%，20.03%,15.85%和15.95%，禾草內(nèi)生真菌抑制了AMF的侵染(圖1)。

2.3 植物全P含量

多年生黑麥草地上全P含量隨P水平增加先增加后降低(表3)。AMF顯著降低了植株的地上全P含量(P<0.05)，并與P水平間存在交互作用(表2)，P10水平下AMF+E-的地上全P含量比P0、P20和P30分別低11.02%，26.33%和13.56%(表3)。禾草內(nèi)生真菌對多年生黑麥草地上、根系和總P含量均未產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)，僅P30水平下AMF-E+處理的P含量高于AMF-E-(表3)。禾草內(nèi)生真菌、AMF與P水平三者間存在交互效應(表2)，P0和P30水平下AMF+E+的地上全P含量高于AMF-E+和AMF+E-處理，P10和P20水平反之(表3)。

圖1 不同處理下多年生黑麥草的AMF侵染率Fig.1 AM colonization of perennial ryegrass underdifferent treatments注：不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)，下同Note：Different lowercase letters on the bars indicate significant differences across treatments at the 0.05 level,the same as bellow

AMF對根系全P含量產(chǎn)生極顯著影響(P<0.01)，但與P水平間無交互作用(表2)，其與禾草內(nèi)生真菌互作時隨P水平增加，根系全P含量低于AMF+E-或AMF-E+，AMF+E+處理P10比P0、P20和P30的根系全P含量分別高15.58%，17.07%和34.25%。禾草內(nèi)生真菌與P水平間存在交互效應(表2)，P20比P0、P10和P30的根系全P含量分別高46.06%，15.25%和1.21%。對總P含量的影響與根系全P含量一致(表2，表3)。

2.4 植物光合特性

P水平對多年生黑麥草的光合特性產(chǎn)生極顯著影響(P<0.01)(表2)。AMF增加了植物的光合特性，并與P水平存在交互效應(表2)，P30水平下的凈光合速率比P0、P10和P20分別高28.38%，23.27%和10.11%，蒸騰速率高86.96%，26.47%和377.78%，氣孔導度高93.55%，21.21%和126.42%(圖2)。禾草內(nèi)生真菌對凈光合速率、蒸騰速率和氣孔導度的影響，隨P水平變化趨勢一致，表現(xiàn)為先降低后增加(圖2)。AMF與禾草內(nèi)生真菌共同作用時，凈光合速率、蒸騰速率和氣孔導度高于或介于AMF-E+和AMF+E-之間，且隨P水平增加而降低(表2，圖2)。

表3 不同處理下多年生黑麥草的全P含量Table 3 Total P content of perennial ryegrass under different treatments

圖2 不同處理下多年生黑麥草的光合特性Fig.2 Photosynthetic characteristics of perennial ryegrass under different treatments

2.5 磷酸酶活性

P水平對葉片酸性磷酸酶(Acid phosphatase,ACP)和堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)的活性產(chǎn)生顯著影響(P<0.05)。AMF降低了葉片ACP活性，并與P水平間存在交互效應，P10比P0、P20和P30的葉片ACP活性分別低10.54%，9.97%和14.67%，AMF+E-處理P20水平的ALP活性比P0、P10和P30分別高17.00%，16.91%和18.84%(表2，圖3)。隨P水平增加，禾草內(nèi)生真菌對葉片ACP和ALP活性的影響一致，但活性最高所對應P水平異同，P10水平ACP活性比P0、P20和P30分別高29.17%，57.12%和24.41%，ALP活性P30比P0、P10和P20分別高25.09%，9.53%和39.76%(圖3)。AMF、禾草內(nèi)生真菌與P對葉片磷酸酶活性的影響存在交互效應(表2)，不同P水平下AMF+E+處理的葉片磷酸酶活性低于或介于AMF-E+和AMF+E-之間(圖3)。

圖3 不同處理下多年生黑麥草的葉片磷酸酶活性Fig.3 Leaf phosphatase activities of perennial ryegrass under different treatments

P對黑麥草根系ACP活性的影響較ALP顯著(P<0.05)(表2)。AMF對根系ACP活性無顯著影響(P>0.05)，但增加了ALP活性，并與P水平間具有交互效應，根系ACP和ALP活性分別以P20和P30最高(表2，圖4)。禾草內(nèi)生真菌P20水平的ACP活性比P0、P10和P30分別高11.09%,43.42%和183.56%，ALP活性P10比P0、P20和P30分別高21.74%、23.16%和93.46%(圖4)。AMF、禾草內(nèi)生真菌與P水平三者間存在交互效應，AMF+E+處理P10水平的根系ACP和ALP活性低于AMF-E+和AMF+E-，P30水平反之(表2，圖4)。

圖4 不同處理下多年生黑麥草的根系磷酸酶活性Fig.4 Root phosphatase activities of perennial ryegrass under different treatments

3 討論

AMF能顯著改善宿主植物對養(yǎng)分的吸收[5-6]。Smith等[8]的研究表明，蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)中的P大多通過MUP途徑獲得。Li等[25]通過盆栽試驗證明小麥(Triticumaestivuml)80%的P吸收也是通過MUP途徑。本研究中接種AMF對地上和根系全P含量產(chǎn)生顯著影響，但不同P水平下AMF+E-的總P含量皆低于AMF-E-，原因可能與基質(zhì)的養(yǎng)分狀況密切相關。在以蛭石為供試基質(zhì)的研究中，AMF并未通過P的遷移轉(zhuǎn)化來提高植物的P含量，自身還需依賴宿主獲取生存所需養(yǎng)分[26]。此外，當基質(zhì)的養(yǎng)分供應滿足植物生長所需時，MUP途徑吸收的養(yǎng)分更多地被貯存在菌絲中[25]，其協(xié)助宿主吸收的養(yǎng)分并未對植物生長產(chǎn)生積極影響，甚至導致植物養(yǎng)分含量的降低[27]。對生物量的影響與全P含量一致。

低P條件下E+植株的生長速率更快，根部累積的P元素也更多[28]。本研究中AMF-E+處理植株的生物量和組織含P量隨P供給水平的增加而增加，但僅P30水平下高于AMF-E-。原因可能是試驗過程中添加的P累積達一定水平，抑制了禾草內(nèi)生真菌的作用，但這種抑制效應可通過P水平增加得到補償或抵消，因而P30水平下表現(xiàn)出的生長優(yōu)勢是P含量增加的結(jié)果，而非禾草內(nèi)生真菌的直接作用。禾草內(nèi)生真菌與AMF互作時，生物量降低，植物在資源分配上存在權衡，AMF與禾草內(nèi)生真菌均需從宿主植物獲得光合產(chǎn)物，二者相互競爭，互相制約[29-30]。

低P水平能夠誘導根系分泌更多ACP，增加非菌根化根系的ACP活性[31]。針對植物體內(nèi)ACP與P效率的關系，一些學者認為P效率高的植物體內(nèi)ACP活性較高，表征P元素的再利用能力較強[32]。但也有研究表明ACP是植物在低P脅迫下的被動適應性反應，受脅迫程度高則相應體內(nèi)ACP活性較高[33]。如Nanamori等[34]對牧草和水稻(Oryzasativa)的研究表明，葉片ACP能夠被低P脅迫誘導且與P利用效率顯著相關，這與本研究葉片ACP活性的變化相似。然而，Yan等[35]發(fā)現(xiàn)低P條件下不同植物葉片的ACP活性與含P狀況并無顯著相關性，葉片ACP活性與植物體內(nèi)P的凈活化也無顯著相關性。原因可能是ACP活性易受供試植物種類、P處理時間或測定條件等的影響，其復雜性導致不同研究者可能得出相互矛盾的結(jié)果[36]。因植物只分泌ACP，故ALP活性的增加主要歸功于AMF[37]。

AMF的根外菌絲在細胞內(nèi)外都可產(chǎn)生磷酸酶，細胞外的磷酸酶可增強宿主植物獲取P的能力[38]。因此，AMF侵染植物后可以刺激磷酸酶的分泌以及活性的增強，進而改善P營養(yǎng)[39]。Hegeman和Grabau[40]在擬南芥(Arabidopsisthaliana)、番茄(Solanumlycopersicum)等草本植物上分離、鑒定了一些酸性磷酸酶基因，這些基因在低P脅迫下被誘導表達，從而增強磷酸酶的活性[41]。然而，到目前為止，尚缺乏直接證據(jù)證實AMF能夠調(diào)控磷酸酶基因的表達。本試驗不同P水平下接種AMF并未顯著增加葉片和根系ACP活性，但以P20和P30而非低P誘導下的磷酸酶活性最高，這與全P含量的結(jié)果一致，AMF是否通過直接影響植物P營養(yǎng)的吸收促進宿主生長來間接調(diào)控磷酸酶的活性，其中的生理生化及其分子機制有待進一步研究。

Sánchez-Blanco等[42]發(fā)現(xiàn)AMF增加了迷迭香(Rosmarinusofficinalis)葉片的凈光合速率和氣孔導度。Wang和鄭舜怡等的研究也證實AMF能顯著提高生姜(Zingiberofficinace)和辣椒(Capsicumannuum)植株葉片的凈光合速率、蒸騰速率和氣孔導度[43-44]，這與本試驗的結(jié)果相似。菌根結(jié)構的形成擴大了根系的吸收面積，調(diào)節(jié)氣孔開關，使之利于菌根植物的氣體交換，并加強了水分與養(yǎng)分的吸收運輸，從而加強了光合作用[45]。但因AMF的生長、繁殖需依賴于宿主植物提供的碳水化合物，減少了宿主植物光合產(chǎn)物的積累。加之AMF對宿主生長的影響，使得菌根植物的凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導度等光合特性較非菌根植物復雜，具體機理還有待開展進一步的研究。

隨P濃度增加，AMF侵染率先增加后降低，不同供P水平能夠促進或抑制AMF的侵染及菌根的形成[46-47]，含P量低時菌根的有益效應更顯著[48]。P10水平AMF+E-的侵染率較其它濃度高5.56%～14.86%，馮海燕、Chen等[49-50]的研究認為低P條件下AMF侵染率高，高P則抑制菌根的生長和代謝，這與本文的結(jié)果一致。禾草內(nèi)生真菌的存在不同程度抑制了AMF的侵染，降低多年生黑麥草根系的菌根侵染率[15-16]。本研究不同P水平下E-植株的侵染率比E+植株高15.85%～20.03%，原因可能是禾草內(nèi)生真菌通過種子優(yōu)先進行垂直傳播[51]，而AMF只能以侵染植物根系的方式進入宿主，所需侵染時間更長[30]。存在于禾草地上部分的內(nèi)生真菌較AMF具有空間優(yōu)勢，可優(yōu)先獲得光合碳水化合物，留給可供AMF消耗的光合產(chǎn)物減少，抑制AMF的侵染[52]。此外，禾草內(nèi)生真菌能夠增加植物根系表面積，改變根系形態(tài)和構型[53]，加強宿主植物對P的吸收和貯存[54]，AMF有益作用降低[55]，從而間接影響其侵染。

4 結(jié)論

隨P水平增加，多年生黑麥草的生物量和養(yǎng)分含量先增加后降低，P20最高。供P水平對AMF與禾草內(nèi)生真菌的效應及互作關系產(chǎn)生重要影響，P10水平下AMF侵染率最高，E+植株在P10～P20水平下生長速率更快，根部累積的P元素也更多，利于植物生長。禾草內(nèi)生真菌與AMF間存在交互效應，抑制其侵染。